梨火疫病抑菌制劑的室內(nèi)篩選

梁慧敏，劉 君，王希東，楊治月，李敬樺

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學林學與園藝學院，烏魯木齊830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，烏魯木齊830052 )

0 引 言

【研究意義】梨火疫(Fire blight)是引起梨、蘋果等薔薇科植物發(fā)病的最具毀滅性的細菌性病害之一，梨火疫病[1]是我國對外重大檢疫性病害之一。在1951～1960 年間，該病害造成美國平均每年因該病經(jīng)濟損失400萬美元[2]。該病侵染情況復雜[3]且市場需求種植的品種多為感病品種，目前該病害還沒有被有效地控制，防治上較為困難，仍然是大多數(shù)梨和蘋果種植國主要關(guān)注的問題[4]。雖然目前我國還沒有梨火疫病發(fā)生的報道，但梨火疫病的人為和自然傳播已對我國構(gòu)成了潛在戚脅[5]。仍需嚴格地做好疫情調(diào)查和植物檢疫，篩選高效防病藥劑，科學防控該病的發(fā)生與為害，對我國植物檢疫及梨和蘋果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】自1974年以來，用于防治梨火疫病的化學藥劑，主要是抗生素類化合物和銅制劑類，被主要用于在該病害花期防治[4,6]；抗生素鏈霉素(Streptomycine)在美國被用于防治該病超過50年后，抗鏈霉素的梨火疫菌株陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)并報道[7-8]。隨著侵染生態(tài)學及植物病原分子生物學研究的開展，有關(guān)于田間拮抗細菌抑制梨枝枯病的報道[9-10]，同時催生出商業(yè)化的生防菌類生物制劑，例如Psedomonafluorescens的ASO6菌株已經(jīng)用于梨火疫病的田間生物防治[11]?！颈狙芯壳腥朦c】梨火疫病傳入我國的風險很大，且該病害化學防治的研究國內(nèi)目前尚未見報道，加強對該病害的檢疫控制的同時應該要做好防控準備。研究收集針對細菌的各類抑菌制劑，篩選高效抑制該病菌的抑菌制劑?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以梨火疫模式菌株NCPPB1665為研究對象，通過最低抑制濃度法在抑菌制劑中做初步篩選，通過抑菌實驗，篩選出有效抑制梨火疫病菌的防治制劑，為植物檢疫防控策略提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

梨火疫菌模式菌株NCPPB1665，由南京農(nóng)業(yè)大學胡白石教授饋贈。

1.1.2 主要試劑

供試抑菌制劑共30種，其中氧化制劑1種、植物源制劑 1種、無機類制劑 5種、抗生素類制劑6種、微生物制劑5種、有機類制劑6種，內(nèi)吸性制劑6種。表1

表1 供試抑菌制劑
Table 1 List of antibacterial agents and microorganism preparations tested

