木犀草素納米制劑通過介導(dǎo)ERK/p38 MAPK/ JNK改善體內(nèi)外氧化應(yīng)激損傷作用機制研究

梁 晨，王葉葉，江 羽，譚立偉,2，譚 睿,2*

1西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院； 2西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031

氧化應(yīng)激是指機體內(nèi)活性氧(ROS)聚集過多，體內(nèi)清除氧自由基與氧化物質(zhì)失衡，造成了組織細胞氧化損傷[1]。大量研究表明，氧化應(yīng)激是造成腦缺血再灌注損傷的主要因素。腦缺血再灌注期間，ROS過度生成，而ROS能夠直接與缺血腦組織細胞中的大分子物質(zhì)如核酸、脂質(zhì)及蛋白發(fā)生過氧化，造成腦組織不可逆的損傷[2]。同時，過量氧自由基的產(chǎn)生會進一步損傷內(nèi)皮細胞，引起腦組織的微循環(huán)障礙和血腦屏障(BBB)通透性增加，導(dǎo)致外源性物質(zhì)進入腦組織，加重腦損傷[3]。再灌注期間產(chǎn)生的NO會抑制線粒體呼吸鏈，介導(dǎo)其他相關(guān)毒性自由基的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細胞凋亡[4]。因此，消除過多的ROS與抑制細胞凋亡可對治療缺血性腦損傷提供有益的干預(yù)[5]。

木犀草素是一種天然黃酮類化合物，近年來研究發(fā)現(xiàn)木犀草素具有抗氧化、改善缺血引起的腦損傷及抗細胞凋亡等作用[6]。其結(jié)構(gòu)中的羰基可以作為氫供體來還原自由基，具有良好的抗氧化作用[7]。然而，其水溶性差、代謝快等缺點極大地限制了木犀草素的臨床應(yīng)用[8]。因此改善此類活性藥物缺陷的傳輸體系亟待研發(fā)。研究表明，木犀草素可通過納米技術(shù)制備成聚合物膠束來實現(xiàn)提高其溶解性和穩(wěn)定性，增強藥效的目的[9]。其中,由聚氧乙烯 (PEO)-聚氧丙烯 (PPO)-聚氧乙烯 (PEO) 組成的三嵌段共聚物泊洛沙姆以其低毒、低免疫原性和生物相容性等好的優(yōu)點,在膠束載藥領(lǐng)域的研究中倍受青睞[10]。因此，本文采用泊洛沙姆(F127)包裹木犀草素制備納米膠束，對木犀草素納米制劑在體內(nèi)外抗氧化應(yīng)激損傷作用及機制進行研究。

1 材料與試劑

1.1 材料

木犀草素對照品(純度≥99.7%，成都普思生物科技公司，批號：180314)；香葉木素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.7%，成都普思生物科技公司，批號：180321)；泊洛沙姆(F127)(Sigma，批號：P2443)；大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(PC12細胞，中國科學(xué)院上海細胞所)；SPF級雄性SD大鼠(280～300 g，成都達碩實驗動物有限公司)。

1.2 試劑

藥用級乙醇(阿拉丁試劑公司，批號：C1816012)；高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，批號：J180003)；四甲基偶氮唑鹽(MTT粉末，銳賽生物公司，批號：180315)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(源葉生物科技有限公司，批號：BCBR5460V)；4%多聚甲醛(Biosharp，批號：180119)；H2O2溶液(無錫市蘇強化工有限公司，批號：20180322)；β-Actin Mouse Monoclonal Antibody(碧云天生物技術(shù)公司，批號：AF0003)；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(碧云天生物技術(shù)公司，批號：A0562)；DAPI(谷歌生物有限公司，批號：20180326)；鼠抗人p-JNK、p-ERK、p-p38單克隆抗體(Servicebio，批號：GB12001)；HRP標(biāo)記山羊抗鼠的二抗(Servicebio，批號：GB23301)；SOD、MDA、GSH-Px檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20180206)，其余試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 木犀草素納米制劑的制備與表征

