黃酮化合物對(duì)耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌抑菌作用研究

沈煥圻，張昌發(fā)，林 航，陳 鑫，黃若詩(shī)，曾煦欣，郭嘉亮,*

1 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，佛山 528000；2 暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510632

耐藥菌感染是臨床抗感染治療中極為棘手的難題，也是造成重癥感染死亡的首要原因[1]。面對(duì)NDM-1等“超級(jí)細(xì)菌”的肆虐，傳統(tǒng)抗生素束手無(wú)策[2]。然而，近 30 年來(lái)世界范圍內(nèi)針對(duì)耐藥菌的藥物研發(fā)卻一直未見較大進(jìn)展[3,4]。鮑曼不動(dòng)桿菌(AcinetobacterBaumanii，Ab)是一種非發(fā)酵乳糖的、需氧的、革蘭氏染色陰性的多形不動(dòng)桿菌。作為醫(yī)院感染的重要病原菌之一，主要引起呼吸道感染，也可引發(fā)敗血癥、泌尿系感染、繼發(fā)性腦膜炎等。由于該菌生存能力強(qiáng)及獲得性耐藥能力強(qiáng)，甚至引發(fā)醫(yī)院內(nèi)小規(guī)模暴發(fā)流行，對(duì)危重患者和CCU及ICU中的患者威脅很大。為控制鮑曼感染，臨床廣泛使用抗菌藥物，導(dǎo)致一些毒力因子的產(chǎn)生，進(jìn)而提升了鮑曼的毒力及致病力，導(dǎo)致多重耐藥、廣泛耐藥、全耐藥的世界性流行。近年來(lái)，多重耐藥(multi drug resistant Ab,MDR-Ab)菌株為臨床治療帶來(lái)巨大的困難，目前MDR-Ab對(duì)臨床使用的抗菌藥物敏感性不斷下降，尤其對(duì)碳青霉烯類的耐藥率更高，造成耐碳青霉烯類Ab出現(xiàn)；即使多黏菌素等最有效的治療藥物，其耐藥性也逐漸提高。臨床已較長(zhǎng)時(shí)間未出現(xiàn)新的有效藥物，常規(guī)治療藥又面臨耐藥的處境，造成如今幾乎無(wú)藥可用的局面，因此現(xiàn)在迫切需要尋找新的治療方法[5]?，F(xiàn)有的研究較多集中在耐藥機(jī)制方面、遺傳基因、防護(hù)措施等方面[6]。開發(fā)新的抗菌藥物是克服該菌耐藥性的有效途徑，但新藥開發(fā)周期長(zhǎng)、投入大。中藥及天然藥物是我國(guó)寶貴的資源，在治療感染性疾病方面有著悠久的歷史，其成分復(fù)雜、作用靶點(diǎn)多、抗菌譜廣，細(xì)菌較少對(duì)其產(chǎn)生耐藥，對(duì)于抗菌有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，能延緩甚至逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生，并且中藥低毒副作用、藥物來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉，在抗菌治療中發(fā)揮具有極大的開發(fā)價(jià)值[6,7]。然而，中藥材成分復(fù)雜多樣，明晰其物質(zhì)基礎(chǔ)，尋找具有有效抗菌作用的中藥單體尤為重要。目前許多中藥單體已被驗(yàn)證了其良好的抑菌或多途徑逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性效果[7]。從中草藥中探索研究新型抗菌化學(xué)實(shí)體有望成為發(fā)現(xiàn)對(duì)抗鮑曼不動(dòng)桿菌的重要途徑。

此前，有報(bào)道指出中藥及天然來(lái)源的黃酮及其衍生物均具有良好的鮑曼不動(dòng)桿菌抑制活性，甚至包括抑制細(xì)菌生物被膜的形成而達(dá)到對(duì)抗耐藥性的目的[8,9]，這引起了本課題組的高度關(guān)注。通過(guò)“抑菌+抗生物被膜”雙重作用，有望實(shí)現(xiàn)雙靶標(biāo)對(duì)抗鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性問(wèn)題。因此，本研究以三株耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌菌株為研究對(duì)象，從40種中藥黃酮單體中篩選有效的抑菌成分(抑菌)，并進(jìn)一步考察其生物被膜抑制活性(抗生物被膜)，為后續(xù)新型中藥抗生素的發(fā)現(xiàn)或者臨床上的聯(lián)合使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及菌株

