基于大鼠在體腸灌流模型研究白及有效部位在腸道的可吸收及代謝成分

陳 浩，王昌權(quán)，夏 濤，李月婷，王永林，黃 勇，李勇軍，鄭 林*

1貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心；3 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550004

白及為蘭科植物白及Bletillastriata(Thunb.) Reichb.F.的干燥塊莖，別名苞舌蘭、連及草、白根等，是《中國藥典》收載的常用藥材，其味苦、甘、澀、微寒，歸肺、肝、胃經(jīng)，具有收斂止血、消腫生肌的功能。常用于治療皮膚皸裂、燙灼傷、癰瘡及各種出血性疾病[1,2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，白及作為一種傳統(tǒng)的中藥材，藥用價值高，用藥廣泛，具有抗病原微生物、止血活血、抗腫瘤、促進(jìn)創(chuàng)面愈合、抗胃潰瘍、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[3]。但白及研究主要涉及白及的種植加工、成分提取分離與性質(zhì)研究、抗氧化活性、藥理活性以及藥理作用和臨床應(yīng)用等[4]。而其在體內(nèi)發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)一直未能明確[5]，導(dǎo)致其產(chǎn)品工藝和質(zhì)量控制水平低，使其在產(chǎn)品開發(fā)和臨床應(yīng)用受到一定的局限性。經(jīng)高分辨質(zhì)譜分析指認(rèn)發(fā)現(xiàn)，其有效部位主要成分為1，4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯(militarine)、4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯(gymnoside I)、α-異丁基蘋果酸(α-isobutylmalic acid)、 4-(葡糖糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基芐酯(blestroside)、 二氫菲5 (dihydrophenanthrene 5)、 二氫菲1 (dihydrophenanthrene 1)、 1，4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯-2-[4-O-肉桂?；?6-O-乙酰基]葡萄糖苷(gymnoside Ⅸ)[6,7]。傳統(tǒng)中藥主要是經(jīng)口服給藥，而腸道是口服藥物在體內(nèi)代謝的重要場所，雖然某些中藥在血漿中的原形成分和生物利用度不高，但卻有很好的療效，究其原因可能為其代謝物發(fā)揮了療效[8,9]。因此，通過對白及在腸道的代謝研究，可以明確其進(jìn)入體內(nèi)的成分和存在形式，進(jìn)而闡明白及的代謝途徑和推測其機(jī)制，進(jìn)一步的明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，但有關(guān)白及在腸道的吸收和代謝的文獻(xiàn)鮮有報道。腸道是藥物的吸收的主要器官，同時還具有代謝藥物的功能。其上皮細(xì)胞中不僅存在大量影響藥物吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)體，還含有多種與肝臟中相同的代謝酶[10]。而在體腸灌流模型不僅是研究藥物吸收的簡單可行的研究方法，更能夠應(yīng)用于藥物腸道代謝特征的研究，相較于各種體外代謝研究方法，更接近于正常生理條件，其結(jié)果更加直觀、可靠[11,12]。因此，該研究采用大鼠在體腸灌流模型研究白及有效部位在大鼠循環(huán)腸灌流液中可吸收成分及其代謝產(chǎn)物，對其在腸道中可能的吸收成分和代謝物進(jìn)行初步研究，以期為闡釋白及藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UPLC-Q-TOF/MS (Xevo G2-XS 美國沃特世公司，電噴霧四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀、MassLynx V4.1質(zhì)譜工作站，UNIFI數(shù)據(jù)庫)，KQ-300DE數(shù)控超聲波清洗器(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)，NA-5L氮空一體機(jī)(北京中興匯利科技發(fā)展有限公司)，EL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，GILSON移液器(丹麥凱博)，DK-98-IIA恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；HL-2S蠕動泵(上海青浦滬西儀器廠)。