將5 mg木犀草素對照品和100 mg的F127共同分散在5 mL H2O中，超聲10 min至溶液澄清，過0.22 μm濾膜除去熱源及未被包裹的藥物，凍干備用[11]。將制備好的膠束通過馬爾文粒度儀測定其粒徑大小和分布，同時采用透射電鏡觀察其形貌。通過HPLC對其載藥量和包封率進行測定。色譜條件：色譜柱：phenomenex-C18；流動相：甲醇-0.2%磷酸(55∶45)；流速：1.0 mL/min。

包封率=(膠束內(nèi)木犀草素的含量/投藥量)×100%

載藥量=(膠束內(nèi)木犀草素的含量/膠束的總質(zhì)量)×100%

通過透析方法研究木犀草素納米膠束的體外釋放行為。準(zhǔn)確移取2 mL木犀草素納米膠束溶液(N-Lu)至透析袋(截留分子量：8 000 Da)中，密封后置于20 mL 的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)，37 ℃空氣浴中進行體外釋放實驗。在釋放1、2、4、8、12、24、48、72、96、120 h后，分別取出等分試樣2 mL透析液，并用相同量的磷酸鹽緩沖溶液代替。通過HPLC測量在指定時間點釋放的木犀草素的量。同時采用相同濃度的木犀草素/二甲亞砜(DMSO)溶液作為游離木犀草素組(F-Lu)進行考察。

2.2 木犀草素納米制劑對PC12細胞氧化應(yīng)激損傷的影響

將PC12細胞接種于含有10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的PC12細胞按照2×104個/孔接種于96孔板中，設(shè)置對照組(Control)、模型組(H2O2)、游離木犀草素組(F-Lu)、木犀草素納米制劑組(N-Lu)。給藥組24 h后加入2、5、10、20、40、50、100 μmol/L濃度的F-Lu及N-Lu。繼續(xù)孵育24 h后各組加入400 μmol/L H2O2溶液誘導(dǎo)4 h，對照組不做處理。每孔加入20 μL終濃度為5 mg/mL的MTT溶液，培養(yǎng)2～4 h，棄去上清，加入150 μL DMSO振蕩10 min，待孔內(nèi)紫色顆粒完全溶解后于570 nm波長處用酶標(biāo)儀測取OD值，計算細胞存活率[12]。同時，將PC12細胞接種于6孔板中，按上述給藥方式進行處理，之后進行β-actin免疫熒光染色，觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化[13]。

利用western-blot檢測JNK、ERK和p38 MAPK蛋白磷酸化水平。取上述各組細胞，BCA法蛋白定量。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，PBST漂洗，4 ℃過夜孵育，加入一抗和二抗，ECL化學(xué)發(fā)光，顯影。

2.3 木犀草素納米制劑對大鼠腦缺血再灌注損傷氧化應(yīng)激水平的影響

根據(jù)文獻[14]所述方法建立大鼠右側(cè)大腦缺血再灌注損傷模型。將健康雄性SD大鼠隨機分為4組：假手術(shù)組(Sham)、模型組(IR)、游離木犀草素組(F-Lu)、木犀草素納米制劑組(N-Lu)，每組20只，F(xiàn)-Lu、N-Lu組分別尾靜脈給予木犀草素對照品、木犀草素納米制劑(10 mg/kg)，Sham組和IR組均給予生理鹽水。之后根據(jù)Zea Longa五分制法對大鼠神經(jīng)功能損傷狀態(tài)進行評分[15]。24 h后，對大鼠進行股動脈取血，5 000 rpm離心5 min取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。血清樣品按照試劑盒操作說明處理，測定SOD、MDA、GSH-Px值。完整取出大鼠腦組織，進行TTC染色并計算各組腦梗死體積。各組腦部含水量通過以下公式計算：

腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%

2.4 木犀草素納米制劑的藥代動力學(xué)研究

2.4.1 工作液配制

木犀草素對照品溶液：精密稱取木犀草素對照品29.11 mg于25 mL量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得1.16 mg/mL的對照品溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取香葉木素對照品20.07 mg于25 mL的量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.807 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 給藥方案及血樣采集

