miR-1197負(fù)調(diào)控Smad3抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的增殖、侵襲、遷移能力及S期細(xì)胞周期的聚集相關(guān)研究

張隆陶,王 勁,張貽慶,崔貴醫(yī)

(焦作市人民醫(yī)院 肝膽胰疝外科，河南 焦作454000)

結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，目前手術(shù)是結(jié)腸癌主要的治療手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移限制了治療效果[1]。因此探究結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移分子機(jī)制、尋找有效靶點(diǎn)對結(jié)腸癌的診療具有重要意義[2]。microRNA(miRNA)是近年來研究較多的一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA，其在多種人類惡性腫瘤中出現(xiàn)表達(dá)異常，充當(dāng)癌基因或抑癌基因，在惡性腫瘤的演進(jìn)過程中發(fā)揮重要作用。經(jīng)大量研究證實(shí)，在結(jié)腸癌細(xì)胞中存在多個miRNA分子表達(dá)異常，且與結(jié)腸癌患者的Dukes分期、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及生存預(yù)后等臨床病理特征之間存在相關(guān)性，提示miRNA分子可能參與結(jié)腸癌的演進(jìn)[3,4]。Smad3是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)信號通路中重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[5]，而TGF-β/Smads信號通路介導(dǎo)的EMT加速腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。本研究旨在分析miR-1197的表達(dá)水平與結(jié)腸癌的相關(guān)性，研究miR-1197與Smad3對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，遷移，侵襲能力及細(xì)胞周期的影響，探尋miR-1197在結(jié)腸癌中發(fā)揮的作用及其相關(guān)機(jī)制，為診斷及治療結(jié)腸癌尋找新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究樣本采集

實(shí)驗(yàn)組織標(biāo)本來自本院病理科2016年8月至2018年5月結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織共50例，其平均年齡(65.04±12.38)，均經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí),未接受化療和/或放療，所有組織標(biāo)本采集時先切成小塊，迅速置于凍存管中液氮保存，6h 后移至-80℃冰箱備用。

1.2 外周血采集

納入研究的結(jié)腸癌患者均于清晨空腹?fàn)顩r下進(jìn)行外周靜脈血抽取，采用一次性血清分離膠管，抽取外周靜脈血約3 ml；待血清析出后以1 000 g離心10 min，取上層血清保存至-80℃冰箱待檢測。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人類結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620用含10%的胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、100 u/ml青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基，置于含5%CO2，溫度維持在37℃中的恒溫箱中培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將生長狀態(tài)良好的SW620細(xì)胞以約 5×105/孔鋪于6孔板，待細(xì)胞在6孔板中的生長融合度達(dá)60%時，按照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 試劑說明書，分別轉(zhuǎn)染 negative control miRNA mimics，miR-1197 mimics及共轉(zhuǎn)染miR-1197 mimics和Smad3，分別作為對照組，miR-1197 mimics轉(zhuǎn)染組和miR-1197 mimics+Smad3轉(zhuǎn)染組。

1.5 qRT-PCR檢測

按照Trizol試劑盒說明書中步驟提取細(xì)胞和組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書將總RNA進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。按照qRT-PCR 試劑盒說明書進(jìn)行進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。miR-1197水平以 U6 為內(nèi)參，Smad3的mRNA水平以GAPDH 為內(nèi)參，qRT-PCR結(jié)果以2-△△Ct表示，每個樣本重復(fù)3次。

1.6 熒光素酶報告基因法檢測

利用miRBase預(yù)測miR-1197與Smad3可能的作用位點(diǎn)。構(gòu)建Smad3野生型3’-UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒pMIR-Smad3-wt和突變型報告基因質(zhì)粒pMIR-Smad3-Mut。將pMIR-Smad3-wt、pMIR-Smad3-Mut與miR-1197 mimics和negative control miRNA mimics共轉(zhuǎn)染進(jìn)SW620細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，去除培養(yǎng)基，每孔加入100 μl被動裂解液(Passive Lysis Buffer,PLB)，室溫下將培養(yǎng)，待細(xì)胞裂解后，將每組20 μl樣本轉(zhuǎn)移至發(fā)光用96孔板上，使用酶標(biāo)儀配套軟件進(jìn)行結(jié)果分析。相對熒光素酶活性 (Relative luciferase activity)=螢火蟲熒光素酶活性(Firefly luciferase activity)/海腎熒光素酶活性(Renilla luciferase activity)。

