制首烏醇提物及其主要成分大黃素對斑馬魚非酒精性脂肪肝的治療作用

余琳媛，全云云，龔莉虹，王 成，李蕓霞

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都611137

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征。近年來，隨著生活水平的提高，我國肥胖人群和代謝綜合征(Metabolism syndrome，MS)人數(shù)逐漸增多，NAFLD發(fā)病率也明顯升高。在接下來的數(shù)十年中，NAFLD可能超過乙型肝炎成為威脅我國公眾健康的新疾病[1]。目前，西醫(yī)缺乏治療NAFLD病的有效手段和藥物[2]。不少藥物研發(fā)者將目光轉(zhuǎn)向了祖國傳統(tǒng)的降脂中藥。

何首烏為蓼科植物何首烏(PolygonummultiflorumThunb)的干燥塊根，臨床應(yīng)用有生首烏和制首烏之別。何首烏經(jīng)傳統(tǒng)方法炮制后，可降低毒性，具有化濁降脂的功效，是一種傳統(tǒng)的降脂中藥。其提取物中主要含二苯乙烯苷、蒽醌類物質(zhì)，其中二苯乙烯苷類化合物可調(diào)節(jié)肝臟紊亂的脂代謝，蒽醌類化合物能結(jié)合膽固醇，抑制膽固醇肝內(nèi)沉積，從而有效治療脂肪肝[3]。在實(shí)驗(yàn)開展的前期，通過設(shè)置2 mg/mL的蛋黃粉加制首烏水提液組，并根據(jù)最低致死濃度8 mg/mL，以0.5 mg/mL為梯度濃度，進(jìn)行給藥，發(fā)現(xiàn)制首烏水提液對斑馬魚的肝臟脂質(zhì)沉積無減輕作用。同理，根據(jù)50%制首烏醇提液對斑馬魚的最低致死濃度4 mg/mL，以0.5 mg/mL的梯度濃度進(jìn)行給藥，發(fā)現(xiàn)1、1.5、2 mg/mL的濃度對肝臟沉積有治療作用。因此，采用HPLC法對制首烏水提液和醇提液進(jìn)行成分含量分析，二者在成分上有6個(gè)共同峰，分別為兒茶素、沒食子酸酯、二苯乙烯苷、大黃素苷、大黃素、大黃素甲醚，50%醇提液在6個(gè)成分的含量上均高于水提液，將這6種成分單獨(dú)對NAFLD斑馬魚給藥，發(fā)現(xiàn)除大黃素以外，其余5種成分均無治療作用。并且，大黃素在醇提液和水提液中是含量差別最大的成分，接近13倍，根據(jù)大黃素對斑馬魚的最低致死濃度2 μg/mL，以0.5 μg/mL的梯度濃度進(jìn)行給藥，發(fā)現(xiàn)1、0.5、0.25 μg/mL的濃度對肝臟沉積有治療作用。因此實(shí)驗(yàn)選取了2、1.5、1 mg/mL的制首烏醇提液和1、0.5、0.25 μg/mL的大黃素作為治療斑馬魚NAFLD的高、中、低濃度。本實(shí)驗(yàn)通過制首烏醇提物與其主要成分大黃素對非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型的影響，研究制首烏對非酒精性脂肪肝斑馬魚肝脂質(zhì)沉積的干預(yù)作用及存在治療作用的有效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥

禮順堂售制首烏，由成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥鑒定室裴瑾教授鑒定為蓼科植物何首烏(PolygonummultiflorumThunb)的干燥塊根；大黃素購于成都克洛瑪生物科技有限公司，批號為A0044。

1.2 動(dòng)物

野生型AB品系(wide-type AB strian)斑馬魚，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院斑馬魚實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)繁殖。實(shí)驗(yàn)用斑馬魚幼魚為雌雄母魚交配后所產(chǎn)的受精卵養(yǎng)至96 hpf(hours post fertilization)，挑選孵化出的健康個(gè)體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 試劑

蛋黃粉(源葉生物公司，批號為S30910)、斑馬魚幼魚飼料AP100(Zeigler)、飽和油紅O溶液(Solarbio)、二甲基亞砜(DMSO，分析純，Sigma公司)。乙醇、丙二醇、蘇木精、伊紅染液(華俊醫(yī)療器械公司)、TG測試盒(南京建成生物工程研究所，批號為A110-1)、TC測試盒(南京建成生物工程研究所，批號為A111-1)。