1.2 材料

氯化鈉(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，批號 160110)；磷酸二氫鈉(天津市復(fù)興科技發(fā)展有限公司，批號 151110)；無水氯化鈣(西隴科學(xué)股份有限公司，批號 1705222)；葡萄糖(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號 20150910)；碳酸氫鈉(西隴化工股份有限公司，批號 151106)；氯化鎂(汕頭市西隴化工股份有限公司，批號 151209)；氯化鉀(汕頭市西隴化工股份有限公司，批號 151103)；乙腈為色譜純(德國Merck 公司)、甲酸為色譜純、水為純凈水、其他試劑均為分析純。葛根素對照品(批號：110752-201615，含量95.4%)購自中國食品藥品檢定研究院，1，4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯(militarine)對照品(批號：PS180413-03，含量≥98%)購自成都普思生物科技股份有限公司；天麻素(Gastrodin) 對照品(批號：110807-201608，含量97.6%)購自中國食品藥品檢定研究院；4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯(gymnoside I)； α-異丁基蘋果酸酯(α-isobutylmalic acid)； 4-(葡糖糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基芐酯(blestroside)；二氫菲5 (dihydrophenanthrene 5)；二氫菲1 (dihydrophenanthrene 1)；1，4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯-2-[4-O-肉桂?；?6-O-乙?；鵠葡萄糖苷(gymnoside Ⅸ)對照品均為實(shí)驗(yàn)室自制(采用1NMR、13MR、MS、UV、IR波普進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，用UPLC-PDA在多個檢測波長下測定，其峰面積歸一化均大于98)。

1.3 動物

健康SD大鼠，雌雄兼用，體重為250±20 g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK (渝)2015-0001。

飼養(yǎng)條件：大鼠引進(jìn)到實(shí)驗(yàn)室后，按每個飼養(yǎng)籠分裝8只，雌鼠與雄鼠分開飼養(yǎng)，動物房內(nèi)光照充足，空調(diào)和通風(fēng)設(shè)備系統(tǒng)良好，溫度控制在18～25 ℃，相對濕度在50%～60%。實(shí)驗(yàn)室定期對動物房進(jìn)行消毒和消毒，大鼠在動物房飼養(yǎng)1周，待適應(yīng)動物房環(huán)境之后再用于動物實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取Militarine、gymnoside I、α-isobutylmalic acid、blestroside、dihydrophenanthrene 5、dihydrophenanthrene 1、gymnoside Ⅸ對照品適量，加甲醇溶解，搖勻，獲得各對照品的儲備液。用甲醇將各對照品的儲備液稀釋成所需濃度，得混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。UPLC-Q-TOF/MS進(jìn)樣分析。

2.1.2 Krebs-Ringer’s(K-R)營養(yǎng)液的配制[13]

精密稱取 CaCl20.37 g，葡萄糖 1.40 g，分別加少量蒸餾水使溶解，再稱取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g、MgCl20.02 g，加蒸餾水溶解后與溶解的 CaCl2及葡萄糖混勻，蒸餾水定容至1 L。

2.1.3 白及有效部位供試液的制備的制備

參照文獻(xiàn)方法[14]，稱取白及藥材用適量，用4倍量95%乙醇溶液回流提取3次，2 h/次，濾過，合并濾液，濃縮至浸膏，浸膏用水溶解后上D101大孔吸附樹脂柱色譜，水洗脫后，用80%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，殘留物微波真空干燥，得白及有效部位，備用。稱取白及提取物1 g，用15 mL無水乙醇溶解，取1 mL逐滴加入到5 mL 10%吐溫80水溶液中，混勻后用K-R營養(yǎng)液稀釋定容至100 mL，超聲10 min，5 000 rpm離心10 min，取上清液，得666 μg/mL的供試液。取1 μL UPLC-Q-TOF/MS進(jìn)樣分析。

2.2 色譜條件

保護(hù)柱為Waters VanGuard BEH C18(2.1 mm×5 mm,1.7 1.7 μm)；色譜柱是Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)柱；流動相0.01%甲酸水溶液(A)-0.01%甲酸乙腈(B)進(jìn)行梯度洗脫(0～2 min，5%B；2～5 min，5%～15%B；5～8 min，15%～15%B；8～10 min，15%～45% B；10～14 min，45%～95%B；14～15 min，95%～5%B)流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積為1 μL。

2.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；掃描方式為負(fù)離子掃描(ESI-，m/z50～1 200)；毛細(xì)管電壓1.5 kV；離子源溫度 100 ℃；錐孔電壓 30 V；脫溶劑氣溫度 300 ℃；錐孔氣流量50 L/h；碰撞能量20～30 V；脫溶劑氣流量 10 L/min；數(shù)據(jù)采集模式：MSEContinuum；甲酸鈉校正；校正模式：sensitivity；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為：Masslynx V4.1工作站。掃描方式為MS Centroid 模式。

