基于網絡藥理學構建中藥復方改善加速性動脈粥樣硬化的作用研究

馬韻詞，陳 凱，田楠楠，楊丹妮，全東令，管怡晴，吳少瑜，郭志堅△

(1.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院腎內科，廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣州 510515；3.南方醫(yī)科大學藥學院， 廣州 510515)

慢性腎臟病(chronic kidney diseases，CKD)是一類具有高致死率、高致殘率的慢性進展性疾病群，是公認的“全球公共健康問題”[1]。心血管疾病又是影響CKD預后的主要因素之一。慢性腎衰竭患者動脈粥樣硬化的發(fā)生率是同齡健康人群的10～20倍，發(fā)病年齡也有所提前，被稱為“加速性動脈粥樣硬化”[2]。慢性腎衰竭可以導致脂質代謝紊亂，體內炎癥因子的產生以及內皮細胞的損傷，進一步加速動脈粥樣硬化的發(fā)生[3]。近年來，許多研究從中醫(yī)理論角度闡述慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化的病因、病理機制，并且應用中藥復方進行干預，發(fā)現中藥復方具有顯著的療效[4-5]。

中藥復方由兩味或兩味以上的中藥組成，其所含化學成分復雜，藥理作用具有多靶點、多途徑的特點，而且干擾因素眾多，這種復雜性使得中藥藥效物質基礎不明確、作用機制不清楚、缺乏科學、合理、有效和安全的評價體系，從整體到組織器官、細胞和分子水平都很難進行全面系統(tǒng)地研究[6]。而網絡藥理學則融合了系統(tǒng)生物學和多向藥理學的思想，將生物學網絡與藥物作用網絡整合在一起，分析藥物在網絡中的相互作用關系，由傳統(tǒng)的單一靶點轉向綜合性的網絡分析[7]。這與中醫(yī)辨證論治中強調的整體觀有許多相似之處。因此，運用網絡藥理學方法，從中藥中發(fā)現有效成分，進而針對多靶點進行設計，為中藥的現代化研究提供了新思路。

TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)是一個全面的重要成分系統(tǒng)藥理學數據庫，該數據庫將2010版中藥藥典中收錄的499種中藥，通過大量的文獻數據挖掘整合，最終得到每種中藥中所包含的成分數據，同時結合模型預測和已有的實驗數據得到這些中藥分子對應的靶點及疾病信息，并通過靶點與疾病信息的關聯(lián)，形成了一個整體的中藥-活性成分-靶點-疾病相互作用網絡[8]。該數據庫從系統(tǒng)水平研究和分析中藥與機體的相互作用，推動了藥物開發(fā)的發(fā)展，為現代中藥研究的發(fā)展提供了一個新的方法。

本研究基于網絡藥理學的理論，從TCMSP數據庫中篩選出與慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化相關的數據，然后結合中醫(yī)基礎理論構建出新型的中藥復方——益腎降脂方，最后通過動物實驗研究證實該新型復方對于改善慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化的作用。

1 材料與方法

1.1疾病相關候選中藥的篩選 運用網絡藥理學理論和方法從TCMSP數據庫中篩選出能夠治療慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化的候選中藥。首先，從TCMSP數據庫中將所有的中藥、成分、靶點和疾病下載下來，然后將所有的數據導入Cytoscape3.6.1軟件中構建出“中藥-活性成分-人體靶點-疾病”的總網絡圖，再從總網絡的疾病模塊中分離并構建“慢性腎衰竭”和“動脈粥樣硬化”對應的“中藥-成分-靶點-疾病”網絡圖，最后將這兩批數據取交集獲得共同作用于慢性腎衰竭和動脈粥樣硬化的候選中藥。

1.2新型中藥復方的構建 為了使所構建的新型中藥復方既能符合現代的網絡藥理學理論，又能切合傳統(tǒng)中醫(yī)辨證體系，運用中醫(yī)理論對候選中藥進一步進行篩選。傳統(tǒng)中醫(yī)辨證表明，慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化以“氣虛”“痰濕”“血瘀”為主要癥候特點，其中以“氣虛”為主[9-10]，因此根據慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化相應的癥候特點進一步選取補氣、祛濕化痰、活血化瘀等功能的中藥。最后根據中藥配伍原則，以補氣藥為君，祛濕化痰、活血化瘀藥為臣，共同組合成治療慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化的新型中藥復方——益腎降脂方。