1.7 Western Blot

采用RIPA裂解液提取細(xì)胞或組織蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度，按每泳道以50 μg總蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，采用PVDF膜轉(zhuǎn)移蛋白，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗兔抗Smad3(1∶500)，內(nèi)參GAPDH(1∶1 000)，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h。ECL液暗室發(fā)光顯影，采集圖像并分析。

1.8 Tranwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲

將Matrigel凝膠置于4℃過夜；次日將液化的Matrigel與培養(yǎng)基以1∶6的比例稀釋。在上室加入50 μl Matrigel 稀釋液，以包被濾膜；將培養(yǎng)板置于孵箱中4 h，令包被液晾干。取生長狀態(tài)良好的各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化并使用含10% BSA的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml。將濾膜孔徑為8 μm 的Transwell小室放置于24孔板中；在下室加入600 μl 含10%血清的培養(yǎng)基；在上室加入100 μl 細(xì)胞懸液；將培養(yǎng)板放入孵箱，常規(guī)培養(yǎng)24-48 h。取出小室，用PBS淋洗3次；將小室置于95%乙醇中固定 5 min；在0.5%結(jié)晶紫染色液中染色10 min后，用 PBS 漂洗去除未結(jié)合細(xì)胞的染色液。用棉簽輕拭去小室濾膜上層的細(xì)胞，在顯微鏡下觀察濾膜下層細(xì)胞并拍照并計數(shù)。

1.9 CCK8檢測細(xì)胞增殖

取各組細(xì)胞用培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.5×104個/ml，將細(xì)胞均勻鋪于96孔板中，每孔200μl細(xì)胞懸液，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后每孔加CCK8溶液20 μl，繼續(xù)孵育4 h。酶標(biāo)儀設(shè)定波長450 nm，進(jìn)行吸光度檢測。

1.10 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移

將生長狀態(tài)良好的各組細(xì)胞以2×105個/ml接種于6孔板內(nèi)，每孔2 ml。待細(xì)胞長成單層棄去培養(yǎng)液，在每孔中央劃出一個劃痕，洗去死亡細(xì)胞，顯微鏡下拍照，觀察12 h時細(xì)胞劃痕處細(xì)胞運(yùn)動變化。

1.11 流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞周期

各組細(xì)胞以每孔5×105個接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞并用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1次，然后設(shè)定1 200 RPM離心5 min，用預(yù)冷的PBS重懸，逐滴將細(xì)胞懸液加入預(yù)冷的70%乙醇中，置于4℃ 固定過夜。去除乙醇后用PBS洗滌2次并加入100 μl RNase A，37℃水浴30 min，接著添加400 μl PI染色并混勻，4℃避光 30 min，最后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.12 構(gòu)建結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型

選用SPF 級 BALB/c雄性裸鼠8只，4-5周齡，體重13-16 g。動物飼養(yǎng)于22℃恒溫，40-75%濕度，12 h光/暗周期條件下，自由獲取水和食物。所有裸鼠隨機(jī)分為對照組(n=4)和miR-1197處理組(n=4)。取轉(zhuǎn)染了miR-1197 mimics，negative control miRNA mimics的SW620細(xì)胞配置成濃度約為 2×107個/ml 單細(xì)胞懸液，每只裸鼠左前肢腋窩皮下接種0.2 ml細(xì)胞懸液。接種后每3天用游標(biāo)卡尺測量每只裸鼠移植瘤的最大直徑a和最小徑b,計算瘤體積，計算公式為:V=1/2×a×b2，3周后采用頸椎脫臼法處死全部裸鼠，剝離瘤體，稱重，拍照，甲醛固定。

1.13 免疫組化

將組織標(biāo)本置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h后，常規(guī)石蠟切片脫蠟水化。滴加3% H2O2室溫孵育10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。使用PBS沖洗5 min×2次，切片置于檸檬酸鹽緩沖液并采用微波加熱法以修復(fù)抗原。加入5% 的正常羊血清封閉，室溫孵育20 min。加入Ki67抗體(1∶100)，4℃過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶200)，37℃孵育30 min。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min。采用DAB顯色后，蘇木精室溫染色2 min，而后進(jìn)行脫水和中性樹脂封片。顯微鏡觀察切片陽性信號，并進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計。

1.14 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-1197在結(jié)腸癌患者血清中的表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，結(jié)腸癌患者血清中miR-1197表達(dá)水平與腫瘤分化程度，淋巴轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，腫瘤浸潤深度和腫瘤直徑相關(guān)臨床指標(biāo)發(fā)展程度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與性別和年齡無關(guān)(表1)。