2.4 白及有效部位在大鼠循環(huán)腸灌流試驗(yàn)中灌流液、血清和膽汁的收集[15,16]

取健康SD大鼠，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h(不禁水)，30 %烏拉坦(1.4 g/kg)麻醉大鼠，仰臥固定。實(shí)驗(yàn)分為兩組：空白組和給藥組。將給藥組大鼠，固定于37 ℃恒溫手術(shù)臺，剃去大鼠腹部的毛，然后沿大鼠的腹部中線打開腹腔，開口大概3～4 cm，結(jié)扎總膽管；然后從大鼠胃后順延找到幽門底部的十二指腸，在十二指腸前端剪一個小口并插入硅膠管，扎緊；然后通過盲腸找到回腸底端，在回腸底端同樣剪一個小口并插入硅膠管，扎緊。使其與恒流泵形成一個回路。在灌流前，先將恒流泵調(diào)至1.0 mL/min 的流速并用37 ℃的生理鹽水沖洗腸道，沖至腸道無內(nèi)容物為止，然后排空腸道內(nèi)的水分。取37 ℃白及有效部位溶液60 mL，以5.0 mL/min 的流速循環(huán)平衡15 min后，此時記為0時。調(diào)節(jié)流速，再以2.5 mL/min的速度繼續(xù)循環(huán)，收集3 h時白及有效部位循環(huán)腸灌流液；與此同時，實(shí)施膽管插管手術(shù)，開腹，找到膽管，于膽管切口，選用內(nèi)徑小的硅橡膠(1.5 mm)插入膽管，收集3 h含藥膽汁；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即實(shí)施腹主動脈取血，于37 ℃水浴孵育后，收集含藥血清?？瞻捉M大鼠按照給藥組方法進(jìn)行空白膽汁、空白循環(huán)腸灌流液、空白血清。以上樣品均放置-20 ℃保存，備用。

2.5 樣品處理方案

2.5.1 血清樣品處理方法

取大鼠血清1 mL，置于5 mL進(jìn)口塑料離心管中，補(bǔ)加4 mL甲醇，渦混震蕩2 min后，超聲5 min，15 000 rpm離心10 min，取上清液于37 ℃ 氮?dú)獯蹈?，加入1 mL甲醇于吹干的樣品中，按上述處理方法加入1 mL甲醇二次沉淀蛋白，加入200 μL 50%甲醇水溶液溶解殘留物，渦混震蕩2 min后，超聲5 min，15 000 rpm離心10 min，取上清液UPLC-Q-TOF/MS進(jìn)樣分析。

2.5.2 膽汁樣品處理方法

取大鼠膽汁1 mL，加入1 mL 1%甲酸水，然后加入2 mL乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液于37 ℃氮?dú)獯蹈?，加?00 μL 50%甲醇水溶液溶解殘留物，渦混震蕩2 min后，超聲5 min，15 000 rpm離心10 min ，取上清液UPLC-Q-TOF/MS進(jìn)樣分析。

2.5.3 灌流液樣品處理方法

取腸灌流循環(huán)液1 mL，加入1 mL 1%甲酸水，然后加入2 mL乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液于37 ℃氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL 50%甲醇水溶液溶解殘留物，渦混震蕩2 min后，超聲5 min，15 000 rpm離心10 min ，取上清液UPLC-Q-TOF/MS進(jìn)樣分析。

3 結(jié)果與分析

運(yùn)用Masslynx V4.1軟件得到K-R液+藥液、空白血清、含藥血清及兩者差異圖譜；空白膽汁、含藥膽汁及兩者差異圖譜；空白灌流液、含藥灌流液及兩者差異圖譜。圖譜見圖1～圖3，主要代謝產(chǎn)物信息表見表1。各成分在ESI-模式下得到較好的響應(yīng)信號。