將健康雄性SD大鼠隨機分為2組，分別尾靜脈給予木犀草素對照品和木犀草素納米制劑，并于給藥后5、15、30 min、1、2、4、6、8、10 h采血，5 000 rpm離心5 min取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆肹16]。

2.4.3 血漿樣品的處理與測定

取100 μL大鼠血漿樣品，加入10 μL香葉木素溶液、10 μL甲醇、100 μL HCL溶液(10 mol/L)混勻，在80 ℃水浴2 h，冷卻后加入50 μL 10%的三氯乙酸溶液，渦旋混勻3 min，加入2 mL乙酸乙酯萃取，渦旋混勻3 min，10 000 rpm離心10 min，吸取上層乙酸乙酯層，N2吹干，100 μL甲醇復(fù)溶，12 000 rpm離心10 min，取上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 數(shù)據(jù)分析

3 實驗結(jié)果

3.1 木犀草素納米制劑表征

木犀草素納米制劑形態(tài)見圖1A，載藥膠束呈規(guī)則球形或橢圓形，分布均勻，彼此不粘連。如圖1B所示，粒徑在30 nm左右。木犀草素納米制劑的載藥量和包封率實驗結(jié)果如表1所示。投藥量在2%～5%范圍內(nèi)，包封率均保持在95%以上，之后隨著投藥量不斷增加，包封率明顯降低。

本實驗采用投藥量為5%的木犀草素納米膠束進行體外釋放研究。如圖2所示，從藥物釋放曲線中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-Lu在24 h內(nèi)幾近完全從透析袋中釋放出來。而N-Lu的藥物累計釋放量在相同時間內(nèi)僅58.7%，這表明膠束可防止木犀草素在最初發(fā)生突釋，使其在體內(nèi)的循環(huán)時間和生物利用度增加。

圖1 木犀草素納米制劑表征Fig.1 Characterization of luteolin nano-formulation注：A.電鏡圖；B.粒徑分布。Note：A.TEM image； B.Particle size distribution.

表1 木犀草素納米制劑載藥量和包封率

圖2 木犀草素納米制劑體外釋放曲線Fig.2 In vitro release curve of luteolin nano-formulation

3.2 木犀草素納米制劑對PC12細胞氧化應(yīng)激損傷的影響

細胞活性檢測結(jié)果如圖3所示。與Control組相比，H2O2顯著性降低了PC12細胞的存活率(P<0.01)，當(dāng)加入木犀草素預(yù)保護后，在5～10 μmol/L濃度范圍內(nèi)隨著木犀草素濃度增高，細胞存活率明顯提高(>85%)。此外，與F-Lu組相比，N-Lu組的細胞存活率顯著提高(P<0.05)。隨著木犀草素劑量的增加，PC12細胞的存活率呈現(xiàn)下降趨勢，說明木犀草素對抗氧化應(yīng)激作用具有劑量依存關(guān)系，10 μmol/L濃度左右，其抗氧化應(yīng)激作用最強。以上結(jié)果表明，木犀草素納米制劑能夠進一步減輕PC12細胞的氧化應(yīng)激損傷。

圖3 木犀草素納米制劑對H2O2誘導(dǎo)PC12細胞存活率的影響(n=6)Fig.3 Effect of luteolin nano-formulation on PC12 viabilities induced by H2O2(n=6)注：△△P <0.01：與空白對照組相比；##P <0.01、#P <0.05：與H2O2組相比；* P <0.05：與游離木犀草素組相比。Note:△△P <0.01 vs Control；## P <0.01、#P <0.05 vs H2O2；*P <0.05 vs F-Lu.