表1 miR-1197在結(jié)腸癌患者臨床特征的相關(guān)性

2.2 miR-1197在結(jié)腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織的表達(dá)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，相比癌旁正常組織，結(jié)腸癌腫瘤組織中miR-1197的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)(圖1A)，并且miR-1197在發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著低于未轉(zhuǎn)移腫瘤組織(P<0.01)(圖1B)。提示miR-1197可能與結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。

圖1 miR-1197在結(jié)腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織的表達(dá)

注：A.miR-1197在結(jié)腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織的表達(dá)水平；B.miR-1197在發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移腫瘤組織和未轉(zhuǎn)移腫瘤組織的表達(dá)；(**，表示P<0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義)。

2.3 miR-1197對Smad3的靶向調(diào)控作用

采用miRBase預(yù)測miR-1197的潛在靶基因，結(jié)果顯示，Smad3的 3′-UTR區(qū)域存在與miR-1197形成互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)(圖略)。在SW620細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-1197mimics，negative control miRNA mimics (miR-NC)以及構(gòu)建的Smad3野生型3′-UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒pMIR-Smad3-wt和突變型報告基因質(zhì)粒pMIR-Smad3-Mut，雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示，miR-1197高表達(dá)可明顯抑制pMIR-Smad3-wt的熒光素酶活性(P<0.01)，但對pMIR-Smad3-Mut的熒光素酶活性無明顯影響(圖2A)。另外，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，相比對照組，轉(zhuǎn)染miR-1197 mimics的細(xì)胞中Smad3的mRNA水平明顯降低(P<0.01)(圖2B)。Western blot檢測結(jié)果也表明，miR-1197高表達(dá)可明顯下調(diào)Smad3蛋白的表達(dá)(圖2C)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-1197通過結(jié)合Smad3的 3′-UTR來靶向調(diào)控Smad3的mRNA及蛋白表達(dá)。

圖2 miR-1197結(jié)合Smad3的 3′-UTR來抑制Smad3的表達(dá)

注：A.雙熒光素酶報告基因法檢測熒光素酶活性；B.qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測Smad3的mRNA水平；C.Western blot檢測Smad3蛋白的表達(dá)水平；(**，表示P<0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義)。

2.4 Smad3在結(jié)腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織的表達(dá)

采用Western blot檢測結(jié)腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織中Smad3的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，腫瘤組織中Smad3的蛋白表達(dá)顯著高于癌旁正常組織(圖3A)。同時，qRT-PCR檢測結(jié)果也顯示結(jié)腸癌腫瘤組織中Smad3的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)(圖3B)。

2.5 miR-1197與Smad3對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及細(xì)胞周期的調(diào)控

在SW620細(xì)胞中轉(zhuǎn)染negative control miRNA mimics (miR-NC)，miR-1197 mimics和Smad3，采用CCK8法檢測各組細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，miR-1197 mimics轉(zhuǎn)染組的OD值顯著低于對照組，而miR-1197 mimics+Smad3轉(zhuǎn)染組的OD值顯著高于miR-1197 mimics轉(zhuǎn)染組(P值均<0.01)(圖4A)。流式細(xì)胞法檢測結(jié)果顯示，miR-1197 mimics轉(zhuǎn)染組S期細(xì)胞比值顯著降低，而miR-1197 mimics+Smad3轉(zhuǎn)染組S期細(xì)胞比值顯著升高(P值均<0.01)(圖4B)。采用Tranwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-1197 mimics后，侵襲細(xì)胞計數(shù)顯著降低。而共轉(zhuǎn)染miR-1197 mimics和Smad3后，侵襲細(xì)胞計數(shù)顯著升高(P值均<0.01)(圖4C)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-1197 高表達(dá)可顯著降低細(xì)胞遷移能力，而同時上調(diào)miR-1197 mimics和Smad3的表達(dá)后，細(xì)胞遷移能力顯著上升(P值均<0.01)(圖4D)。上述結(jié)果表明，miR-1197可抑制SW620細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及S期細(xì)胞周期的聚集，但Smad3過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)這種抑制效果。

圖3 Smad3在結(jié)腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織的表達(dá)

注：A.Western blot檢測結(jié)腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織中Smad3的蛋白表達(dá)量；B.qRT-PCR檢測結(jié)果結(jié)腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織中Smad3的mRNA表達(dá)量；(**，表示P<0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義)。

