氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)合多變量分析研究蜂蜜的揮發(fā)性成分

王文靜，周雅蓮，薛阿輝，屈亮亮，黃學勇*，羅麗萍,2

1南昌大學生命科學學院，南昌 330031；2南昌大學，食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，南昌 330047

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜性物質(zhì)[1]。不同來源蜂蜜的共性成分主要是糖類(70%～80% w/w)和水(10%～20% w/w)[2]，而蜂蜜產(chǎn)品的特殊性即風味、香味、顏色和質(zhì)地主要取決于花蜜或植物的種類[3]。根據(jù)蜜源植物不同，蜂蜜分為單花蜜和雜花蜜[4]。單花蜜具有天然的特性和功效，在市場上廣受消費者歡迎[5]。由于蜜源豐富，油菜蜜是穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的蜂蜜品種之一，大約占蜂蜜總產(chǎn)量的40%左右。此外，椴樹蜜、荊條蜜和洋槐蜜也是我國主要的蜂蜜品種，因蜜源來源限制，價格也高于油菜蜜。受高額利潤的驅(qū)使，不法商家往往以次充好，通過摻入油菜蜜形成勾兌蜜，或用雜花蜜冒充單花蜜，欺騙消費者，這不僅降低了蜂蜜的質(zhì)量，也嚴重干擾了蜂產(chǎn)品市場秩序[6-8]。為保障蜂蜜產(chǎn)品質(zhì)量和市場秩序，需進行溯源技術(shù)體系的研究[9]。

蜂蜜的氣味與蜜源關(guān)系密切，不同植物花蜜中揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量不同，造成不同蜂蜜不同的氣味特征，研究蜂蜜中的揮發(fā)性化合物對蜂蜜種類鑒別具有積極意義[10-13]。Alissandrakis等[14]認為某種化合物存在于所檢測的所有單花蜜中，且不存在于其他蜂蜜或存在但含量較少時，該化合物可被看作該單花蜜的特征性化合物。Radovic等[15]采用動態(tài)頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了9種不同植物源的43個蜂蜜樣品，認為存在二甲基二硫和同時不存在2-甲基-1-丙醇是歐洲油菜蜜植物源標記物；順式芳樟醇和庚醛可作為洋槐蜜的標記物。然而，Plutowska[16]等采用頂空固相微萃取的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究了波蘭不同植物源蜂蜜發(fā)現(xiàn)二甲基二硫并非油菜蜂蜜的特有物質(zhì)。Ka?koniene等[17]從11個油菜蜜中的6個樣品中檢出了二甲基二硫，但均未檢出2-甲基-1-丙醇。由于單花蜜的揮發(fā)性物質(zhì)和植物蜜源以及生存環(huán)境相關(guān)，一些揮發(fā)性物質(zhì)可能存在于或不存在于同種蜜源中，但其出現(xiàn)頻率比較高，在其它蜂蜜中未檢出或含量較低時，也應(yīng)將它確定為單花蜜的特征性揮發(fā)物[18]。大量研究表明，受內(nèi)外因素的作用均會影響蜂蜜的化學組成，因此利用多種化合物和多元統(tǒng)計方法應(yīng)更準確的鑒別不同蜜源蜂蜜[19 ]。

本文以油菜蜜、椴樹蜜、荊條蜜和洋槐蜜為實驗材料，采用靜態(tài)頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(static headspace-gas chromatography-mass spectrometry,SHS-GC-MS)對其中的揮發(fā)性化合物組成進行鑒別，進一步采用主成分分析(principal component analysis,PCA)和聚類分析(cluster analysis,CA)等多變量分析方法，對4種蜂蜜進行統(tǒng)計區(qū)分，并尋找特征變量和探討它們的典型代謝物質(zhì)，以期為蜂蜜溯源、品質(zhì)和真?zhèn)舞b別提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂蜜：共收集了4種蜜源的38份蜂蜜樣品，具體信息見表1。樣品由各地蜂農(nóng)提供，4 ℃保存?zhèn)溆?。C8-C40正構(gòu)烷烴混標(美國AccuStandard公司)；正己烷(天津市大茂化學試劑廠，分析純)。

