針灸預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用

朱建剛 宋先斌 楊紅娟 翟昌林

[摘?要]?目的?研究針灸預(yù)處理調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法?將45只SD大鼠隨機(jī)分為四組，即：假手術(shù)組（Sham組）、模型組（I/R組）、針灸預(yù)處理組（EP組）、針灸預(yù)處理+LY294002組（EP+LY294002組）。I/R組、EP組、EP+LY294002組分別建立心肌缺血再灌注損傷模型，EP組與EP+LY294002組預(yù)先予以電針“內(nèi)關(guān)穴”處理，EP+LY294002組于手術(shù)前1周皮下注射LY294002試劑。手術(shù)后1周超聲心動(dòng)圖測定各組大鼠心功能，HE染色法觀察心肌組織損傷情況，蛋白免疫印跡法測定Akt通路及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP、Caspase12的表達(dá)情況。結(jié)果?超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示，EP組左心室收縮末期壓力（LVESP）、壓力上升最大速率（dp/dt max）、壓力上升最小速率（dp/dt min）水平均高于I/R組，左心室舒張末期壓力（LVEDP）低于I/R組（均P<0.01），EP+LY294002組LVESP、dp/dt max、dp/dt min均低于EP組，LVEDP高于EP組（均P<0.01）。HE染色示，與I/R組相比，EP組心肌細(xì)胞損傷明顯減輕，少量炎性細(xì)胞堆積，心肌纖維走形較規(guī)律;與EP組相比，EP+LY294002組心肌組織損傷再次出現(xiàn)加重。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示：與I/R組相比，EP組p-Akt表達(dá)明顯增加（P<0.01），與EP組相比，EP+LY294002成功阻斷p-Akt表達(dá)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP、Caspase12表達(dá)顯著回升（均P<0.01）。結(jié)論?針灸預(yù)處理可有效降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而發(fā)揮心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與Akt通路激活相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]?針灸;Akt通路;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;心肌缺血再灌注

中圖分類號(hào)：R542;R245

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1009-816X（2019）02-0120-04

doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2019.02.004

隨著社會(huì)發(fā)展，我國人民飲食結(jié)構(gòu)及工作環(huán)境的改變導(dǎo)致冠心病的發(fā)病率居高不下，心肌缺血最有效的治療方式便是再灌注治療，但是心肌缺血后重新血液灌注會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和功能代謝障礙從而加重臨床癥狀，這一過程稱之為心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）損傷[1，2]。冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)（CABG）、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)（PTCA）、急診溶栓等在治療冠心病的過程中勢必會(huì)引起I/R損傷，因此如何有效抑制心肌缺血再灌注損傷已成為臨床難題[3]。本研究旨在探索針灸預(yù)處理對于心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）相關(guān)的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1?材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)材料：45只雄性SD大鼠購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證為：SCXK（浙）2016—0065，平均體質(zhì)量（250.08±30.11）g，飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物房，充足食水喂養(yǎng);Akt、GRP78、CHOP、Caspase12抗體均購自CST公司，羊抗兔二抗購自谷歌生物公司，Akt通路抑制劑LY294002試劑購自Sigma公司。45只SD大鼠隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組（Sham組）9只、模型組（I/R組）12只、針灸預(yù)處理組（EP組）12只、針灸預(yù)處理+LY294002組（EP+LY294002組）12只。

1.2?方法：（1）Sham組：僅進(jìn)行開胸手術(shù)，穿線但不結(jié)扎左心房（LA）動(dòng)脈，開胸1.5h后關(guān)閉胸腔;（2）I/R組：建立心肌I/R損傷模型;（3）EP組：于手術(shù)前2周進(jìn)行電針大鼠“內(nèi)關(guān)穴”處理，進(jìn)針深度0.4～0.6cm，電流設(shè)定為0.1Ma，頻率設(shè)定為1赫茲，隔日1次，每次針灸15min，共針灸7天。（4）EP+LY294002組：在針灸“內(nèi)關(guān)穴”基礎(chǔ)上，于手術(shù)前1周予以皮下注射LY294002溶液，劑量為4mg/kg每天，連續(xù)注射7天。