1.4 儀器

Sartorius 11D型電子分析托盤天平(德國Sartorius公司)、M165-FC體式顯微成像系統(tǒng)(德國Lei-ca公司)、Leica EG1150H包埋機(jī)(德國Lei-ca公司)、Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾(上海)儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 何首烏醇提物的提取

精密稱取制首烏粗粉0.25 g，置圓底燒瓶中，加20倍量50%乙醇，浸泡30 min后，加熱回流60 min，過濾后離心，取濾液45 ℃旋蒸至無乙醇味，再取續(xù)濾液給藥。

2.2 分組及給藥方案

取若干條5 dpf(days post fertilization)的斑馬魚幼魚，隨機(jī)分組為正常對照組、模型組、制首烏50%乙醇提取物高、中、低劑量組2、1.5、1 mg/mL和大黃素高、中、低劑量組1、0.5、0.25 μg/mL，于六孔板中飼養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔47條幼魚，正常對照組于每日上午按說明書用量給于普通飼料AP100(AP100飼料浮于水面即可)，其余各組每日上午給于2 mg/mL蛋黃粉，給藥組采用預(yù)防給藥，在造模同時(shí)，分別給予高、中、低濃度的制首烏醇提物2、1.5、1 mg/mL和大黃素1、0.5、0.25 μg/mL，正常對照組和模型組加入6 mL魚水，制首烏醇提物組加入魚水和制首烏醇提液，大黃素組加入魚水和大黃素稀釋液，二者加起來達(dá)到6 mL液體，連續(xù)72 h。

2.3 存活率觀測

分別于造模給藥后72 h，觀察并記錄各組斑馬魚的存活條數(shù)，計(jì)算百分率。

2.4 體重、體長和體質(zhì)量指數(shù)(BMI)測量

用三卡因麻醉液將幼魚麻醉，用吸水紙將幼魚表面水吸干，在天平中稱量體質(zhì)量并記錄。用游標(biāo)卡尺測量幼魚頭部最前端到魚尾最末端距離，這段長度代表幼魚體長，BMI為體質(zhì)量(mg)除以體長(mm)的平方所得的數(shù)值。

2.5 整體油紅O染色檢測肝臟脂質(zhì)沉積

隨機(jī)選取各組斑馬魚幼魚多條放在培養(yǎng)皿中，4%多聚甲醛固定12 h，PBS洗兩次，依次按25%、50%、75%、100%的丙二醇濃度進(jìn)行梯度脫水，用新鮮配置的0.5%油紅避光孵育過夜。再依次按100%、75%、50%、25%的丙二醇濃度復(fù)水，PBS洗凈背景，于25%丙二醇4 ℃保存。M165-FC體式顯微鏡拍照統(tǒng)計(jì)，并根據(jù)肝臟染色程度評價(jià)各組的肝臟脂肪沉積率。

2.6 肝組織病理檢測

用4%多聚甲醛固定96 h，脫水，65 ℃石蠟包埋制備石蠟標(biāo)本，石蠟切片機(jī)切取石蠟切片，蘇木素-伊紅染色(HE染色)，顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 斑馬魚體脂測定

將斑馬魚幼魚按體質(zhì)量(g)：體積(mL)為1∶9加入無水乙醇勻漿，離心，吸出上清液，按照甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)試劑盒說明書，測量幼魚體內(nèi)甘油三酯和總膽固醇濃度。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 存活率觀測

對不同組別斑馬魚生長和死亡情況分析，可以看出正常對照組生長正常，體表色素正常，無死亡。模型組體表泛白，存活率偏低。給藥組死亡率降低，活動(dòng)度增強(qiáng)。各組生存率如圖1所示；與空白組相比，蛋黃粉組存活率顯著降低(P<0.05)，與蛋黃粉組相比，低、中、高RPMP組與EMO組存活率均顯著增高(P<0.05)。

圖1 不同濃度的何首烏醇提物和大黃素對NAFLD斑馬魚存活率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of ethanol extract of Polygonum multiflorum and emodin on the survival rate of NAFLD zebrafish

3.2 體重、體長、BMI測定

與空白對照組相比，模型組幼魚體重、體長和BMI顯著增加(P<0.05)；給藥后，RPMP組、emodin組與模型組相比，中劑量組的體重、體長和BMI均極顯著降低(P<0.01)(見表1)。