表1 蜂蜜樣品信息表

1.2 儀器與設(shè)備

GC7890B-MS7000C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配置7697A頂空進樣器(美國Agilent公司)、HP-5ms色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；BSA224S型電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)；DKZ-450B型電熱恒溫振蕩水槽(上海森信實驗儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 SHS-GC-MS實驗條件的優(yōu)化

參考Kaskoniene和Siegmund等[17,21]的報道，對影響SHS-GC-MS檢測結(jié)果的主要因素，包括平衡時間、平衡溫度、樣品量、分流比等進行了優(yōu)化，以匹配度>75%的有效峰個數(shù)為評價指標，獲得最佳實驗條件。

1.3.2 SHS-GC-MS檢測蜂蜜中的揮發(fā)性成分

將待測蜂蜜樣品置于45 ℃水浴中加熱20 min，混勻樣品，準確稱取13.00 g蜂蜜加入20 mL頂空瓶中，壓緊瓶蓋密封，置于樣品盤。正構(gòu)烷烴標準品用正己烷稀釋至1 mg/mL待測。

頂空瓶加熱溫度80 ℃，樣品平衡20 min，定量環(huán)溫度100 ℃，傳輸管溫度120 ℃，進樣環(huán)體積1 mL，進樣時間1 min。

GC條件：氣化室溫度250 ℃，柱溫為初始溫度40 ℃(保持2 min)，以8 ℃/min升溫至250 ℃，分流模式進樣，分流比5∶1，氮氣流速1 mL/min。MS條件：EI電離方式，電子能量為70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，質(zhì)譜掃描模式定性，掃描范圍m/z30～500，溶劑延遲1.5 min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

分離的揮發(fā)性化合物的鑒定通過儀器自帶的NIST14和Flavor4數(shù)據(jù)庫檢索，結(jié)合正構(gòu)烷烴標準品計算保留指數(shù)(Kova’ts retention indices,KI)，并與質(zhì)譜庫中的保留指數(shù)比對進行定性分析。峰面積歸一法獲得各揮發(fā)性成分的相對含量。使用Matlab R2016a(美國Mathworks公司)和SPSS 22.0(IBM SPSS statistics)軟件對數(shù)據(jù)進行主成分分析(PCA)和聚類分析(CA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SHS-GC-MS實驗條件的優(yōu)化結(jié)果

為獲得更豐富的揮發(fā)性物質(zhì)，本文對樣品量(2.00、7.00、13.00 g)、平衡時間(10、20、30 min)、平衡溫度(60、70、80 ℃)、分流比(不分流、5∶1、10∶1)進行了對比優(yōu)化，比較結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，平衡時間20 min，平衡溫度80 ℃，樣品量取13.00 g和分流比為5∶1時獲得匹配度>75%的色譜峰數(shù)目最多。

圖1 不同實驗條件對蜂蜜揮發(fā)性成分色譜峰數(shù)目的影響Fig.1 Effects of different experimental conditions on the number of peaks of volatile components in honey

2.2 蜂蜜揮發(fā)性成分的SHS-GC-MS分析

利用SHS-GC-MS從38份蜂蜜樣品中檢測到23種化合物(見表2)。不同蜜源蜂蜜物質(zhì)組成和相對含量之間存在差異。 4種蜂蜜中都檢出了苯乙醛(38個樣品中有19個樣品檢出)和鄰苯二甲酸二異丁酯(38個樣品中有25個樣品檢出)，且苯乙醛(32.72%)平均相對含量高于鄰苯二甲酸二異丁酯(5.53%)。

在17份油菜蜜中共檢測出16種揮發(fā)性物質(zhì)，3-苯丙酸乙酯(14)和2-甲基丁醇(12)是在樣品中檢出較多的物質(zhì)(括號中的數(shù)字表明檢出該物質(zhì)的樣品數(shù)，以下同)，3-苯丙酸乙酯在其他蜂蜜中未檢出，而在油菜蜜中出現(xiàn)頻率比較高，可作為油菜蜜的典型代謝物，Seisonen等[20]也從產(chǎn)于愛沙尼亞的帚石南蜜和油菜蜜中檢出了這種物質(zhì)。Siegmund等[21]的報道也同樣檢測到了乙酸、苯甲醛和苯乙醛等物質(zhì)。油菜蜜中平均相對含量較高的物質(zhì)依次是乙酸乙酯(56.12%)、2-甲基丁醇(10.48%)和乙酸(4.71%)。與其他幾種單花蜜相比，油菜蜜中缺乏反式玫瑰醚，脫氫芳樟醇等，這作為油菜蜜的特征之一，與文獻報道相一致[16]。