野黃芩素、花旗松素、異鼠李素、漆黃素、漢黃芩苷、黃豆苷、葛根素、蕓香葉苷、木犀草苷、金絲桃苷、甘草素、鷹嘴豆牙素A、楊梅苷、橙皮素、黃芩素、木犀草素、山柰酚、芹菜素、柚皮素、黃芩苷、白楊素、染料木苷、金雀異黃酮、曲克蘆丁、野黃芩苷、綠原酸、異綠原酸A、野黑櫻苷、黃豆苷原、漢黃芩素、芥子酸、黃豆苷原、川陳皮素、淫羊藿苷、柚皮苷、梔子甙、黃芪甲苷、甘草苷、表兒茶素、兒茶素，合計(jì)40種黃酮單體(上海阿拉丁試劑有限公司)；氯已定(Sigma 公司)；頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(SCF，輝瑞公司)；將每種黃酮單體溶液以DMSO為溶劑配成濃度為10 mg/mL的溶液，混勻后置于25oC冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

鮑曼不動(dòng)桿菌菌株三株：Ab50986、Ab48929、Ab50822，來(lái)自廣州市華僑醫(yī)院2017年 1月～12月門診及住院病房檢驗(yàn)標(biāo)本培養(yǎng)分離，經(jīng)常規(guī)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)均為多重耐藥菌株。NB固體培養(yǎng)基的配制：蛋白胨10 g/L、瓊脂粉15 g/L、牛肉膏3 g/L和NaCl 5 g/L，高壓滅菌鍋滅菌后，無(wú)菌條件下倒平板，待其凝固后，倒置，置于25oC冰箱冰箱保存?zhèn)溆?。NB 液體培養(yǎng)基的配制：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L和NaCl 5 g/L，高壓滅菌鍋滅菌后，同樣置于25oC冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)，SW-CJ-1F 型單人雙面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；KS4000i控制型控溫?fù)u床(德國(guó)IKA公司)；WGZ-CJ-XJ 細(xì)菌比濁儀(上海昕瑞儀器儀表有限公司)；BL600 型電子分析天平(德國(guó) Sartorius 公司)；Model 680 酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio-rad 公司)；F-4500 熒光分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)；微量加樣器、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、高壓滅菌鍋、干燥箱、冰箱等。

1.3 接種方法

分區(qū)劃線：取凍存菌株，用接種環(huán)先將標(biāo)本涂布在NB平板作，每一區(qū)域的劃線應(yīng)接觸上一區(qū)域的接種線 2～3 次，使菌量逐漸減少，使其形成單個(gè)菌落。劃線完畢，將平板加蓋，倒置(瓊脂平板的底部向上)于 37oC孵育12 h 后。分離傳代：用接種針垂直挑取細(xì)菌的單個(gè)菌落，點(diǎn)在另一個(gè)瓊脂平板上并作數(shù)次劃線，灼燒接種環(huán)，待冷切后繼續(xù)上一劃線操作。倒置(瓊脂平板的底部向上)于 37oC孵育培養(yǎng)12 h后，可供試驗(yàn)用，現(xiàn)化現(xiàn)用。

1.4 菌液制備

從培養(yǎng)12 h的NB培養(yǎng)基上挑選菌落于NB培養(yǎng)基中，并校正濃度至 0.5 麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)(1.5×108CFU/mL)，校正后的菌懸液用NB肉湯按1∶1 000稀釋，稀釋后立即使用。

1.5 最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定

初篩：在無(wú)菌96 孔板(除第一列)中每孔加100 μL NB肉湯培養(yǎng)基，取適量的黃酮單體母液按1∶10的比例稀釋加入(同時(shí)加入頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉作對(duì)照之用)，每孔的藥物濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL；將稀釋好的菌液用排槍加入100 μL至孔中，取10 μL DMSO、90 μL NB培養(yǎng)基、100 μL菌液組成陰性對(duì)照組；另取200 μL NB培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，封口膜封閉，于37 ℃ 孵箱中培養(yǎng)12 h，肉眼觀察判斷(平行測(cè)定3 次)。

精篩：參考文獻(xiàn)[8]，對(duì)初篩效果較好的黃酮單體繼續(xù)采用二倍稀釋法進(jìn)行精篩(每孔的藥物濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625、0.007 812 5、3.91×10-4mg/mL)。如上文所述，以DMSO NB培養(yǎng)基、菌液組成陰性對(duì)照組；NB培養(yǎng)基為空白對(duì)照組(平行測(cè)定3 次)，此最低藥物濃度值為其 MIC 值。