此外，對各組PC12細胞的細胞骨架進行免疫熒光染色，觀察其形態(tài)學(xué)變化。如圖4所示，正常PC12細胞的骨架紋理清晰，呈典型的密集網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，狀態(tài)良好[17]。而Model組相比Control組，細胞邊緣發(fā)生皺縮，骨架纖維間隙變大，有骨架斷裂出現(xiàn)。實驗組給藥后細胞狀態(tài)均有所恢復(fù)。相比F-Lu組，N-Lu的細胞骨架清晰，著色均勻，細胞形態(tài)更為理想。結(jié)果表明，木犀草素納米制劑不僅能夠提高氧化應(yīng)激環(huán)境中細胞的生存率，同時能夠減輕由于氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細胞形態(tài)學(xué)改變。

MAPK作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的一員，可以響應(yīng)包括氧化應(yīng)激在內(nèi)的各種刺激，調(diào)控著許多生理活動，如炎癥、凋亡等，其三個主要成員為ERK1 /2、JNK、p38 MAPK[18]。因此采用western-blot檢測各組PC12細胞中三個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的磷酸化水平。結(jié)果如圖5所示，與F-Lu組相比，N-Lu組p-JNK、p-p38、p-ERK1/2表達水平顯著降低(P<0.01)。表明木犀草素納米制劑可通過抑制JNK、p38、ERK1/2磷酸化活性來減少細胞凋亡，顯著提高抗氧化應(yīng)激損傷水平。

圖4 木犀草素納米制劑對PC12細胞形態(tài)學(xué)的影響Fig.4 Effect of luteolin nano-formulation on the morphology change of PC12 cells

圖5 木犀草素納米制劑對PC12細胞中p-JNK,p-P38,p-ERK1/2磷酸化水平的影響Fig.5 Effect of luteolin nano-formulation on phosphorylation of p-JNK,p-P38 and p-ERK1/2 in PC12 cells注：△△P <0.01：與空白對照組相比；##P <0.01、# P <0.05：與H2O2組相比；**P <0.01：與游離木犀草素組相比。Note:△△P <0.01 vs Control；## P <0.01、# P <0.05 vs H2O2；**P <0.01 vs F-Lu.

3.3 木犀草素納米制劑對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

大鼠腦梗染色結(jié)果如圖6所示。同時腦梗死體積及腦含水量的測定結(jié)果見表2。與Sham組相比，IR組的腦梗死體積和含水量均顯著性增加(P<0.05)，與IR組相比，給藥之后腦梗死體積顯著降低(P<0.01)，相比F-Lu組，N-Lu組腦梗死體積顯著性減少，具有差異性(P<0.05)。表明木犀草素納米制劑能夠有效減少缺血再灌注損傷導(dǎo)致的梗死體積。然而，由于缺血再灌注損傷可引起B(yǎng)BB通透性顯著增加，造成神經(jīng)細胞間質(zhì)出現(xiàn)明顯水腫，因此含水量的高低可間接表明BBB受損程度[19]。如表2所示，各手術(shù)組腦含水量均有所增加，治療組的含水量相比IR組有一定的降低，但無顯著性差異，這可能是由于在短時間內(nèi)，BBB的通透性并未完全恢復(fù)導(dǎo)致的外源性物質(zhì)向腦組織內(nèi)流。

圖6 大鼠腦部TTC染色Fig.6 TTC staining of rats brain

表2 木犀草素納米制劑對大鼠腦梗死體積及腦含水量的影響

注：△△P<0.01、△P<0.05：與假手術(shù)組相比；##P<0.01：與模型組相比；*P<0.05：與游離木犀草素組相比。

Note:△△P<0.01、△P<0.05 vs Sham；##P<0.01 vs IR；*P<0.05 vs F-Lu.

