YWHAE在大腸癌中的表達及臨床意義

吳昕陽,李麗紅,王晶瑩,謝 風,何成彥,方 玲

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130033)

酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶活化蛋白(YWHAE)，也稱為14-3-3ε是14-3-3家庭的成員。這個家族的成員是約30 kDa酸性多肽，具有高度調(diào)節(jié)多種細胞功能的保守序列，包括細胞周期調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導、粘附和惡性轉(zhuǎn)化[1]。14-3-3蛋白是真核生物體內(nèi)存在的可溶性酸性蛋白,它通過與靶蛋白結合,調(diào)節(jié)靶蛋白來發(fā)揮其生理學的功能.14-3-3蛋白最初由Moore和Perez于1967年在牛腦中分離的出來的，被認為是細胞分裂和凋亡中的關鍵調(diào)節(jié)和抗凋亡蛋白[2]。在哺乳動物細胞中，已鑒定出14-3-3家族的七種同種型(,?,?,?,,和)[3]。研究表明，在14-3-3蛋白家族中，14-3-3δ亞型具有抑制腫瘤活性的特點,而其他亞型蛋白則具有促癌活性。YWHAE與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，主要在腫瘤細胞生長、細胞周期、細胞凋亡、擴散遷移及信號轉(zhuǎn)導等途徑發(fā)揮作用[4]。YWHAE在結直腸癌細胞，腎癌細胞以及胃癌組織中發(fā)揮著突出的作用。有研究表明，Nagappan等人觀察到感染幽門螺旋桿菌的胃黏膜層組織中的YWHAE的表達顯著增加，表明YWHAE與幽門螺旋桿菌導致的相關疾病有關[5]。盡管14-3-3蛋白的不同亞型在各種腫瘤的分布與作用不盡相同.但是越來越多的文獻報道認為,YWHAE在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到一個很重要的作用。我們采用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用和蛋白質(zhì)印記技術，檢測YWHAE在結直腸癌(CRC)中的表達情況。并初步探討了YWHAE在CRC中的潛在的分子機制，為臨床診療工作提供新的腫瘤標志物及治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

采集吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院26例結直腸癌患者手術切除的新鮮標本，所有這些病例經(jīng)病理診斷為腺癌。同時，取距離癌組織10 cm以上的癌旁組織，所有患者術前均未接受放化療。待標本離體后，液氮速凍。-80℃冰箱內(nèi)保存。所有組織均經(jīng)過吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理審查委員會批準后方可用于研究。

1.2 試劑與儀器

二硫代蘇糖醇(DTT)、TPCK修飾的測序級胰酶購自于promega。DNA酶、RNA酶均購自于Sigma公司。Thermo Fisher Scientific公司購置的LTQXL離子肼質(zhì)譜儀。液相色譜分析儀由安捷倫公司提供。蛋白質(zhì)定量試劑盒購置于Bio-Rad公司。胰酶、蛋白裂解液購于beyotime公司。超凈工作臺購于蘇州凈化設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1組織蛋白的提取、測定蛋白濃度及電泳分離 分別取出液氮保存的26對組織標本20 mg后，在勻漿器中研磨。然后利用蛋白提取試劑盒提取總蛋白質(zhì)。使用二辛可寧酸蛋白定量試劑盒，在UV-2000型分光光度計的590 nm處比色，以牛血清白蛋白含量為橫坐標，光吸收值為縱坐標繪制標準曲線，根據(jù)樣品的吸光度計算出樣品的蛋白質(zhì)含量(mg/ml)。將剩余樣品加入4×上樣緩沖液，100℃加熱10 min后，用聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE)進行電泳蛋白分離。

1.3.2組織蛋白的還原、烷基化和胰蛋白酶消化 將凝膠帶切成20 mm×2 mm的條帶，加入10 mM DTT，56℃避光還原1 h。待反應物降至室溫后，加入25 mM的碘乙酸溶液，使其烷基化，室溫下避光反應20 min。最后，按1∶50(胰酶:蛋白質(zhì))的比例向混合物中加入測序級胰酶，在37℃酶切5 h,酶切后樣品用真空抽干后分裝，-80℃保存。

1.4 液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術分析、數(shù)據(jù)庫搜索以及蛋白質(zhì)鑒定

本研究使用6550 iFunnel四級桿-飛行時間液相色譜-質(zhì)譜儀聯(lián)用儀進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集。液相色譜采用溶液A:0.1%甲酸和溶液B:90%乙腈的梯度流動相，在流速為0.5 μl/min的75 μm×150 mm分離柱上分離富集肽(0-2 min,0%-3%B;2-70 min,3%-35%B;70-75 min,35%-45%B;75-85 min,45%-95%B;85-88 min,95%-103% B.)。分離的多肽在C18色譜柱上富集后，通過雙擊離子漏斗與前端的六孔毛細管的配合，高效的將多肽導入到進入質(zhì)譜儀進行分析。質(zhì)譜儀氮氣保持在250℃，流量為9L/min；質(zhì)量范圍為50-3000(m/z)，掃描速率為4譜/秒，掃描方式為數(shù)據(jù)依賴方式(DDA)。將獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)傳輸?shù)劫|(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件，在SwissProt數(shù)據(jù)庫中的‘人類’進行檢索。多肽>2的蛋白質(zhì)譜圖進行數(shù)據(jù)庫檢索,對相關蛋白進行鑒定。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法試驗

