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    米諾環(huán)素對氟尿嘧啶誘導的小鼠腸黏膜炎的保護作用研究

    2019-05-28 11:30黃義新劉煒
    中國醫(yī)藥導報 2019年10期
    關鍵詞:氟尿嘧啶

    黃義新 劉煒

    [摘要] 目的 研究米諾環(huán)素對氟尿嘧啶(5-Fu)誘導的腸黏膜炎的保護作用。 方法 40只雄性Balb/c小鼠,隨機分為5組,正常組、模型組、米諾環(huán)素低劑量組及高劑量組,每組10只。模型組由連續(xù)腹腔注射5-Fu(80 mg/kg)3 d誘導,治療組同時灌胃給予30 mg/kg或60 mg/kg的米諾環(huán)素。測定小鼠體質(zhì)量、腹瀉指數(shù),同時對小鼠空腸進行HE染色,測定小腸黏膜中的促炎性細胞因子,并對小鼠腸內(nèi)容物中的短鏈脂肪酸進行測定,進而評價米諾環(huán)素對小鼠腸黏膜炎的保護作用。 結(jié)果 高劑量米諾環(huán)素可顯著增加腸黏膜炎模型小鼠的體重(P < 0.01),降低其腹瀉指數(shù)(P < 0.01),增加模型小鼠的空腸絨毛長度(P < 0.01)。此外高劑量米諾環(huán)素可顯著抑制腸黏膜中的IL-6(P < 0.05)和TNF-α(P < 0.01)的表達,同時增加小鼠腸內(nèi)容物中丁酸及乙酸的含量(P < 0.01)。 結(jié)論 米諾環(huán)素具有確切的腸黏膜保護作用,其作用與其抗炎及促進短鏈脂肪酸的生成有關。

    [關鍵詞] 米諾環(huán)素;氟尿嘧啶;腸黏膜炎;短鏈脂肪酸

    [中圖分類號] R730.53 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210(2019)04(a)-0020-05

    Protective effects of Minocycline on 5-Fluorouracil-induced intestinal mucositis in mice

    HUANG Yixin LIU Wei

    Department of Pharmacy, Beijing Shijitan Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100038, China

    [Abstract] Objective Forty investigate the protective effect of Minocycline on 5-Fu induced intestinal mucostitis. Methods 40 male Balb/c mice were randomly divided into four groups (n = 10), Control group, 5-Fu induced mucositis model, high dose or low dose of Minocycline treated group. After the mice were intraperitoneal administrated with 80 mg/kg 5-Fu for 3 days and simultaneously treated with 30 or 60 mg/kg orally in Balb/c mice, the body weight loss, diarrhea scores, and HE stain of the intestinal, pro-inflammatory cytokines in intestine tissue and short chain fatty acids in colon contents were also determined. Results Data from this study indicated that high dose minocycline could attenuate the 5-Fu induced body weight loss (P < 0.01), and lower the diarrhea scores (P < 0.01). Also minicycline in high dose increased the intestinal vill length (P < 0.01), decreased the IL-6 (P < 0.05) and TNF-α (P < 0.01). In the colon contents, Minocycline could significantly increase the SCFAs concentration, especially for aceticacid butyricacid (P < 0.01). Conclusion All these results demonstrated that Minocycline exert protective effects on 5-Fu induced intestinal damage in mice, and these protective effects may partially oriented from its anti-inflammatory effects and enhancing short chain fatty acid production.

    [Key words] Minocycline; 5-Fluorouracil; Intestinal mucositis; Short-chain fatty acid

    米諾環(huán)素為常見的四環(huán)素類抗生素,其抗菌譜廣、抑菌活性強且持久[1],目前臨床上多用于治療支原體感染、尿道感染、支氣管炎、毛囊炎等[2-3]。因米諾環(huán)素具有較好的脂溶性,口服生物利用度較高,可分布于全身各組織,尤其可透過血腦屏障等生理性屏障[4]。近年來,有研究表明米諾環(huán)素具有抗炎、抗凋亡等作用,可顯著抑制炎癥、應激、腦出血等誘導的神經(jīng)損傷[5]。