1.3實驗動物 選取10周齡的雄性SD大鼠50只，體質量150～200 g，動物皆由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證編號：SCXK(粵)2016-0041，飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級動物房，全部給予高脂飲食并自由飲水。大鼠手術造模期間死亡8只，將剩余42只10周齡的SD大鼠分為6組：對照組、模型組、益腎降脂方低劑量組(2 g/kg)、益腎降脂方中劑量組(4 g/kg)、益腎降脂方高劑量組(8 g/kg)和辛伐他汀組(10 mg/kg)，通過5/6腎臟切除制作慢性腎衰竭模型，對照組給予切開皮膚和肌肉的處理。各組大鼠均通過灌胃給藥，對照組和模型組大鼠給予等量蒸餾水，連續(xù)灌胃12周。喂養(yǎng)過程中模型組大鼠死亡2只，益腎降脂方低劑量組大鼠死亡2只，益腎降脂方高劑量組大鼠死亡1只，辛伐他汀組大鼠死亡1只。

1.4儀器與試劑 中藥免煎顆粒(廣東一方制藥有限公司生產)和辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司生產)均購自南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院。總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、單核趨化蛋白-1(MCP-1)、血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，批號分別為A111-1、A110-1、A113-1、A112-1、H052、H007、H115、C011-1、C013-1、C009-2、C010-2。iMark酶標儀購自美國Bio-Rad公司，3-30K離心機購自德國Sigma公司，彩色多普勒超聲診斷儀購自深圳開立科技有限公司。Leica CM3050S全自動冰凍切片機購自德國Leica公司。

1.5大鼠超聲心動圖檢測 灌胃12周后，將大鼠用氨基甲酸乙酯麻醉(20%)，剪取胸前的被毛，使用超聲多普勒系統(tǒng)獲得收縮期峰值流速(peak systolic velocity，PSV)、舒張末期流速(end-diastolic velocity，EDV)和平均流速(mean velocity，MV)。進而根據公式分析相應的阻力指數(resistance index，RI)和搏動指數(pulsatility index，PI)。計算公式如下：

RI=(PSV-EDV)/PSV

PI=(PSV-EDV)/MV。

1.6血管組織形態(tài)學觀察 將大鼠的主動脈取出后放入液氮中，凝結成塊后放入冰凍切片機進行切片，用固定液進行固定，按照油紅O染色試劑說明染色、水洗、復染、水洗、透明、中性樹膠封固，光鏡下觀察血管組織的病理學變化。

1.7血清學指標的檢測 各組大鼠灌胃12周后從尾靜脈取血，全血樣本在室溫下靜置30 min，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，收集血清并按照生化試劑盒說明書檢測大鼠血清中相關指標(TC、TG、LDL-C、HDL-C、TNF-α、IL-6、MCP-1、Scr、BUN、ALT和AST)。

2 結 果

2.1疾病相關候選中藥的篩選 將TCMSP數據庫中499味中藥、29 384種中藥成分、3 311個疾病靶點以及837種疾病導入Cytoscape3.6.1軟件中構建出“中藥-成分-靶點-疾病”的總體網絡圖。然后分別從總網絡中分離出“慢性腎衰竭”和“動脈粥樣硬化”對應的兩個子網絡圖(圖1)，最后將兩個網絡篩選出來的中藥取交集即得到能共同作用于慢性腎衰竭和動脈粥樣硬化的候選中藥(表1)。

2.2益腎降脂方的構建 根據傳統(tǒng)中醫(yī)辨證理論，慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化屬于氣虛、痰濕、血瘀的病理癥候，因此分別從以上篩選出的藥物中進一步選取含有補氣益腎功效的杜仲、淫羊藿，搭配上祛濕化痰的沙棘、活血化瘀的丹參，外加甘草進行調和，最終組成了治療慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化的中藥復方，并命名為益腎降脂方。其中杜仲、淫羊藿為君藥，可補氣益腎；丹參、沙棘為臣藥，可活血祛濕；甘草調和諸藥。以上5味中藥搭配，可有效針對慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化的病理特點。