制劑Bactericides類型Types劑型Dosage forms生產(chǎn)廠家Manufacturers1.8%辛菌胺醋酸鹽(1.8%Symplectic bacteria amine acetate)內(nèi)吸性水劑( AS)西安嘉科農(nóng)化有限公司20%噻菌銅(20%Thiodiazole-copper)內(nèi)吸性懸浮劑( SC)浙江龍灣化工有限公司43%戊唑醇 (43%Tebuconazole)內(nèi)吸性懸浮劑( SC)江蘇龍燈化學有限公司50%多菌靈(50% Carbendazim)內(nèi)吸性可濕性粉劑(WP)江蘇藍豐生物化工股份有限公司20%葉枯唑(20%Bismerthiazol)內(nèi)吸性可濕性粉劑(WP)安徽省銅陵福成農(nóng)藥有限公司20%三唑酮(20% Triadimefon)內(nèi)吸性乳油( EC)河北神華藥業(yè)有限公司3%噻霉酮(3%Benziothiazolinone)有機雜環(huán)類微乳劑(ME)江蘇輝豐股份有限公司3%噻霉酮(3%Benziothiazolinone)有機雜環(huán)類可濕性粉劑(WP)陜西西大華特科技實業(yè)有限公司40%噻唑鋅(40%Zinc-thiazole)有機鋅懸浮劑( SC)浙江新農(nóng)化工股份有限公司33.5%喹啉銅(33.5%Copper quinolate)有機銅懸浮劑( SC)浙江海正化工股份有限公司12%松脂酸銅(12%Rosin acid copper)有機銅懸浮劑( SC)廣東植物龍生物技術(shù)股份有限公司30%壬菌銅(30%Nonyl bacteria copper)有機銅微乳劑(ME)西安近代農(nóng)藥科技股份有限公司29%石硫合劑(29%Iime sulphur)無機硫水劑( AS)山東東信生物農(nóng)藥有限和公司70%堿式硫酸銅(70%Basic chrome sulphate)無機銅水分散粒劑(WG)美國仙農(nóng)有限公司80%波爾多液(80% Bordeaux mixture )無機銅可濕性粉劑(WP)青島藍貓化工有限公司46%杜邦可殺得(Dupont kill)無機銅水分散粒劑(WG)上海生農(nóng)生化制品有限公司6%烯硫酸銅(6%Copper sulfate)無機銅可濕性粉劑(WP)河南倍爾農(nóng)化有限公司50%春雷王銅(50%Kasumin copper)抗生素、無機銅可濕性粉劑(WP)江門市植保有限公司2%春雷霉素(2%Kasugamycin)抗生素水劑( AS)江門市植保有限公司2%春雷霉素(2%Kasugamycin)抗生素水劑( AS)河北國欣諾農(nóng)生物技術(shù)有限公司8%寧南霉素(8%Ningnanmycin)抗生素水劑( AS)德強生物股份有限公司農(nóng)用青霉素(Agricultural penicillin)抗生素水劑( AS)中華人民共和國農(nóng)業(yè)部35%多抗霉素B(35%Resistance to doxorubicin)抗生素水劑( AS)鄭州意爾達化工有限公司21%過氧乙酸(21% Peroxyacetic acid)氧化殺菌劑水劑( AS)石家莊寶豐化工有限公司80%乙蒜素(80%Ethylicin)植物源殺菌劑乳油( EC)登封市金博士農(nóng)藥化工有限公司多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)微生態(tài)制劑水劑( AS)科諾生物有限公司枯草芽孢菌(雨之露) (Bacillus subtilis)微生態(tài)制劑可濕性粉劑(WP)建華植保有限公司枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)微生態(tài)制劑可濕性粉劑(WP)德強生物股份有限公司熒光假單胞桿菌(Fluorescence pseudomonas)微生物制劑可濕性粉劑(WP)廣東真格生物科技有限公司BMC微生物菌劑(BMC microbiological preparation)微生態(tài)制劑可濕性粉劑(WP)湖北吾爾力生物工程股份有限公司

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及菌懸液的制備

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NA：牛肉浸膏3 g，酵母浸膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，17 g瓊脂，加無菌水至1 L，調(diào)pH至7.0～7.2，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。供試菌在NA固體培養(yǎng)基上28℃恒溫過夜培養(yǎng)。用無菌接種環(huán)刮下培養(yǎng)好的菌苔轉(zhuǎn)入含無菌水試管中，重懸，根據(jù)菌種在600 nm的吸光度值與菌液濃度之間的線性關(guān)系(y=0.115ln(x)-1.90[12])用分光光度計調(diào)至OD600達0.2，此時菌懸液濃度為108CFU/mL。