    氟尿嘧啶(5-Fu)為臨床上常用的化療藥物[6],可用于治療消化系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌等[7-8],但其胃腸道不良反應明顯,可引起化療患者食欲減退、腹瀉、便血等,嚴重限制了其臨床應用[9]。研究表明這些不良反應可能與5-Fu誘導腸黏膜損傷,進而引起炎性反應有關[10-11]。此外,5-Fu還可引起腸道菌群失衡,導致腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的減少,而短鏈脂肪酸,如丁酸等具有支撐腸上皮細胞屏障的功能[10,12]。

    尋找具有抗炎及保護腸黏膜功能的藥物,進而降低5-Fu的胃腸道不良反應,這對改善化療患者的生活質(zhì)量和化療效果具有重要意義[8]。本文擬研究米諾環(huán)素對5-Fu誘導的小鼠腸黏膜炎的保護作用,以期為相關藥物的開發(fā)及拓寬米諾環(huán)素的臨床應用提供基礎。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1 實驗試劑 5-Fu、米諾環(huán)素、四甲基戊酸購自美國Sigma公司;乙酸、丙酸、丁酸、戊酸購自德國Ehrenstorfer公司;磷酸及乙酸乙酯(GC-MS級)均由德國Merk公司提供;小鼠TNF-α和IL-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號分別為B226815, B229138)由美國Biolegend公司提供。實驗用水為超純水,由Milli-Q Gradient A10制備。實驗中其他試劑均為分析純,購自南京化學試劑廠。

    1.1.2 實驗動物 SPF級Balb/c小鼠由揚州大學比較醫(yī)學實驗中心提供,合格證號為SKXK(蘇)2012-0004,小鼠雌雄各半,8~10周齡,體重18~22 g。動物倫理由首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院倫理委員會批準,符合相關規(guī)定。動物飼養(yǎng)于溫度為24~26℃房間中,每天7:00~19:00給予光照,動物自由飲食飲水。小鼠每天早上抓握半分鐘適應1周后,進行后續(xù)的動物實驗。

    1.1.3 實驗儀器 Thermo 2IR型高速低溫離心機,Olympus顯微鏡(含DP2-BSW計算機圖像分析系統(tǒng)),BS323S 電子天平(Sartorius公司,精確值0.0001 g),酶標儀(Biotek公司),GC6890N型氣相色譜儀,配有 FID 檢測器(美國Agilent公司),渦旋振蕩器(Scientific Industries Inc. USA)。

    1.2 方法

    1.2.1 藥物的配制 5-Fu用生理鹽水配置成8 mg/mL的溶液(必要時加熱至50℃溶解后,冷卻備用),米諾環(huán)素采用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液混懸為3 mg/mL和6 mg/kg的混懸液備用。

    1.2.2 小鼠腸黏膜炎的誘導及給藥方案 40只SPF級Balb/c小鼠,采用完全隨機分組法將動物隨機分為正常組、模型組、米諾環(huán)素低劑量組合米諾環(huán)素高劑量組,每組動物各為10只,雌雄各半。正常組小鼠每天腹腔注射生理鹽水10 mL/kg,模型組前3 d每天腹腔注射配制好的5-Fu10 mL/kg(即給藥劑量為80 mg/kg),米諾環(huán)素給藥組在造模1 h后,灌胃給予相應劑量的米諾環(huán)素藥液進行藥物干預[9]。

    于第7天,取各組小鼠的空腸,經(jīng)生理鹽水沖洗干凈腸內(nèi)容物后,取約1 cm的空腸置于10%的中性甲醛中,固定;其余的空腸,縱向剖開,平鋪于冰板上,采用載玻片刮下腸黏膜備用;同時收集小鼠盲腸內(nèi)容物,用于后續(xù)的短鏈脂肪酸的測定。

    1.2.3 小鼠體重及腹瀉指數(shù) 每隔1 d(0、1、3、5、7 d)記錄1次體重;腹瀉情況通過對糞便進行評分[13],具體如下:0分:糞便正?;蛭匆娂S便;1分:輕度腹瀉,糞便有輕微濕軟;2分:中度腹瀉,糞便不成形,且較為濕潤較濕,且伴有輕度的肛周糞便著色;3分:重度腹瀉,水樣便并伴有重度肛周著色。通過比較各組動物的腹瀉指數(shù)及體重情況進行藥效評價。