1.6 最低殺菌濃度(MBC)測(cè)定

對(duì)精篩后獲得的中藥黃酮單體進(jìn)行MBC 測(cè)定。將上述MIC的孔內(nèi)液體混勻后，從每孔中分別取適量加到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上作次代培養(yǎng)，于37 ℃ 孵箱中培養(yǎng)12h，觀察結(jié)果，以肉眼觀察菌落不生長(zhǎng)視為100%被殺滅，此最低藥物濃度值為其 MBC 值。

1.7 生物膜形成的定量分析

參考文獻(xiàn)[9]采用結(jié)晶紫染色法進(jìn)行測(cè)定。在 96 孔板中每孔加入180 μL培養(yǎng)液(藥物終濃度為1/4 MIC)，接種20 μL 過(guò)夜培養(yǎng)菌液，37 ℃靜置孵育3天 和7天；無(wú)菌 PBS 緩沖液清洗板孔3次，甲醇固定20 min，自然風(fēng)干；每孔加入100 μL 0.1% 結(jié)晶紫溶液，室溫下染色5 min；用流水把多余的染料沖洗干凈，除去殘余的水，并烘干；加入200 μL 33 % 冰乙酸溶液，在37 ℃培養(yǎng)箱中作用 30 min 以溶解結(jié)晶紫；600 nm條件下，用酶標(biāo)儀測(cè)定培養(yǎng)孔中溶液的 OD 值；生物被膜抑制率=(A空白-A樣品)/A空白×100 %(平行測(cè)定3 次)。

1.8 聯(lián)合應(yīng)用作用效果

將上述獲得的活性最佳的黃酮單體配制成不同濃度(1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、1 MIC)，混合不同濃度頭孢哌酮/舒巴坦(SFC)(1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、1 MIC)培養(yǎng)液，加入上述配制試驗(yàn)菌液中，確保最終接種量；同時(shí)做空白和陽(yáng)性對(duì)照，于37 ℃ 孵箱中培養(yǎng)12 h，觀察中黃酮與西藥頭孢哌酮/舒巴坦的聯(lián)合應(yīng)用作用效果。通過(guò)部分抑菌濃度(FIC)指數(shù)判定兩藥聯(lián)合作用：FIC指數(shù)=MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用+ MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單用。FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用，0.54.0為拮抗作用。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

數(shù)據(jù)采用 SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度

如表1所示，不同黃酮單體對(duì)耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌的抑菌作用差異較大。其中，野黃芩素、漆黃素、蕓香葉苷、金絲桃苷、甘草素、楊梅苷、橙皮素、曲克蘆丁、野黃芩苷、綠原酸、異綠原酸A、野黑櫻苷、芥子酸、川陳皮素、淫羊藿苷、柚皮苷、梔子甙、甘草苷、表兒茶素、兒茶素呈現(xiàn)出輕微的抑菌效果，其最低抑菌濃度為0.5 mg/mL；而黃芩素和漢黃芩苷效果最佳，如表2所示，經(jīng)過(guò)精篩后確認(rèn)其最低抑菌濃度分別為 0.062 5 和 0.125 mg/mL；其他篩選的黃酮單體則抑菌作用則不明顯，其MIC均大于0.5 mg/mL。

此外，如表3所示，經(jīng)過(guò)測(cè)定后確認(rèn)黃芩素和漢黃芩苷的對(duì)菌株Ab50986和Ab48929的最低殺菌濃度分別為 0.125、 0.25 mg/mL；對(duì)菌株Ab50822的最低殺菌濃度分別為 0.25、0.5 mg/mL，呈現(xiàn)出一定藥物作用的量效關(guān)系。

2.2 生物被膜定量分析結(jié)果

細(xì)菌生物膜主要成分由藻酸鹽組成，通過(guò)與結(jié)晶紫反應(yīng)染色，檢測(cè)其在 600 nm 處的吸光度，從而間接反映生物被膜的量。參考文獻(xiàn)[9]，通過(guò)測(cè)量吸光度的變化來(lái)定量檢驗(yàn)化合物對(duì)生物被膜的影響。如表4所示，以其中一種菌株(Ab50986)為例，結(jié)果表明黃芩素組對(duì)生物被膜的形成具有明顯抑制作用；漢黃芩苷組則沒(méi)有明顯的抑制作用。