在8份椴樹蜜中共檢測出9種揮發(fā)性物質(zhì)，平均相對含量較高的物質(zhì)依次是1-異丙烯基-3-甲基苯(10.46%)、反式玫瑰醚(9.35%)和苯乙醇(3.31%)，其中1-異丙烯基-3-甲基苯(8)和反式玫瑰醚(6)在其他單花蜜中未檢出且頻率相對較高，可作為椴樹蜜的典型物質(zhì)。裴高璞[22等的研究認為反式玫瑰醚是椴樹蜜的特有成分。

在8份荊條蜜中共檢測出12種揮發(fā)性物質(zhì)，這12種物質(zhì)均在其他蜂蜜中檢出，其中苯乙醛存在于所有荊條蜜中，含量高達(56.99%)，然而其他三個蜜種的11個樣品中也有檢出，因此未發(fā)現(xiàn)荊條蜜的典型代謝物質(zhì)。

在5份洋槐蜜中共檢測出7種物質(zhì)，其中鄰苯二甲酸二異丁酯和苯甲醛存在于所有洋槐蜜樣品，但前者在其他三個蜜種的20個樣品中，后者在5個荊條蜜和2個油菜蜜樣品中也有檢出，因此同樣未發(fā)現(xiàn)典型代謝物質(zhì)。洋槐蜜中平均相對含量較高的物質(zhì)依次是乙酸乙酯(24.66%)、鄰苯二甲酸二異丁酯(16.29%)和(S)-氧化芳樟醇(7.25%)。

我們還發(fā)現(xiàn)了部分成分僅出現(xiàn)在某一兩個蜂蜜樣品中，如(1S,4S,4aR)-4-異丙基-1,6-二甲基-1,2,3,4,4A,7-六氫萘(2.04%)、乙酸葉醇酯(2.45%)和辛酸乙酯(0.10%)等，且含量相對較低，可能與蜂蜜的污染或發(fā)酵等有關(guān)[23]。

表2 SHS-GC-MS檢測不同蜂蜜樣品的揮發(fā)性物質(zhì)組成

續(xù)表2(Continued Tab.2)

編號No.RT化學式Chemical formula化合物CompoundsKI相對含量Relative percent(%)油菜蜜(n=17)Rape honey椴樹蜜(n=8)Linden honey荊條蜜(n=8)Chaste honey洋槐蜜(n=5)Acacia honey1310.59C10H122,4-二甲基苯乙烯a,bBenzene,1-methyl-4-(1-methylethenyl)-1 096NDND0.21～2.47 (4)ND1410.84C8H14O2乙酸葉醇酯a,b3-Hexen-1-ol,acetate,(Z)-1 1102.45 (1)NDNDND1510.86C10H16O脫氫芳樟醇a,bHotrienol1 110ND6.46～11.85 (3)1.58～6.25 (4)ND1610.98C10H18O反式玫瑰醚a,btrans-Rose oxide1 117ND3.85～24.20 (6)NDND1711.13C8H10O苯乙醇a,bBenzeneacetaldehyde1 123ND0.62～7.90 (4)0.24～0.85 (4)2.50～3.21 (2)1812.18C9H10O2苯甲酸乙酯aBenzoic acid,ethyl ester1 1930.10～0.40 (7)NDNDND1912.58C10H20O2辛酸乙酯aOctanoic acid,ethyl ester1 2010.10 (1)NDNDND2013.74C10H12O2乙酸苯乙酯a,bAcetic acid,2-phenylethyl ester1 2661.30～3.20 (8)10.88～18.60 (2)0.85～4.32 (2)ND2115.32C11H14O23-苯丙酸乙酯a,bBenzenepropanoic acid,ethyl ester1 3590.30～1.71 (14)NDNDND2219.39C15H24(1S,4S,4aR)-4-異丙基-1,6-二甲基-1,2,3,4,4A,7-六氫萘aCubenene1 6232.04 (1)ND2.05 (1)ND2322.84C16H22O4鄰苯二甲酸二異丁酯a,b1,2-Benzenedicarboxylic acid,bis(2-methylpropyl) ester1 8830.28～12.51 (11)4.02～4.44 (2)0.55～4.50 (7)0.87～26.13 (5)