A:“中藥-成分-靶點-疾病”總網絡圖；B:慢性腎衰竭對應的“中藥-成分-靶點-疾病”網絡；C:動脈粥樣硬化對應的“中藥-成分-靶點-疾病”網絡

圖1 “中藥-成分-靶點-疾病”網絡圖

表1 治療慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化的中藥及其藥效成分

表2 益腎降脂方對大鼠主動脈RI和PI的影響

a：P<0.05,與對照組比較；b：P<0.05,與模型組比較

A：對照組；B：模型組；C：益腎降脂方低劑量組；D：益腎降脂方中劑量組；E：益腎降脂方高劑量組；F：辛伐他汀組

圖2 大鼠主動脈油紅O染色結果(×100)

a：P<0.05,與對照組比較；b：P<0.05,與模型組比較

表4 益腎降脂方對大鼠血清TNF-α、IL-6和MCP-1水平的影響

a：P<0.05,與對照組比較；b：P<0.05,與模型組比較

表5 益腎降脂方對大鼠血清Scr、BUN、ALT和AST水平的影響

a：P<0.05,與對照組比較；b：P<0.05,與模型組比較

2.3益腎降脂方對大鼠主動脈血流動力學的影響 與對照組比較，模型組大鼠的RI和PI顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，益腎降脂方中、高劑量組及辛伐他汀組大鼠的RI和PI顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.4益腎降脂方對大鼠主動脈形態(tài)的影響 大鼠高脂飲食喂養(yǎng)12周后，取主動脈制備冰凍切片，油紅O染色后在光鏡下觀察：對照組未見斑塊形成，血管內膜光滑；模型組可見明顯的脂質斑塊且內膜增厚；而益腎降脂方不同劑量組和辛伐他汀組可見斑塊顯著減少，主動脈內膜增厚減輕。與模型組比較，益腎降脂方各劑量組及辛伐他汀組大鼠斑塊面積顯著減少(圖2)。

2.5益腎降脂方對大鼠血清學指標的影響 與對照組比較，模型組高脂飲食喂養(yǎng)12周后血清TC、TG和LDL-C水平顯著升高，而HDL-C水平降低(P<0.05)；與模型組比較，益腎降脂方各劑量組及辛伐他汀組大鼠血清TG、TC和LDL-C水平顯著下降(P<0.05)，HDL-C水平顯著上升(P<0.05)，且益腎降脂方高劑量組與辛伐他汀組比較差異無統(tǒng)計學意義(表3)。模型組血清TNF-α、IL-6和MCP-1水平與對照組比較明顯升高，益腎降脂方治療后能降低TNF-α、IL-6和MCP-1的水平(P<0.05)，且益腎降脂方高劑量組與辛伐他汀組比較差異無統(tǒng)計學意義(表4)。模型組血清Scr、BUN、ALT、AST水平與對照組比較明顯升高(P<0.05)，益腎降脂方低、中、高劑量組血清Scr、BUN、ALT、AST水平與對照組、模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表5。

3 討 論

近年來，中醫(yī)藥治療慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化已經成為研究熱點。憑借現代醫(yī)學手段對中藥單體及復方的研究表明，中藥對慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化有顯著療效。賈英麗等[4]研究發(fā)現，蟲草保腎顆粒劑對慢性腎衰竭患者動脈粥樣硬化具有顯著療效。劉倫志[5]研究發(fā)現，中成藥百令膠囊對慢性腎臟病患者血管內皮功能及動脈粥樣硬化都有顯著的改善作用。然而，中醫(yī)藥治療疾病一直存在著成分不清、具體作用機制不明等問題。

網絡藥理學是一門基于系統(tǒng)生物學的理論，對生物系統(tǒng)的網絡進行分析，選取相應的信號節(jié)點進行多靶點藥物分子設計的新學科，是基于高通量組學數據分析、計算機虛擬計算及網絡數據庫檢索構建生物信息作用網絡，并進一步對網絡進行拓撲結構分析的研究策略。與傳統(tǒng)藥理學最大的區(qū)別在于，網絡藥理學是從系統(tǒng)生物學和生物網絡平衡的角度來闡述疾病的發(fā)生發(fā)展，從改善或恢復生物網絡平衡的整體觀來認識藥物與機體的相互作用，并且指導新藥的發(fā)現。由此可見，網絡藥理學的理念與傳統(tǒng)中醫(yī)藥對疾病診斷的整體觀以及治療的辨證觀相吻合，體現了生物平衡的核心思想，使之成為中藥研究領域的一種新的方法[11-12]。