1.2.2 篩選抑菌制劑的最低抑制濃度

采用含毒介質(zhì)-最低抑制濃度法[13]獲取

利用梨火疫模式菌株NCPPB1665進行藥劑最低抑制濃度的初篩。按照各藥劑的使用說明書對每種藥劑進行濃度梯度稀釋，初試在不同濃度下各藥劑的抑菌效果，取6個不同的藥劑濃度進行最低抑菌濃度測定，每個濃度至少3個重復。將供試的農(nóng)藥制劑配制成濃度為50 mg/mL的藥劑母溶液，待滅菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基溫度降至55℃左右時，加入一定體積藥液，混合均勻即制備成一定工作濃度的含藥劑培養(yǎng)基。用移液器將0.5 μL菌懸液接種于培養(yǎng)基上，每個皿上按三個方位點接種三點，對照用相同體積的菌液接種未加藥劑的培養(yǎng)基作對照，重復3次。培養(yǎng)基置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察記錄菌落生長情況。

未能辨別出接菌點或有接菌點但干縮的，菌落生長受抑制，以“-”表示；菌點能夠生長并保持濕潤，以“+”表示。記錄每種藥劑在每個濃度下菌落不能生長的最低藥劑濃度標記為C-，根據(jù)式C′=(C++C-)/2，計算實驗中的最低抑菌濃度C′，3次實驗結(jié)果的均值代表該藥劑最低抑菌濃度。

1.2.3 抑菌圈法[14]

通過最低抑制濃度法在模式細菌上初篩獲得的抑菌制劑，用于抑菌圈實驗。具體操作如下：制備NA 培養(yǎng)基平板，將100 μL菌懸液加入皿中并用涂布器涂勻，待菌液干燥后，用移液器吸取8 μL的藥劑點在培養(yǎng)皿中央，以加入無菌水的處理作為對照，每個處理重復 3 次，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，拍照記錄，使用ImageJ軟件計算抑菌圈的直徑；以藥劑濃度的對數(shù)為橫坐標，抑菌圈的平均直徑為縱坐標，用Excel 2019 軟件求得各抑菌制劑對細菌的毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)r，并以抑菌圈直徑達到一定值(研究以6 mm為基準)時的藥劑有效濃度進行毒力比較[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0 軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌制劑對梨火疫模式菌株NCPPB1665的最低抑制濃度篩選

研究表明，在所選的30種市售農(nóng)藥中有17種藥劑對菌株NCPPB1665有抑制作用。6種抗生素類型中5種主要以抗生素為有效成分的藥劑均無抑制效果；6種內(nèi)吸性抑菌制劑僅1.8%辛菌胺醋酸鹽有作用；6種有機制劑中有5種具有抑制作用；5種無機制劑中有4種具有抑制作用；5種微生物制劑中有4種具有抑制作用，無機銅復配抗生素50%春雷王銅和植物源殺菌劑80%乙蒜素和氧化殺菌劑21%過氧乙酸均對模式菌有抑制作用。有機類、無機類及微生物類制劑是對模式細菌抑制作用較好的3種類型制劑。除列出的抑菌制劑之外的其它制劑在說明書表述的適用濃度范圍內(nèi)對模式菌株未表現(xiàn)出抑制作用。表2

2.2 不同抑菌制劑對梨火疫模式菌株NCPPB1665的毒力測定

研究表明，17種抑菌制劑對梨火疫模式菌株NCPPB1665的毒力作用中，內(nèi)吸性制劑1.8%辛菌胺醋酸鹽相比其他類型藥劑有效質(zhì)量濃度是最低，表明使用同等劑量時該制劑具有較強的抑菌作用；5種有機類制劑中有機雜環(huán)類制劑3%噻霉酮(ME)和3%噻霉酮(WP)需要的有效質(zhì)量濃度都低于有機銅類制劑30%壬菌銅和12%松脂酸銅及有機鋅類40%噻唑鋅的有效質(zhì)量濃度，顯示使用同等劑量下，噻霉酮具有較強的抑菌作用，壬菌銅的作用次之；4種無機制劑中無機銅類46%杜邦可殺得、80%波爾多液、70%堿式硫酸銅及無機硫類29%石硫合劑均有抑菌作用但使用濃度高、抑菌效果較差；植物源制劑80%乙蒜素、復配藥劑50%春雷王銅以及氧化劑型21%過氧乙酸中抑菌效果最好的是80%乙蒜素，其有效質(zhì)量濃度最低；4種微生物制劑中抑菌效果最后的是熒光假單胞桿菌，相比其它3種微生物制劑所需的實際質(zhì)量濃度及芽孢個數(shù)最少。表3