    1.2.4 HE染色劑及腸上皮絨毛長度 經(jīng)中性甲醛固定的空腸,經(jīng)過常規(guī)取材,脫水,石蠟包埋,切片后進行常規(guī)的HE染色,并在顯微鏡下觀察小腸病理變化,同時進行評分。主要包括腸黏膜上皮細胞有無變性、壞死,絨毛間質(zhì)是否水腫;黏膜固有層的炎細胞浸潤情況;黏膜下層、肌層、漿膜層有無充血、水腫、炎細胞浸潤等損傷。根據(jù)上述病變的嚴重程度分別記分為0分(無明顯病變)、0.5分(輕微病變)、1分(輕度改變)、2分(中度病變)、3分(較為嚴重),通過累加所有分數(shù),得出總的病變評分[10,13]。

    小腸絨毛長度的測定采用在200倍光鏡下利用顯微鏡自帶的圖像分析系統(tǒng)(DP2-BSW)測量,隨機選擇3~5各視野,計算每個視野下所有腸絨毛長度的平均值,進一步計算所有視野中的腸絨毛長度均值,進行后續(xù)的統(tǒng)計分析。

    1.2.5 小鼠腸黏膜中TNF-α和IL-6的測定 取小鼠空腸的腸黏膜約50 mg,加入9倍體積的冰磷酸緩沖液(PBS,pH=6.8),冰浴下勻漿,12 000 g離心5 min,取上清,按小鼠TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒操作步驟進行。同時上清液采用BCA法定蛋白,用于校正腸黏膜中的細胞因子濃度(pg/mg蛋白)。

    1.2.6 腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸測定 精密稱取約0.1 g的腸內(nèi)容物,加入9倍體積的0.5%的磷酸水溶液,在4℃條件下劇烈渦旋2 min使腸內(nèi)容物充分分散,12 000 g離心5 min,取上清0.5 mL,加入10 μL內(nèi)標(200 μg/mL的四甲基戊酸)和0.5 mL乙酸乙酯,4℃渦旋2 min后,15 000 g離心10 min,取乙酸乙酯層,進行GC-FID分析。

    GC-FID分析中,色譜柱為PEG-20型彈性石英毛細管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm;程序升溫:0~5 min,85~160℃(15℃/min);5~15 min,150~230℃(8℃/min);15~18 min,230℃,保持3 min;18~21 min,230~170℃(20℃/min);檢測器溫度270℃;進樣口溫度220℃;分流進樣,進樣量1.0 μL;載氣為高純氮氣,流速2.1 mL/min。

    1.3 統(tǒng)計學方法

    采用統(tǒng)計學軟件SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行分析,計量資料用均數(shù)±標準差(x±s)表示,兩組間比較采用t檢驗;多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料用率表示,采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 體重及腹瀉評分

    與正常組小鼠比較,腹腔注射5-Fu后,模型組小鼠給藥后體重顯著降低(P < 0.05或P < 0.01)。而給予30 mg/kg或60 mg/kg的米諾環(huán)素后,小鼠體重與模型組相比,顯著增加,其中米諾環(huán)素高劑量組效果最佳。見表1。

    從腹瀉指數(shù)上看,模型組小鼠在造模前2 d未見明顯的腹瀉癥狀,從3 d開始可見輕微的腹瀉,隨著時間的延長,模型組小鼠腹瀉指數(shù)顯著增加。而給予30、60 mg/kg米諾環(huán)素后,小鼠的腹瀉情況可見明顯改善,其中米諾環(huán)素低劑量組在第5天和第7天的腹瀉指數(shù)與模型組相比,顯著降低(P < 0.05),而米諾環(huán)素高劑量組在第3天開始,其腹瀉指數(shù)顯著降低(P < 0.05或P < 0.01)。見表2。

    2.2 小腸病理及腸上皮絨毛長度統(tǒng)計結(jié)果

    正常組小鼠空腸結(jié)構完整,可見清晰的黏膜層,黏膜下層、肌層和漿膜層絨毛細長且排列規(guī)則整齊。而模型組小鼠空腸結(jié)構可見上皮細胞出現(xiàn)輕度或者中度的變性,且有部分小鼠空腸出現(xiàn)水腫,從固有層看,有一定的充血,且出現(xiàn)炎癥細胞的浸潤[6]。而給予不同劑量的米諾環(huán)素后,上述病理改變可見明顯改善。見圖1。