圖1 白及有效部位在大鼠血清中的代謝產(chǎn)物ESI-基峰圖Fig.1 Base peak chromatograms of active fraction from Bletilla striata metabolites in rats serum sample in negative mode注：(A) K-R液+藥液；(B) 空白血清；(C) 含藥血清；(D)含藥血清與空白血清差異圖譜；Y1：militarine；Y2：gymnoside I；Y3.α-isobutylmalic acid；M1.gastrodin脫糖后硫酸化的代謝產(chǎn)物；M2.dihydrophenanthrene 5葡萄糖醛酸化的代謝產(chǎn)物。Note:(A) K-R liquid + liquid medicine (B) blank serum;(C) serum with drug ;(D) different chromatograms of A and B ;Y1.militarine;Y2.gymnoside I;Y3.α-isobutylmalic acid;M1.Sulfated metabolites after gastrodin de-sugar;M2.Dihydrophenanthrene 5 glucuronidation metabolite.

圖2 白及有效部位在大鼠膽汁中的代謝產(chǎn)物ESI-基峰圖Fig.2 Base peak chromatograms of active fraction from Bletilla striata metabolites in rats bile sample in negative mode注：(A) 空白膽汁；(B) 含藥膽汁；(C) 含藥膽汁與空白膽汁差異圖譜；Y2.gymnoside I；Y3.α-isobutylmalic acid ； M1.gastrodin脫糖后硫酸化的代謝產(chǎn)物；M2.dihydrophenanthrene 5葡萄糖醛酸化的代謝產(chǎn)物。Note:(A) blank bile;(B) bile with drug;(C) different chromatograms of A and B;Y2.gymnoside I;Y3.α-isobutylmalic acid ;M1.Sulfated metabolites after gastrodin de-sugar;M2.Dihydrophenanthrene 5 glucuronidation metabolite.

圖3 白及有效部位在大鼠在體循環(huán)腸灌流液中的代謝產(chǎn)物ESI-基峰圖Fig.3 Base peak chromatograms of active fraction from Bletilla striatat metabolites in rats intestinal perfusion sample in negative mode注： (A) 空白循環(huán)腸灌流液;(B) 含藥循環(huán)腸灌流液;(C) 含藥循環(huán)腸灌流液與空白循環(huán)腸灌流液差異圖譜；M2.dihydrophenanthrene 5葡萄糖醛酸化的代謝產(chǎn)物。Note:(A) blank intestinal perfusion;(B) intestinal perfusion with drug;(C) different chromatograms of a and b;M2.ophenanthrene 5 glucuronidation metabolite.

表1 白及有效部位在大鼠循環(huán)腸灌流液、血清、膽汁中的代謝產(chǎn)物分析

注：S:血清,B:膽汁,I:腸灌流液。

Note:S:serum,B:bile,I:intestinal perfusate.

3.1 原型與代謝產(chǎn)物鑒定

3.1.1 原型產(chǎn)物鑒定

Y1：在10.06 min處存在m/z725.264 8 [M-H]-峰的化合物，顯示m/z457.174 0的主要碎片離子峰，由Single Mass Analysis預(yù)測的化學(xué)式分為C34H45O17，與militarine對照品相同，由此確定TR10.06 min的Y1為militarine。

Y2：在8.71 min處存在m/z457.171 0 [M-H]-峰的化合物，顯示m/z285.102 5的主要碎片離子峰，由Single Mass Analysis預(yù)測的化學(xué)式分為C21H29O11，與gymnoside I對照品相同，由此確定TR8.71 min的Y2為gymnoside I。

Y3：在4.26 min處存在m/z189.075 6 [M-H]-峰的化合物，顯示m/z129.055 6的主要碎片離子峰，由Single Mass Analysis預(yù)測的化學(xué)式分為C8H13O5，與α-isobutylmalic acid對照品相同，由此確定TR4.26 min的Y3為α-isobutylmalic acid。

3.1.2 代謝產(chǎn)物鑒定

M1：在0.62 min處存在m/z203.002 3 [M-H]-峰的化合物，顯示m/z123.042 0的主要碎片離子峰，由Single Mass Analysis預(yù)測的化學(xué)式分為C7H7O5S，推測M1為gastrodin脫糖后硫酸化的代謝產(chǎn)物。由于具體信息不夠全面，因此不能確定發(fā)生代謝和轉(zhuǎn)化的位點(diǎn)。