表2 17種抑菌制劑對梨火疫模式細菌NCPPB1665最低抑菌濃度
Table 2 Minimal inhibitory concentration of 17 antibacterial agents and microorganism preparation to strainErwiniaamylovoraNCPPB1665

藥劑種類Bactericide農(nóng)藥有效濃度Concentration(mg/L)ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ最低抑菌濃度Minimal inhibitory concentrationMIC(mg/L)1.8%辛菌胺醋酸鹽(1.8%Symplectic bacteria amine acetate)65.144.53.63.27a3b3.143%噻霉酮(3%benziothiazolinone,WP)42.8714.286.664.293.33a3.24b3.380%乙蒜素(80%Ethylicin)120724834.413.6a12.8b13.23%噻霉酮(3%benziothiazolinone,ME)6054.55042.937.5a30b33.7550%春雷王銅(50%kasumin copper)1 000333.5151.59675.5a73.5b74.521%過氧乙酸(21% peroxyacetic acid)840381.78190.89123.4880.85a69.93b74.9770%堿式硫酸銅(70%basic chrome sulphate)777.7499.8350166.6134.4a129.5b130.946%杜邦可殺得(Dupont kill)306.82230209.76191.82164.2a158.7b161.4640%噻唑鋅(40%Zinc-thiazole)800571.6444.4400363.6a333.2b34880%波爾多液(80% Bordeaux mixture )800615.2533.6470.4444.8a420.8b432.812%松脂酸銅(12%Rosin acid copper)960720576480a411.48b360523.5630%壬菌銅(30%Nonyl bacteria copper)1 000857.1750666.7600a545.4b572.729%石硫合劑(29%lime sulphur)4 833.33 867.72 9002 521.72 148.1a1 871b2 309.55枯草芽孢桿菌100億芽孢每克(Bacillus subtilis)1 250333250200161a154b157(1.6×109個/L)BMC微生物菌劑(100億有效活菌每克)(Microbiological preparation)16 6672 0001 000500323a313b317(3.2×109個/L)熒光假單胞桿菌3000億芽孢每克(Fluorescent pseudomonas)11 1118 3331 000667556a500b526(1.6×1011個/L)枯草芽孢桿菌(雨之露)1000億芽孢每克(Bacillus subtilis)1 0002501117156a54b55(5.5×1011個/L)

注： a，表示菌落不能生長的最低藥劑濃度 C-；b，表示菌落剛剛能生長的藥劑濃度 C+

Note: a,Represent the Minimal inhibitory concentration of the agent that the colony cannot grow C-;b,Represent the concentration of the agent at which the colony is just starting to grow C+

研究表明，不同濃度的參試抑菌制劑均對模式菌株NCPPB1665具有明顯的抑菌作用，且其中部分濃度間抑制作用顯示極顯著差異，并且對17種抑菌制劑間還呈現(xiàn)出整體顯著性差異，部分抑菌制劑間差異達極顯著。所檢測制劑中對梨火疫菌模式菌株NCPPB1665具有較好抑菌作用的是1.8%辛菌胺醋酸鹽、3%噻霉酮(ME)、3%噻霉酮(WP)、30%壬菌銅、80%乙蒜素和熒光假單胞桿菌。表3

3 討 論

大部分內(nèi)吸性類藥劑(1.8%辛菌胺醋酸鹽除外)及抗生素類藥劑對梨火疫菌株幾乎沒有抑制效果，這些制劑不適用于該病害。根據(jù)毒力回歸方程，在抑菌圈同等效果之下，(有效用量<10 mg/L)辛菌胺醋酸鹽是30種抑菌制劑除微生物制劑外中數(shù)據(jù)理論得出的最有抑菌作用的抑菌劑。辛菌胺醋酸鹽在抑菌方面有相關(guān)機理的研究[16]，該制劑在國內(nèi)防治蘋果腐爛病方面[17]和梨根腐病田間防治方面作用明顯[18]，且它是一種烷基多胺類環(huán)保型、高效廣譜、低毒的殺菌劑，該藥劑持效期長。