3.3 整體油紅O染色

按照斑馬魚肝臟染色深淺分成“正?！?如圖2A)、“輕微”(如圖2B)、“嚴(yán)重”(如圖2C)三種情況，圖2中的黃色箭頭指向肝臟?！罢！?、“輕微”、“嚴(yán)重”的區(qū)分在于，“正?！备闻K由于無脂質(zhì)沉積，肝臟不可被油紅染色；“輕微”肝臟有脂質(zhì)沉積，脂質(zhì)沉積較少或只有部分肝臟有脂質(zhì)沉積，因此肝臟被油紅染色淺或只有部分肝臟被染色；“嚴(yán)重”肝臟表示肝臟脂質(zhì)沉積嚴(yán)重，整個(gè)肝臟被油紅染成紅色，并且染色很深[4]。肝臟染色后對各組進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。從圖2中可以看出，肝臟脂質(zhì)沉積嚴(yán)重的斑馬魚，尾部和血管脂質(zhì)染色的堆積也嚴(yán)重。運(yùn)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)后，分析得出制首烏醇提液和大黃素能明顯減少斑馬魚血管中脂質(zhì)的沉積率，緩解斑馬魚幼魚對蛋黃粉吸收形成的肝臟脂肪沉積，見圖3。(肝臟脂肪沉積率統(tǒng)計(jì)包含“輕微”、“嚴(yán)重”)

3.4 肝臟病理組織觀察

對照組斑馬魚肝組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)正常，模型組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)空泡，肝細(xì)胞變形，

表1 各組喂養(yǎng)72 h后幼魚體質(zhì)量、體長、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)變化

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Compared with the blank group,#P<0.05,##P<0.01;compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

圖2 斑馬魚幼魚肝臟脂質(zhì)的沉積的情況Fig.2 The deposition of liver lipids in zebrafish juveniles 注：A：肝臟無脂質(zhì)沉積屬于“正?！保珺：肝臟有部分脂質(zhì)沉積，屬于“輕微”，C：肝臟脂質(zhì)沉積嚴(yán)重，屬于“嚴(yán)重”；黃色箭頭指向肝臟；具體各組肝臟脂質(zhì)沉積情況見圖3。Note:A:lipid-free deposition in the liver is “normal”,B:shows partial lipid deposition in the liver,C:severe liver lipid deposition.the yellow arrow points to the liver;the lipid deposition in the liver of each group is shown in Fig.3.

肝內(nèi)可見脂滴(圖4)。造模同時(shí)給予何首烏提取液和大黃素干預(yù)后，與模型組相比，細(xì)胞排列逐漸正常，肝臟組織的空泡減少，幼魚肝細(xì)胞脂肪沉積情況有一定程度的減輕。

3.5 體脂測定結(jié)果

與空白組相比，模型組幼魚TG極顯著增加(P<0.01)，TC顯著增加(P<0.05)；給藥后，何首烏醇提液組和大黃素組與模型組相比，TG顯著降低(P<0.05)(見表2)。

4 結(jié)論

NAFLD最常見的原發(fā)病為高血脂、肥胖和2型DM[5]。且有資料表明，NAFLD患者的死亡率明顯高于同齡正常人群[6]，因此，本實(shí)驗(yàn)將死亡率作為評價(jià)NAFLD的指標(biāo)之一。NAFLD的發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，早期的病變主要是脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)的過度聚集。當(dāng)TG和TC中任何一個(gè)指標(biāo)含量過高時(shí)，都可能引發(fā)NAFLD。其中，TG與NAFLD的發(fā)生直接相關(guān)，脂肪肝主要是TG大量堆積于肝臟所致的一種病理改變，因此測定肝組織中TG的含量尤為重要[7]。通過整體油紅染色可以觀察到圖4中空白組有一定比例的“部分”脂肪肝發(fā)生，應(yīng)該是在魚類的養(yǎng)殖中，膳食的營養(yǎng)平衡很難達(dá)到，脂肪肝與營養(yǎng)的平衡息息相關(guān)，在人工飼養(yǎng)的環(huán)境中，斑馬魚獲得的膳食營養(yǎng)、生存環(huán)境都很難與野生斑馬魚相形媲美，加上幼魚和雌魚的肝臟脂肪沉積對膳食能量的含量更為敏感。而且有報(bào)道稱，魚類肝臟增加甘油三酯合成的初始階段是為了避免高游離脂肪酸在循環(huán)中誘導(dǎo)的脂毒性，這屬于一種自我保護(hù)機(jī)制[8]，因此，斑馬魚幼魚中出現(xiàn)的“輕微”脂肪肝，不應(yīng)完全視作病理狀態(tài)。

圖3 油紅染色顯示各組肝臟脂質(zhì)沉積百分率Fig.3 Oil red staining shows the percentage of liver lipid deposition in each group注：肝臟脂質(zhì)沉積程度分為“正常”“輕微”“嚴(yán)重”；“正?！辈挥?jì)入統(tǒng)計(jì)學(xué)與空白組比較。#P <0.05，##P <0.01；與模型組比較，*P <0.05，**P <0.01。Note:The degree of liver lipid deposition is divided into “none”,“some” and “steatosis”;among them,“none” is not counted in statistics.Compared with the blank group,#P <0.05,##P <0.01;compared with the model group,*P <0.05,**P <0.01.