本實驗研究首次通過下載TCMSP數據庫中的原始數據進行網絡的構建及分析，從總網絡中篩選出針對慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化的中藥，并根據中醫(yī)辨證理論進一步篩選，最終構建出治療慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化的新型中藥復方——益腎降脂方，該方由杜仲、淫羊藿、丹參、沙棘和甘草組成。

益腎降脂方符合現代網絡藥理學理論，組方中的中藥成分能作用于慢性腎衰竭和動脈粥樣硬化的疾病靶點。現代研究表明，杜仲的主要活性成分有環(huán)烯醚萜類、苯丙酸類、黃酮類和三萜類，而這些成分都具有保護心血管的作用，其水提物能夠顯著降低脂肪酸的合成，降低3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)，提高HDL-C的水平，降低血漿TC和TG水平[13]。淫羊藿的提取物具有抗血管氧化、抑制心血管系統(tǒng)的炎性反應的作用[14]。丹參中的主要活性成分有丹參酮Ⅰ、ⅡA、ⅢB，其中丹參酮ⅡA可以抑制血管平滑肌細胞增殖和炎性反應，通過PI3K/Akt/mTOR信號通路調控內皮細胞的氧化應激損傷，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用[15]。沙棘黃酮具有一定的抗氧化作用，可以降低NADPH氧化酶亞基Nox4以及氧化低密度脂蛋白水平，從而減少血管的損傷程度[16]。甘草中的甘草酸具有調節(jié)血脂，抑制氧化應激的作用，對于慢性腎臟病和心血管疾病具有一定的防治作用[17]。

另外，益腎降脂方的組成藥物又符合傳統(tǒng)中醫(yī)辨證理論，據《中藥大辭典》中記載，杜仲具有補肝腎、強筋骨、健脾益腎之功；淫羊藿可溫腎助陽、祛風除濕，用于腰膝酸軟、小便淋瀝、風濕痹痛；丹參善通血祛瘀、通經止痛，有活血祛瘀、通絡止痛之功；沙棘能散瘀血、流利經脈，有活血舒經、養(yǎng)血調經之功效；甘草有中和、祛痰止咳、解毒、調和諸藥之功。諸藥共用，可針對慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化氣虛、血瘀、痰阻的病理特點。

本研究選取10周齡的SD大鼠，通過5/6腎切除術加高脂飲食構建慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化大鼠模型，給予不同濃度的益腎降脂方進行治療，同時給予陽性藥辛伐他汀進行對比分析，評價其對慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化的療效。通過超聲心動圖檢測得到的大鼠主動脈RI和PI，二者是用于評估主動脈阻力情況的重要指標，由于舒張末期血流速度明顯升高，常見于動脈粥樣硬化患者，因此對評估主動脈內斑塊的形成有重要意義[18-19]；主動脈油紅O染色觀察大鼠主動脈內斑塊形成情況；由于加速性動脈粥樣硬化與血脂以及炎性反應緊密相關[20-21]，因此進一步檢測了TC、TG、LDL-C、HDL-C、TNF-α、IL-6和MCP-1的水平。結果表明，與對照組大鼠相比，模型組大鼠的主動脈RI和PI顯著升高，主動脈血管壁斑塊顯著增多，血清中TC、TG、LDL-C、TNF-α、IL-6和MCP-1顯著升高，HDL-C顯著降低，而經過益腎降脂方治療后有效地逆轉了上述指標的改變。此外，本研究對各組大鼠的肝、腎功能進行檢測，結果顯示益腎降脂方治療慢性腎衰竭大鼠后，腎功能損害得到部分逆轉，且無肝臟毒性。

本研究運用了網絡藥理學技術構建了新型中藥復方，并通過動物實驗驗證其有效性，為研發(fā)中藥復方開辟了新的途徑，為治療慢性腎衰加速性動脈粥樣硬化提供了新的方法，有利于推動中藥現代化的發(fā)展。本研究目前只證實了益腎降脂方對于慢性腎衰竭加速性動脈粥樣硬化的影響，但未闡明其具體作用機制，因此，后續(xù)擬運用血清藥理學理論和反向分子對接技術分別找出該組方的活性成分及其作用的疾病靶點，從而對其作用機制進行進一步的探索。