    從病理學評分上看,正常組小鼠未見明顯病理學改變,但5-Fu誘導的腸黏膜炎小鼠的空腸,其病變評分顯著增加。給予30 mg/kg和60 mg/kg的米諾環(huán)素后,其病變評分顯著降低(P < 0.05或P < 0.01),提示米諾環(huán)素具有一定的保護5-氟尿嘧啶誘導的腸黏膜損傷的作用。進一步測定其絨毛長度,模型組絨毛長度顯著降低(P < 0.01),而給予不同劑量的米諾環(huán)素后,可顯著改善由5-Fu誘導的絨毛損傷(P < 0.05或P < 0.01)。見表3。

    2.3 TNF-α和IL-6測定結(jié)果

    與正常組小鼠腸黏膜中的TNF-α表達情況相比,模型組小鼠血漿中的TNF-α表達顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.01)。IL-6的含量在模型組小鼠腸黏膜中亦顯著增加(P < 0.01)。給予米諾環(huán)素后,低、高劑量的米諾環(huán)素均對5-Fu誘導的小鼠腸黏膜炎癥損傷有改善作用(P < 0.05或P < 0.01)。見表4。

    2.4 盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸含量

    與正常組小鼠腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸、及戊酸的濃度相比,5-Fu誘導的腸黏膜炎小鼠盲腸內(nèi)容物中上述四種短鏈脂肪酸含量顯著下降(P < 0.01)。而給予低劑量米諾環(huán)素后,小鼠盲腸中的乙酸含量與模型組相比,顯著增加(P < 0.05),其他短鏈脂肪酸均有所增加但差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05)。給予高劑量米諾環(huán)素后,小鼠盲腸中的乙酸、丙酸、丁酸的含量則顯著提高,其中乙酸和丁酸含量顯著提高(P < 0.01)。見表5。

    3 討論

    本實驗通過對小鼠體重、腹瀉評分、空腸病變及絨毛長度、腸黏膜中促炎性細胞因子含量及盲腸內(nèi)容物中的短鏈脂肪酸,研究米諾環(huán)素對5-氟尿嘧啶誘導的腸黏膜炎小鼠保護作用。實驗結(jié)果表明米諾環(huán)素具有較好的保護作用。

    研究表明化療藥物,如5-Fu可通過直接損傷腸上皮細胞,誘導腸上皮細胞凋亡,進而發(fā)生炎癥級聯(lián)反應,誘導腸黏膜損傷[8],進而導致腹瀉、嘔吐、便血等系列胃腸道不良反應,嚴重限制了其臨床應用。本研究選擇米諾環(huán)素作為研究對象,基于其具有一定的抗菌作用、抑制神經(jīng)炎癥等文獻報道[2,4],發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素可顯著改善5-Fu誘導的小鼠體重減輕及腹瀉癥狀。進一步從病理學及腸絨毛長度發(fā)現(xiàn),米諾環(huán)素可顯著改善5-Fu誘導的小腸病變和絨毛萎縮。

    由于5-Fu誘導的腸黏膜損傷可能與炎性反應和菌群失調(diào)等有關[6,8,10],本研究進一步的通過ELISA研究米諾環(huán)素對腸黏膜中的促炎性細胞因子TNF-α和IL-6表達的影響,結(jié)果提示米諾環(huán)素可顯著抑制上述促炎性細胞因子的表達,這與米諾環(huán)素抑制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞活化等結(jié)果類似,進一步佐證了米諾環(huán)素的抗炎作用。

    此外,由于腸黏膜損傷可能還與腸道菌群紊亂及其繼發(fā)的短鏈脂肪酸(SCFAs)生成減少有關[14-16],SCFAs為食物中膳食纖維經(jīng)腸道菌群發(fā)酵后的降解產(chǎn)物,可為腸上皮細胞提供能量[17],進而維護腸道上皮細胞的屏障功能,保護小腸杯狀細胞的分泌功能完好[18],同時還可以促進腸黏膜細胞的增殖[19]。本研究通過檢測盲腸內(nèi)容物中的SCFAs的濃度,研究結(jié)果提示,米諾環(huán)素可顯著提供小鼠結(jié)腸中的丁酸的含量,而丁酸具有確切的促進腸上皮細胞增殖,保護腸上皮細胞損傷的功效[20],這從另外一個方面確證了米諾環(huán)素對5-Fu誘導的腸黏膜炎的保護作用。

    本研究對拓寬米諾環(huán)素的臨床應用,尋找較好的改善5-Fu化療的輔助用藥具有重要意義,后續(xù)應對米諾環(huán)素的保護作用機制進行深入研究。

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    (收稿日期:2018-08-31 本文編輯:蘇 暢)

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