最低抑制濃度實驗結(jié)果得到的有較好抑菌作用的制劑主要存在于有機類、無機類及微生物類制劑三種類型中。含有噻霉酮的有機制劑是實驗數(shù)據(jù)結(jié)果抑菌效果排前的制劑，其最低抑制濃度及抑菌圈的結(jié)果均說明，此成分的農(nóng)藥的可濕性粉劑類型效果比微乳劑相對理想，且微乳劑是一種對環(huán)境友好的綠色農(nóng)藥制劑，可取代乳油，并且適用于代替可濕性粉劑劑型的農(nóng)藥原藥新劑型,在環(huán)境友好方面傾向選擇微乳劑型[19]，同時有機雜環(huán)類噻霉酮的藥物機制原理[20]表明該藥劑還可以和多種藥劑復配，如：噻唑鋅，噻菌酮等[21]。

植物源抑菌制劑乙蒜素抑菌效果整體為中上水平，80%乙蒜素是仿生植物源抑菌制劑，系大蒜提取物，低殘留，污染小防治效果佳，目前報道可以防治黃瓜細菌性斑病[22]，且該藥可以與三唑類抑菌制劑混用，防果樹炭疽病、瓜果青枯病等效果能提高40%～75%[23]，也能與壬菌銅進行復配也可提高防治番茄灰霉病的效能[24]。

微生物制劑熒光假單胞桿菌抑菌效果明顯優(yōu)于其它生物制劑。由于菌株能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，可以抗多種植物病害，如熒光假單胞工程改良菌株對黃瓜枯萎病有更好的防治效果[25-26]；室內(nèi)實驗熒光假單胞桿菌的數(shù)據(jù)支持了熒光假單胞A5O6菌株適用于梨火疫病的田間生物防治，但是，熒光假單胞菌對病害的防治作用是否還受其它因素限制，如工程菌中轉(zhuǎn)化子本身的穩(wěn)定性、土壤狀況、氣候條件等；該菌與植物及病原菌之間的關(guān)系是否復雜；不同來源、不同種類、不同生態(tài)環(huán)境中的菌株對病原菌的作用機制是否一致[27]，成了防治中的潛在問題。因此，防治梨火疫病的藥劑篩選還有待進一步田間的深入研究。其次，這次實驗中抑菌效果一般的枯草芽孢桿菌在最低濃度試驗中100、1 000×108/g劑量最低芽孢億數(shù)明顯低于后者，成分相同芽孢桿菌100×108/g單位劑量的相對效果較好。

無機類制劑中無機銅和無機硫，抑菌效果都不理想。銅元素抑菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中是一類重要的殺菌劑，但隨著該類抑菌劑的廣泛使用，有些病害如細菌性果斑病已經(jīng)出現(xiàn)了一些耐銅菌株[28]。無機類制劑在稀釋后化合物為解離狀態(tài)，毒性的陽離子如銅制劑靠釋放出銅離子與細菌內(nèi)物質(zhì)作用，導致病菌死亡，這類制劑在使用時不宜與其他酸性農(nóng)藥混用且陽離子殘留易造成藥害。

4 結(jié) 論

30種抑菌制劑中內(nèi)吸性制劑1.8%辛菌胺醋酸鹽、有機類制劑3%噻霉酮(ME)、3%噻霉酮(WP)、30%壬菌銅、植物源類型制劑80%乙蒜素和微生物制劑熒光假單胞桿菌3 000億芽孢/g等6種抑菌制劑對梨火疫模式菌株NCPPB1665室內(nèi)毒力測定的抑菌效果較好，可為梨火疫病的防治提供參考。