1.2.1?心肌I/R損傷模型的建立：參照Dhalla等[4]的方法建立大鼠心肌I/R損傷模型，戊巴比妥鈉（80mg/mL）腹腔注射，待大鼠翻轉(zhuǎn)反射消失后固定于手術(shù)臺(tái)面，予氣管插管后連接大鼠呼吸機(jī)（SAR-830），正壓通氣，每分鐘頻率60次，心前區(qū)備皮，于胸骨左緣1cm處做一縱行切口，依次分離皮下筋膜及肌肉組織，定位第4肋間，有齒鑷提拉心包膜，組織剪做一小切口，鈍性分離，充分暴露心臟，定位于肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間，左心耳往下2～3cm處穿線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，血流阻斷30min后松開結(jié)扎線，予血流再灌注1小時(shí)，I/R損傷模型的建立以心電圖結(jié)果判斷：ST段弓背向上抬高0.5mv定義為心肌缺血，再灌注后抬高的ST段至少下降一半，伴有病理性Q波或心律失常出現(xiàn)。I/R損傷建立后逐層縫合關(guān)閉胸腔，術(shù)后予肌注青霉素100萬單位預(yù)防性抗感染，手術(shù)中死亡大鼠剔除實(shí)驗(yàn)，手術(shù)后繼續(xù)常規(guī)

無特定病原體（SPF）級動(dòng)物房喂養(yǎng)1周后行超聲心動(dòng)圖檢查，而后處死各組大鼠，提取心臟組織進(jìn)一步檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2?HE染色：大鼠處死后，摘除各組大鼠心臟，冰0.9%氯化鈉溶液潤洗后固定于4%多聚甲醛中，組織脫水、石蠟包埋，3uM厚度組織切片，常規(guī)脫蠟，蘇木精染色5～10min，自來水流動(dòng)沖洗，1%鹽酸乙醇中分化，自來水沖洗5min，伊紅染色3min，沖洗后于梯度乙醇脫水，中性樹膠封片后于顯微鏡下觀察拍照（奧林巴斯BX51）。

1.2.3?蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)：取梗死區(qū)心肌組織，以100mg：900ul的比例加入組織裂解液，于冰上勻漿裂解，4℃，12000g/min離心15min，取上清液以BCA法測定蛋白濃度，補(bǔ)充裂解液調(diào)節(jié)各組樣品蛋白濃度一致后加入上樣緩沖液，95℃變性5min后即可用于蛋白電泳，制適宜濃度的分離膠與濃縮膠，待凝固后每組樣品上樣80ug蛋白，60V電泳至marker分離，100V電泳至溴芬藍(lán)跑出后停止，制作轉(zhuǎn)膜三明治夾，100V電壓轉(zhuǎn)膜90min，TBST洗膜后5%脫脂牛奶室溫下封閉1小時(shí)，根據(jù)條帶位置剪膜，分別孵育對應(yīng)一抗：p-Akt（1：1000）、t-Akt（1：1000）、GRP78（1：1000）、CHOP（1：1000）、Caspase12（1：1000），4℃搖床孵育過夜后TBST洗膜，羊抗兔二抗（1：5000）室溫下孵育1小時(shí)，洗膜后予以ECL化學(xué)顯影，Quantity One圖像分析軟件計(jì)算條帶灰度值。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 18.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以（x-±s）表示，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?超聲心動(dòng)圖心功能結(jié)果分析：手術(shù)過程中I/R組大鼠死亡2只，EP組大鼠死亡1只，EP+LY294002組大鼠死亡3只，手術(shù)后2周各組大鼠心功能比較結(jié)果為：EP組LVESP、dp/dt max、dp/dt min水平均高于I/R組，LVEDP低于I/R組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）。EP+LY294002組LVESP、dp/dt max、dp/dt min均低于EP組，LVEDP高于EP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），見表1。

2.2?各組大鼠心臟梗死區(qū)HE染色結(jié)果比較：I/R組大鼠梗死區(qū)心肌組織中大量炎性細(xì)胞浸潤、組織損傷及細(xì)胞水腫明顯;與I/R組比，EP組心肌細(xì)胞損傷明顯減輕，無大片的炎性細(xì)胞堆積，心肌纖維走形較規(guī)整;與EP組比，Akt通路阻斷后，EP+LY294002組心肌組織損傷再次出現(xiàn)加重，圖1。

2.3?蛋白免疫印跡法分析Akt蛋白表達(dá)：與I/R組相比，EP組p-Akt表達(dá)明顯增加（P<0.01），EP+LY294002組p-Akt表達(dá)顯著降低，與各組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），見圖2。

2.4?蛋白免疫印跡法分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)：與Sham組比，I/R組各內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GPR78、CHOP、Caspase12的相對表達(dá)量明顯增高（均P<0.01），EP組相較于I/R組，各內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白相對表達(dá)量均出現(xiàn)明顯降低（均P<0.01）。而EP+LY294002組相較于EP組，各內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的相對表達(dá)量均出現(xiàn)增高（均P<0.01），見圖3。