圖4 各組喂養(yǎng)72 h后各組幼魚肝臟組織學(xué)的改變(×400)Fig.4 Changes in liver histology of juvenile fish in each group after 72 hours of feeding (×400)

表2 各組喂養(yǎng)72 h后幼魚體脂的變化

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Compared with the blank group,#P<0.05,##P<0.01;compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

制首烏具有化濁降脂的功效，能夠有效改善高血脂，緩解患者的膽固醇、甘油三酯等，并能夠很好地促進(jìn)患者的脂肪代謝，提高代謝的頻率[9]。CHAN等[10]對SAMP8小鼠分別給予何首烏水提液、50%何首烏醇提液、95%何首烏醇提液，結(jié)果顯示50%何首烏醇提液組的小鼠TG與TC較其他兩組顯著降低，證實(shí)50%何首烏醇提液降脂效果更顯著。因此，實(shí)驗(yàn)選取了50%的首烏醇提液。有相關(guān)研究表示，制首烏提取液可以有效減輕兔的肝臟細(xì)胞脂肪病變，這一作用可能與甘油三酯和膽固醇在體內(nèi)的代謝有關(guān)[11]。目前，有關(guān)何首烏提取物治療NAFLD的報(bào)道較少，但是關(guān)于何首烏治療NAFLD的主要成分研究很多。何首烏提取物及其主要成分二苯乙烯苷可顯著降低大鼠體內(nèi)TC含量，并有效治療非酒精性脂肪肝[12]，蒽醌類有效成分能夠通過降低小鼠血脂，發(fā)揮抗氧化、抗自由基及保肝護(hù)肝的效用[13]，其中游離型蒽醌大黃素可降低小鼠肝內(nèi)TG水平,減少肝臟脂肪沉積[14]。實(shí)驗(yàn)前期通過給予造模成功的NAFLD斑馬魚何首烏水提液，發(fā)現(xiàn)水提液無治療作用，因此分別對50%何首烏醇提液和水提液色譜圖跑出的6個(gè)共同峰進(jìn)行含量測定，發(fā)現(xiàn)醇提液中大黃素的含量是水提液的12.99倍，而其他5種成分的含量差別不足2倍，推測大黃素可能為治療NAFLD的主要活性成分，有研究表明，何首烏中大黃素降甘油三酯作用最強(qiáng)，二苯乙烯苷降總膽固醇效果最強(qiáng)[15]，結(jié)合醇提液中大黃素的含量遠(yuǎn)超水提液，且醇提液和大黃素在TG含量的降低中呈現(xiàn)出顯著的效果，對大黃素單體進(jìn)一步的藥效驗(yàn)證后得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，似乎大黃素比制首烏醇提液的治療效果更好，從肝臟切片的結(jié)果來看，大黃素組肝臟細(xì)胞間脂肪空隙比醇提物更少，且中劑量的大黃素還表現(xiàn)出了降低TC的作用，根據(jù)HPLC法，分析出制首烏醇提液中大黃素的含量為0.16 μg/mg，即低、中、高劑量制首烏醇提取物中含大黃素的濃度分別為0.16、0.24、0.32 μg/mL，前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)0.25 μg/mL以下濃度的大黃素是沒有治療作用的，說明制首烏治療NAFLD是多種成分協(xié)調(diào)起作用，但大黃素在其治療NAFLD中扮演了重要角色。有很多報(bào)道和臨床經(jīng)驗(yàn)表明何首烏具有一定的肝毒性，且認(rèn)為何首烏主要的肝毒性成分是蒽醌類[16]，尤其是蒽醌中的大黃素與大黃酸，但是醇提物達(dá)到致死濃度4 mg/mL時(shí)，大黃素的濃度才0.64 μg/mL，是很安全的劑量，因此大黃素在何首烏中肝毒性最大的說法有待考究。綜上，制首烏和大黃素對NAFLD均有很好的治療作用，且制首烏的療效是以大黃素為主要成分，其他成分協(xié)同作用導(dǎo)致，具可做進(jìn)一步具體研究。