注：a:GC-MS鑒定;b:NIST譜庫檢索鑒定;KI:根據(jù)正構(gòu)烷烴計算的保留指數(shù);ND:未檢測到;括號內(nèi)數(shù)值為該物質(zhì)檢出樣本數(shù)。

Note:a:Identification by GC-MS;b:Identification according to NIST Mass Spectral Library;KI:Kova’ts retention indices calculated by n-alkanes;ND:not detected;The value in brackets indicates the number of samples detected.

2.3 主成分分析和聚類分析

利用Matlab R2016a軟件對4種不同蜜源的38份蜂蜜樣品的氣相匹配數(shù)據(jù)進行PCA分析，計算特征值、特征向量以及累計貢獻率。 圖2(A)，2(B)是PCA 得分圖，PC1、PC2 和 PC3 分別代表了變量總方差的41.0%、20.6%和15.7%，累積貢獻率達77.3%，包含了分析樣品的絕大部分信息。圖2(C)是PCA分析相應(yīng)的載荷圖，其中貢獻較大的物質(zhì)有乙酸乙酯，苯乙醛，1-異丙烯基-3-甲基苯，反式玫瑰醚，鄰苯二甲酸二異丁酯，苯乙醇，脫氫芳樟醇和乙酸苯乙酯等。PCA二維圖和三維圖表明，不同蜜源之間可以很好地區(qū)分。結(jié)果表明，SHS-GC-MS結(jié)合PCA可以有效區(qū)分4種不同蜜源蜂蜜。

圖2 4種不同蜜源蜂蜜的38份蜂蜜樣品的PCA得分圖(PC-2維圖(A)、PC-3維圖(B))和載荷圖 (C)Fig.2 Score plots ( (A) principal component PC-two-dimensional,(B) PC-three-dimensional ) and loading plots (C) of 38 honey samples from 4 different honey sources by principal component analysis

利用SPSS 22.0軟件對4種不同蜜源的38份蜂蜜樣品的氣相匹配數(shù)據(jù)進行CA分析，采用平方Euclidean距離測量方法，結(jié)果如圖3所示。當臨界值為10時38份蜂蜜樣品被分為4類，不同蜜源的蜂蜜可以很好的分別各自聚為一類。聚類分析結(jié)果與PCA分析結(jié)果一致，結(jié)果表明，SHS-GC-MS結(jié)合CA的方法有效，分類正確率達到了100%。

圖3 4種不同蜜源蜂蜜的38份蜂蜜樣品的CA樹形圖Fig.3 Dendogram of 38 honey samples from 4 different honey sources by cluster analysis

3 結(jié)論

本文采用優(yōu)化的SHS-GC-MS從4種蜂蜜中共鑒定出23種化合物，其中3-苯丙酸乙酯可作為油菜蜜的典型代謝物，1-異丙烯基-3-甲基苯和反式玫瑰醚可作為椴樹蜜的典型代謝物，荊條蜜和洋槐蜜未發(fā)現(xiàn)典型代謝物。由于蜂蜜的化學組成極其復(fù)雜，不僅受蜜源影響，同一種蜜源產(chǎn)地不同，甚至同一產(chǎn)地在不同氣象條件下，也會導(dǎo)致蜂蜜化學組成的變化，所以，單一的揮發(fā)性物質(zhì)很難將不同蜜源的蜂蜜分開，基于多變量分析的PCA和CA有助于對不同蜜源蜂蜜樣品進行區(qū)分。采用SHS-GC-MS結(jié)合多變量分析為蜜源揮發(fā)性物質(zhì)組成和蜂蜜溯源、品質(zhì)提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。