3?討論

心肌I/R損傷通常會(huì)造成心肌組織不可逆性損傷，心肌組織結(jié)構(gòu)破壞及功能代謝障礙通常較急性心肌梗死發(fā)生時(shí)更為劇烈，患者心源性猝死機(jī)率也更高，因此緩解和治療缺血再灌注損害目前已成為臨床研究熱點(diǎn)[5，6]。

多種疾病的病理生理過程通常都涉及ERS，目前已知I/R損傷必然會(huì)引起心肌細(xì)胞的壞死及凋亡加重，但心肌細(xì)胞的凋亡與ERS發(fā)生的關(guān)系須進(jìn)一步探討。Nickson等[7]研究證實(shí)ERS促進(jìn)劑可顯著促進(jìn)心肌“促凋亡蛋白Bcl-2”的轉(zhuǎn)錄上升，說明ERS與心肌細(xì)胞的凋亡存在正性聯(lián)系。Terai等[8]實(shí)驗(yàn)證實(shí)心肌細(xì)胞在缺血缺氧后Caspase12與CHOP的表達(dá)明顯上升，該過程證實(shí)了心肌梗死中必然伴隨ERS的發(fā)生，從而引起心肌細(xì)胞凋亡;因此抑制ERS可有效減輕心肌梗死所致心肌損傷。Zhao等[9]研究證實(shí)，在心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中添加脂氧素A4可抑制GRP78、CHOP因子的轉(zhuǎn)錄，從而減輕ERS反應(yīng)對缺血缺氧后復(fù)氧的心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)。Yu等[10]對大鼠腹腔注射曲古抑菌素后發(fā)現(xiàn)I/R損傷后的ERS反應(yīng)明顯減弱了。上述研究結(jié)果提示抑制ERS可有效緩解I/R損傷所致的心肌細(xì)胞凋亡及功能障礙，而本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，即通過針灸預(yù)處理可有效降低I/R所致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的指標(biāo)。目前，針灸“內(nèi)關(guān)穴”在改善心肌缺血及其機(jī)制已得到多方面的證實(shí)，如針灸預(yù)處理可有效減少蛋白激酶C的轉(zhuǎn)錄從而部分抑制心交感神經(jīng)的活動(dòng)[11];此外針灸預(yù)處理可促進(jìn)血液中過氧化氫酶表達(dá)增加，一氧化碳釋放增多從而促進(jìn)血管舒張保護(hù)心肌缺血[12];電針預(yù)處理亦可調(diào)節(jié)心肌酶的轉(zhuǎn)錄從而對缺血心肌產(chǎn)生保護(hù)作用[13]。我們先前的研究進(jìn)一步證實(shí)了針灸預(yù)處理可對心肌缺血后的再灌注損傷有相應(yīng)的保護(hù)作用，其機(jī)制與ERS的抑制顯著相關(guān)[14]，然而針灸預(yù)處理如何調(diào)控ERS的發(fā)生發(fā)展而保護(hù)I/R損傷依然尚不明確，有待我們在以后實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行深入探索。本研究通過超聲心動(dòng)圖及HE染色再次證實(shí)了電針預(yù)處理可有效減輕由I/R損傷所導(dǎo)致的心功能損害及心肌組織損傷，當(dāng)使用LY294002對Akt蛋白轉(zhuǎn)錄進(jìn)行阻斷后，針灸對I/R損傷的保護(hù)作用驟然降低，此外通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Akt蛋白表達(dá)抑制后，針灸對I/R損傷所致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、CHOP、Caspase12的抑制作用也明顯減弱。結(jié)合以上結(jié)果本文認(rèn)為：針灸預(yù)處理抑制了I/R損傷所致的ERS的發(fā)生，該種保護(hù)作用可能與針灸預(yù)處理增加了Akt蛋白的表達(dá)相關(guān)。相關(guān)文獻(xiàn)也應(yīng)證了本文結(jié)論：Tao等[15]發(fā)現(xiàn)Apelin-13蛋白可有效拮抗I/R所引起的ERS心肌細(xì)胞凋亡，其中PI3K/Akt通路的活化在其中扮演了重要角色;Yuan等[16]實(shí)驗(yàn)建立了大鼠腦I/R損傷模型，同樣的使用了LY294002后，ERS所致的腦細(xì)胞損傷加重了，說明了PI3K/Akt通路的激活在腦缺血再灌住ERS細(xì)胞損傷中也發(fā)揮了重要作用。因此，Akt信號(hào)通路的活化與ERS的抑制在不同臟器的缺血再灌注損傷中均有密切的關(guān)系。綜上所述，針灸預(yù)處理可有效降低ERS發(fā)揮心肌I/R損傷的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與Akt通路激活相關(guān)，從而為臨床針灸治療心肌I/R損傷提供了重要依據(jù)。

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（收稿日期：2018-11-13）