2.3 聯(lián)合用藥結(jié)果

黃芩素對(duì)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(Ab50986)的藥物最低抑菌濃度 MIC 為 0.062 5 mg/mL；根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10]頭孢哌酮/舒巴坦對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的 MIC 為 0.256 mg/mL。如表5所示，以其中一種菌株(Ab50986)為例，黃芩素和頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合作用于耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，黃芩素濃度1/2 MIC時(shí)，用頭孢哌酮/舒巴坦?jié)舛?/8 MIC可抑制耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的生長(zhǎng)(FIC=0.625)。黃芩素和頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合用藥與單用黃芩素或頭孢哌酮/舒巴坦比較，增強(qiáng)了單獨(dú)用藥的抑菌效果，根據(jù)FIC指數(shù)判定，產(chǎn)生了部分協(xié)同作用。

表1 化合物對(duì)三株耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌菌株的MIC 初篩結(jié)果(mg/mL，n=3)

表2 黃芩素與漢黃芩苷對(duì)三株耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌菌株的MIC 精篩結(jié)果(mg/mL，n=3)

表3 黃芩素與漢黃芩苷對(duì)三株耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌菌株的MBC 結(jié)果(mg/mL，n=3)

表4 黃芩素與漢黃芩苷對(duì)耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌的生物被膜抑制率

表5 黃芩素聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦對(duì)耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制作用(n=3)

注：“-”表示細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制 ，“+”表示細(xì)菌生長(zhǎng)。

Note:“-”means bacterial growth is inhibited,“+”means bacterial growth.

3 討論

黃酮類化合物是中草藥的重要成分之一，有著很強(qiáng)的生物活性和藥理活性。近年來(lái)，黃酮及其衍生物以其廣譜的抑菌作用和生理活性，引起了科研工作者的高度關(guān)注。本文以中藥和天然藥物中常見的黃酮類化合物研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)采取盲篩的方法對(duì)這40種黃酮單體進(jìn)行篩選。從篩選的結(jié)果來(lái)看，大部分黃酮對(duì)耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌均有不同程度的抑菌作用，其中以黃芩素與漢黃芩苷的抑菌效果較佳。黃芩素抑菌譜較廣，對(duì)常見致病菌如金黃色葡萄球菌球菌[11]、銅綠假單胞菌[8]都有較好的抑菌效果，但前期文獻(xiàn)檢索未見有關(guān)黃芩素對(duì)耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌抑菌效果的研究報(bào)道。目前，該細(xì)菌與中藥黃芩相關(guān)的研究比較局限，如黃芩膠囊對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的體外抑菌效果觀察[12]以及黃芩等6種中藥對(duì)60株泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的抑菌效果檢測(cè)[13]等，尚處于比較初步的階段，未具體深入到分子單體化合物的研究層面。為了明晰中藥作用機(jī)理，推動(dòng)中藥現(xiàn)代化進(jìn)程，急需更加深入的探索與研究。

此外，本文還首次探討了黃芩素對(duì)耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌的生物被膜抑制效果。細(xì)菌生物被膜(biofilm)是細(xì)菌附著于平面后，自身分泌的多聚糖等基質(zhì)包裹下形成的復(fù)合物，使細(xì)菌具有極高的耐藥性和免疫逃逸能力，也是發(fā)生細(xì)菌性感染難以治愈的重要原因。近年研究表明[9,14]，鮑曼不動(dòng)桿菌可形成生物被膜，且與耐藥性有深入的聯(lián)系，使鮑曼不動(dòng)桿菌可長(zhǎng)期存在于醫(yī)院環(huán)境，包括不同材質(zhì)的醫(yī)用材料表面，甚至醫(yī)護(hù)人員的指尖表面，最終導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。本文的發(fā)現(xiàn)，為研究人員解決耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌的治療問(wèn)題提供了全新思路和方向。

鮑曼不動(dòng)桿菌是近年來(lái)臨床分離的致病菌中的主要菌種，由于鮑曼不動(dòng)桿菌在醫(yī)院內(nèi)分布廣泛且其耐藥性因抗生素的過(guò)度使用不斷增強(qiáng)，導(dǎo)致由其引起的醫(yī)院感染發(fā)病率逐年上升。本研究基于“抑菌+抗生物被膜”的雙重策略，通過(guò)微量肉湯稀釋法和生物被膜定量分析，對(duì)多種中藥單體進(jìn)行篩選，方法快速簡(jiǎn)單方便，結(jié)果可靠；研究結(jié)果也初步提示了與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合用藥的可行性，同時(shí)也為抗耐藥菌中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)。但由于本研究?jī)H對(duì)三株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行了體外抗菌效果，對(duì)更多的耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌菌株是否有效尚待進(jìn)一步驗(yàn)證；同時(shí)藥物進(jìn)入體內(nèi)后能否達(dá)到積極的抗菌效果也需要進(jìn)一步考察。