3.4 木犀草素納米制劑體內(nèi)抗氧化損傷作用機制研究

抗腦缺血再灌注損傷體內(nèi)實驗表明，木犀草素納米制劑能夠顯著性降低IR損傷，其體內(nèi)作用機制研究結(jié)果如表3所示。SOD及GSH-Px是機體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，能夠直接清除自由基，保護機體免受氧化應(yīng)激損傷。因此，SOD及GSH-Px含量的高低直接反映了體內(nèi)抗氧化作用的強弱。同時，MDA的含量可用于直接反應(yīng)組織受氧化損傷的程度。結(jié)果顯示，與Sham組相比，IR組血樣中SOD、GSH-Px含量顯著降低(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)。與IR組相比，給藥組氧化應(yīng)激損傷水平顯著改善。相比F-Lu組，N-Lu組SOD、GSH-Px水平升高，MDA含量明顯降低，具有顯著性差異(P<0.01)。

3.5 木犀草素納米制劑的藥代動力學(xué)研究

經(jīng)尾靜脈注射，分別給予SD大鼠F-Lu和N-Lu(10 mg/kg,木犀草素量計)，在設(shè)定時間點進行樣品采集和測定，計算各時間點血藥濃度，繪制血藥濃度-時間曲線如圖7所示。同時，經(jīng)DAS軟件自動擬合數(shù)據(jù)，計算相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)見表4。結(jié)果顯示，對比F-Lu組，N-Lu組的峰濃度提高，半衰期延長，藥時曲線下面積明顯增大。

表3 木犀草素納米制劑對大鼠血樣中SOD、MDA、GSH-Px的影響

注：△△P<0.01：與假手術(shù)組相比；##P<0.01 、#P<0.05：與模型組相比；**P<0.01：與游離木犀草素組相比。

Note:△△P<0.01 vs Sham；##P<0.01 、#P<0.05 vs IR；**P<0.01 vs F-Lu.

圖7 大鼠體內(nèi)平均血藥濃度-時間曲線Fig.7 Mean plasma concentration-time curve in rats

參數(shù) ParameterF-LuN-Lut1/2(hr)3.13.9Cmax(μg·mL-1)2.6±0.133.1±0.11AUC0→last(hr·μg·mL-1)5.9±0.199.5±0.10??MRT(hr)2.9±0.113.4±0.09CL_obs(hr·mL·kg)2 809.4±0.071 609.4±0.05Vss_obs(mL·kg-1)13 725.2±0.0310 065.0±0.03

注：**P<0.01：與游離木犀草素組相比。

Note:**P<0.01 vs F-Lu.

4 討論

目前臨床使用的木犀草素口服劑型存在生物利用度低、血藥濃度達峰時間長等不足，極大地限制了其推廣應(yīng)用；不僅如此，由于木犀草素在水中的低溶解性，給開發(fā)其靜脈劑型也帶來了很大的困難[20]。本文中，使用了泊洛沙姆包裹木犀草素，制備成納米膠束制劑，有效地改善了疏水藥物木犀草素在水溶液中的分散性，突破了其在靜注給藥中的使用限制。不僅如此，在制備過程中不含有機溶劑，避免了傳統(tǒng)輸水藥物靜脈制劑(如泰素帝等)中有機溶劑殘留所引起的毒副反應(yīng)。此外，本研究中所制備的木犀草素納米制劑具有粒徑分布均一、載藥性能較高等特點，可改善木犀草素自身的成藥性缺陷，提高了木犀草素的臨床使用價值及應(yīng)用前景。

肌動蛋白是構(gòu)成細胞骨架的主要成分，其與細胞形態(tài)變化密切相關(guān)，而細胞形態(tài)學(xué)的變化可直接反應(yīng)出細胞的狀態(tài)。有研究顯示，細胞凋亡過程中肌動蛋白細絲發(fā)生斷裂，骨架結(jié)構(gòu)遭到破壞[21]。體外H2O2誘導(dǎo)PC12細胞氧化應(yīng)激損傷結(jié)果表明木犀草素納米制劑不僅顯著性提高了PC12細胞的存活率，而且能夠進一步保持細胞結(jié)構(gòu)的完整性，通過抑制JNK、p38、ERK磷酸化水平從而減少由于氧化應(yīng)激損傷所造成的細胞凋亡。

綜上所述，木犀草素納米制劑改善了木犀草素單體的成藥性缺陷，增強了體內(nèi)外抗氧化應(yīng)激作用，同時有效地改善了腦缺血再灌注損傷，為缺血性腦損傷的治療研究提供了新的思路，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。