2.6 miR-1197在結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型中的作用

將negative control miRNA mimics (miR-NC)，miR-1197 mimics轉(zhuǎn)染進(jìn)SW620細(xì)胞并注射到裸鼠皮下以構(gòu)建結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型。細(xì)胞接種21天后，檢測結(jié)果顯示，miR-1197 mimics處理組的腫瘤體積及重量均顯著低于對照組(P值均<0.01)(圖5A-B)。Ki67染色結(jié)果顯示,相比對照組，miR-1197 mimics處理組裸鼠中細(xì)胞增殖能力顯著降低(圖5C)。上述結(jié)果表明，在結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型中，上調(diào)miR-1197的表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及腫瘤生長。

3 討論

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高，5年生存率低等特點(diǎn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)腸癌患者死亡及影響預(yù)后的重要因素，但具體機(jī)制尚不清楚，因此尋找并研究結(jié)腸癌新靶點(diǎn)非常重要[6]。MicroRNAs(miRNAs)是一類小分子高度保守的非編碼RNA[7]。近年來大量研究數(shù)據(jù)表明，其其突變、異位或表達(dá)水平的變化影響惡性腫瘤發(fā)展過程[8,9]。同時多種miRNAs 已被證實(shí)在結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展發(fā)揮了重要作用，例如，Wang等研究發(fā)現(xiàn)miR-106a通過直接調(diào)控TGFER2而促進(jìn)結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移[10]；Zhang 等人的研究發(fā)現(xiàn)miR-7能夠靶向YY1蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)結(jié)腸癌的發(fā)生[11]。在本研究中，首先發(fā)現(xiàn)了結(jié)腸癌患者血清中miR-1197表達(dá)水平與腫瘤分化程度，淋巴轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，腫瘤浸潤深度和腫瘤直徑相關(guān)臨床指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)；并且miR-1197在結(jié)腸癌腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織，在發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著低于未轉(zhuǎn)移腫瘤組織。上述結(jié)果提示miR-1197可能與結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展存在相關(guān)性。

圖4 miR-1197與Smad3對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及細(xì)胞周期的調(diào)控

注：A.CCK8法檢測SW620細(xì)胞增殖能力；B.流式細(xì)胞法檢測SW620細(xì)胞S期細(xì)胞比值；C.Tranwell實(shí)驗(yàn)檢測SW620細(xì)胞侵襲能力；D.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測SW620細(xì)胞的遷移能力；(**，表示P<0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義)。

圖5 miR-1197在結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型中的作用

注：A.miR-1197模擬物的腫瘤體積；B.miR-1197模擬物的腫瘤重量；C.Ki67染色觀察miR-1197模擬物的SW620細(xì)胞中陽性信號及增殖效果；(**，表示P<0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義)。

miRNAs主要與其靶基因的mRNA 3′UTR(untranslated region)非編碼區(qū)域結(jié)合，通過翻譯抑制或下調(diào)靶基因的mRNA來影響蛋白質(zhì)的翻譯，從而調(diào)控不同的生理及病理過程。因此，為明確miR-1197在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制，首先需確定其在結(jié)腸癌中調(diào)控的靶基因。本研究使用miRBase發(fā)現(xiàn) Smad3的 3′-UTR區(qū)域存在與miR-1197形成互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。并且我們還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在SW620細(xì)胞中，miR-1197高表達(dá)可以下調(diào)Smad3的mRNA及蛋白的表達(dá)水平。表明miR-1197可負(fù)向調(diào)控靶基因Smad3的表達(dá)水平。

Smad3是Smad家族的成員，其不僅在TGF-β信號通路中起著細(xì)胞內(nèi)調(diào)控作用，而且在多種人類腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[12]。研究證明TGF-β/Smads信號通路在維持和促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal Wansition，EMT)過程中起重要作用[13]，而后者被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵啟動步驟[14,15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌腫瘤組織中Smad3的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高于癌旁正常組織，并且其與miR-1197表達(dá)水平的變化與結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為密切相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)miR-1197高表達(dá)能抑制SW620細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力及S期細(xì)胞周期的聚集，但上調(diào)Smad3的表達(dá)水平可以逆轉(zhuǎn)miR-1197的這種抑制效果。表明miR-1197是通過抑制靶基因Smad3的表達(dá)水平參與調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。進(jìn)一步，我們通過構(gòu)建結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型觀察miR-1197在結(jié)腸癌中的作用，結(jié)果顯示，miR-1197可作為抑癌基因在結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型中抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及腫瘤生長。

綜上所述，本研究闡述了miR-1197的異常低表達(dá)與結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，揭示了miR-1197通過負(fù)調(diào)控靶基因Smad3的表達(dá)水平抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為及腫瘤的生長，在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌基因作用。因此，miR-1197可能成為結(jié)腸癌診斷及治療的新靶點(diǎn)及研究方向。