M2：在6.23 min處存在m/z417.117 4 [M-H]-峰的化合物，質(zhì)量數(shù)比dihydrophenanthrene 5多176，顯示m/z241.083 4的主要碎片離子峰，由Single Mass Analysis預(yù)測的化學(xué)式分為C21H21O9，推測M2為dihydrophenanthrene 5葡萄糖醛酸化的代謝產(chǎn)物。由于具體信息不夠全面，因此不能確定發(fā)生代謝和轉(zhuǎn)化的位點(diǎn)。

3.1.3 白及有效部位在大鼠循環(huán)腸灌流液、血清、膽汁中的代謝物生物轉(zhuǎn)化途徑

根據(jù)以上代謝產(chǎn)物的鑒定結(jié)果，白及有效部位在大鼠循環(huán)腸灌流液、血清、膽汁中的代謝產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化途徑見圖4。

4 討論

小腸不僅是藥物吸收的主要部位，同時小腸黏膜的上皮細(xì)胞也是藥物肝外代謝的主要部位之一，而小腸自身所表達(dá)的藥物代謝酶會影響到藥物的首關(guān)代謝和生物利用度，對口服藥物的毒性及療效有著潛在的影響[17]。研究藥物吸收和代謝特性的模型有體內(nèi)、在體和體外3種，但體內(nèi)和體外的的操作方法均較為繁瑣，實(shí)驗(yàn)要求高，難以達(dá)到良好的效果[18]。故本實(shí)驗(yàn)采用在體循環(huán)腸灌流模型，研究白及有效部位在腸中可能吸收的成分及代謝產(chǎn)物。從圖譜中可以發(fā)現(xiàn)存在其他未檢識出的豐度較高的化學(xué)成分，但目前對白及醇提后的非多糖成分能夠確認(rèn)的成分較少。只能根據(jù)已鑒別確認(rèn)的化學(xué)成分來對其實(shí)驗(yàn)譜圖中的峰圖進(jìn)行鑒別。而對其它豐度較高的化學(xué)成分與目前已鑒別確認(rèn)的化學(xué)成分進(jìn)行對比分析后，還是無法對其進(jìn)行鑒別和歸屬，但是其未檢識出的豐度較高的化學(xué)成分有可能源自原型藥材、內(nèi)源性物質(zhì)、代謝物，具體是何種成分還有待繼續(xù)深入研究。

在腸道環(huán)境中代謝產(chǎn)物不僅僅是小腸黏膜的上皮細(xì)胞對藥物進(jìn)行代謝，同時排入腸道的膽汁也會對藥物進(jìn)行代謝。結(jié)果顯示，在膽汁中檢測到了代謝產(chǎn)物M1，而在腸灌流液中未檢測到M1，故推測代謝產(chǎn)物是由膽汁的影響或其經(jīng)過肝臟代謝排入膽汁中，進(jìn)而對血清進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)M1存在于血清中，這表明M1能夠吸收入血。通過單獨(dú)對腸灌流液和膽汁的檢測，推測產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的來源，而對血清進(jìn)行檢測，則為了推測在腸道中可吸收的成分，同時為研究白及有效成分在各個腸段中的吸收及代謝情況奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。目前有關(guān)白及有效部位的相關(guān)代謝文獻(xiàn)尚未見報道，因此本實(shí)驗(yàn)基于大鼠在體腸灌流模型收集大鼠循環(huán)腸灌流液、血清、膽汁全面的分析白及有效部位在腸道中的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在血清、膽汁中共檢測出3個原型產(chǎn)物，在腸灌流液、血清、膽汁2個代謝產(chǎn)物，其代謝物主要發(fā)生水解和葡萄糖醛酸化反應(yīng)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將為闡釋白及藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和進(jìn)一步的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖4 白及有效部位在大鼠在體循環(huán)腸灌流實(shí)驗(yàn)中可能的代謝途徑Fig.4 Possible metabolic pathway of Bletilla striata (Thunb.) Reichb.F.extract in human intestinal flora注：1.酯鍵水解；2.酯鍵水解部位脫糖后硫酸化 3.葡萄糖醛酸化；S.血清 B.膽汁 I.腸灌流液。Note:1.Ester bond hydrolysis;2.Esterification of the ester bond hydrolysis site after de-sugarization 3.Glucuronidation;S:Serum B:Bile I:intestinal perfusion.