對選定的目標蛋白YWHAE進行蛋白質(zhì)印跡試驗。30 μg的蛋白樣品在10%的SDS-PAGE凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉2 h。PVDF膜在4℃的溫度下與YWHAE和β-Actin一抗孵育過夜，再用1∶2 000辣根過氧化物酶結合的二級抗體室溫下孵育1 h。最后，蛋白條帶以化學發(fā)光法顯色獲得。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 結直腸癌組織酶解產(chǎn)物中表達蛋白的鑒定

酶解產(chǎn)物進行液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析，得到多肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索得到肽段和蛋白的鑒定信息。經(jīng)鑒定，其中腫瘤組織與癌旁健康組織中共得到686個多肽種類,483個蛋白質(zhì)種類。

2.2 大腸癌組織與癌旁健康組織差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析

應用譜圖計數(shù)法，根據(jù)鑒定蛋白的二級質(zhì)譜圖數(shù)目與蛋白豐度呈正相關的原理，對質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)進行定量分析。將兩樣品中蛋白譜圖數(shù)的比值≥2視為表達具有差異。結果表明，共有68種差異表達蛋白，其中42種蛋白在腫瘤組織中表達上調(diào)，26種蛋白在腫瘤組織中表達下調(diào)(所有P<0.05)。本文重點研究上調(diào)表達的YWHAE，其質(zhì)譜結果見圖1。

圖1 YWHAE質(zhì)譜圖

2.3 蛋白印跡實驗比較YWHAE在結直腸癌組織與癌旁組織的表達

通過蛋白質(zhì)印跡法檢測結直腸癌及癌旁組織中YWHAE蛋白的表達。如圖2所示，YWHAE在結直腸癌中明顯上調(diào)表達,進一步驗證了液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術的結果。

A:大腸癌組織;B:大腸癌癌旁組織

3 討論

研究表明，YWHAE在包括胃癌[6]、肝癌[7]、腎癌[8]等多種腫瘤中表達顯著增高，高表達的YWHAE可以促進細胞的增殖、遷移和抑制凋亡。其機制可能是通過抑制YWHAE基因減少胞內(nèi)線粒體、通過競爭性抑制劑破壞YWHAE蛋白配體關聯(lián)等相關。Ko等[7]通過對114例肝癌病人的組織診斷發(fā)現(xiàn)，YWHAE的高表達與肝癌的遷移有關。Liang等[8]發(fā)現(xiàn)YWHAE上調(diào)腎臟癌組織是與其對應的腎組織的1.44倍，并且體外YWHAE的過表達可以有限地促進腎腫瘤細胞的異常生長。有文獻表明，YWHAE蛋白的過度表達促進了CagA對NF-êB的激活；相反，YWHAE蛋白的敲除抑制了CagA對NF-êB的激活這些結果表明CagA增強YWHAE介導的NF-êB反式激活，為CagA誘導的幽門螺桿菌相關腫瘤發(fā)生的分子機制提供了新的線索。在SGC7901細胞中，Yan等人發(fā)現(xiàn)YWHAE的過度表達激活了ERK / MAPK通路并增加了細胞增殖，遷移和侵襲，表明YWHAE的原始作用[5]。在體外，我們證明了YWHAE可以通過下調(diào)MYC和CDC25B，誘導細胞停滯和抑制細胞入侵和遷移。另一方面，MYC致癌基因能誘導胃癌細胞增殖，侵襲和凋亡通過CDC25B和CDC25B的上調(diào)進行遷移YWHAE的下調(diào)[9]。文獻表明，14-3-3蛋白作為特定的磷酸化蛋白質(zhì)結合蛋白，通過抑制其磷酸化使蛋白質(zhì)失活或通過阻止其去磷酸化來增強蛋白質(zhì)的活性。YWHAE可以通過參與ERK/MAPK途徑上調(diào)胃癌SGC7901細胞的生物活性。抑制YWHAE活性可能更有效地抑制胃癌細胞生長[10]。Abdul等[11]發(fā)現(xiàn)YWHAE蛋白在大腦中高表達，并且與在神經(jīng)元信號傳導中起重要作用的蛋白質(zhì)相互作用。

YWHAE表達的改變可能在各種腫瘤類型中很常見；然而YWHAE在CRC中的意義還沒有被研究。在本研究中，我們通過液質(zhì)聯(lián)用及蛋白印跡分別驗證了YWHAE在CRC組織中上調(diào)表達。這表明YWHAE可能在CRC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，且有潛力作為早期的生物標志物以及CRC治療的基因靶點。