海洛因?qū)Υ笫箢~葉、海馬區(qū)泛素蛋白酶體功能的影響

【摘 要】目的：觀察海洛因?qū)Υ笫箢~葉和海馬區(qū)腦組織形態(tài)學(xué)改變及Ub、UbE1在腦組織中的表達(dá)，探討海洛因?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)功能和形態(tài)的影響及其發(fā)生機制。方法：選擇SD大鼠，分為3組（短時組2w、長時組4w及正常對照組），首日每次皮下注射海洛因3mg/kg，每天2次，逐日按3mg/kg遞增海洛因注射量，連續(xù)9天（第9天每次劑量達(dá)27mg/kg），第10天用5.0mg/kg納洛酮腹腔注射，誘發(fā)戒斷癥狀，對海洛因成癮大鼠模型戒斷癥狀進(jìn)行評分；對照組按同樣方式注射等量生理鹽水。采用免疫組織化學(xué)方法分別檢測Ub、UbE1在神經(jīng)元中的表達(dá)變化。結(jié)果：Ub和UbE1主要表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞外未見表達(dá)。圖像分析顯示Ub、UbE1的表達(dá)量均為海洛因長時依賴組（4w）<海洛因短時依賴組（2w）<非海洛因依賴組，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：海洛因中毒可引起腦組織形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為神經(jīng)元數(shù)量減少、神經(jīng)元變性等，其機制可能與泛素蛋白酶體功能障礙有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】海洛因；大鼠額葉；中樞神經(jīng)系統(tǒng)；泛素-蛋白酶體系統(tǒng)

海洛因（heroin），化學(xué)名為二醋嗎啡，是成癮性極強的嗎啡衍生物。大量人群流行病學(xué)、動物實驗研究結(jié)果均表明[1，2，3]，海洛因依賴可導(dǎo)致廣泛神經(jīng)元變性壞死、萎縮退化及脫髓鞘改變；臨床上大多有智能減退， 表現(xiàn)為計算力、理解力、定向力、記憶力、判斷力減退， 甚至癡呆。因此，近年來認(rèn)為海洛因依賴也屬于一種與記憶、癡呆癥相關(guān)的慢性、復(fù)發(fā)性神經(jīng)變性疾病[4]。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）是機體修復(fù)或消除異常蛋白質(zhì)的重要途徑，在神經(jīng)變性疾病中發(fā)揮著重要作用。近幾年來，隨著UPS的分子機制研究取得的巨大的進(jìn)展，UPS在神經(jīng)變性疾病的發(fā)病機制中的作用也得到了許多研究的肯定。UPS功能的缺陷，無論是UPS水平的過高還是過低，都可能導(dǎo)致神經(jīng)變性疾病的發(fā)生。國內(nèi)外對于海洛因成癮及復(fù)吸所引起的神經(jīng)損害是否也受UPS的調(diào)控尚未見報道。本文通過建立海洛因依賴大鼠模型，研究Ub、UbE1在大鼠額葉、海馬區(qū)表達(dá)水平的變化，探討海洛因致腦損傷機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD大鼠30只，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。3月齡，體重200-220g，雌雄各半。

1.2 藥品和試劑

海洛因由貴州省公安廳提供。泛素（Rabbit Anti-Ubiquitin）、泛素激活酶（Ubiquitin-activating enzymel， UbE1）購自北京博奧森公司；生物素化二抗（山羊抗兔IgG）購自北京博奧森公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 動物模型

經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重及性別隨機分為3組，每組10只，長時組（皮下注射海洛因4w），短時組（皮下注射海洛因2w），正常對照組（皮下注射等量生理鹽水），飼養(yǎng)期分別為2周和4周，參照以往文獻(xiàn)成功復(fù)制海洛因依賴模型的方法[5]，給予SD大鼠海洛因皮下注射，首日每次劑量3mg/kg，每天2次，逐日按3mg/kg遞增海洛因注射量，連續(xù)9天（第9天每次劑量達(dá)27mg/kg）。對照組按同樣方式注射等量生理鹽水。每天觀察動物生長發(fā)育狀況及體重變化情況。第10天用5.0 mg/kg納洛酮腹腔注射，誘發(fā)戒斷癥狀觀察30min，對海洛因成癮大鼠模型戒斷癥狀進(jìn)行評分，確認(rèn)海洛因依賴模型成功。短時組繼續(xù)皮下注射27mg/kg海洛因4天（共計2周），每天2次；長時組繼續(xù)皮下注射27mg/kg海洛因18天（共計4周），每天2次。生理鹽水對照組各5只大鼠分別采用與模型組相同劑量的生理鹽水注射2周、4周。

1.4 動物行為變化觀察

觀察大鼠毛色、飲食、活動情況、精神狀態(tài)，用電子秤稱量大鼠體重。參照Seebers等評分標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行大鼠催促戒斷癥狀評分。

1.5 取材和標(biāo)本制備

各組大鼠分別用戊巴比妥腹腔注射麻醉，灌注4%的甲醛溶液固定，參照鼠腦立體定位圖譜冠狀取海馬區(qū)、前額葉皮質(zhì)組織（包含周邊組織）。

1.6 HE染色和尼氏染色

多聚甲醛固定，石蠟包埋組織連續(xù)切片，片厚4μm，取海馬、前額葉皮質(zhì)腦組織切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，參照周君[6]的方法進(jìn)行尼氏染色，略有改動。

1.7 免疫組織化學(xué)Envision法

切片常規(guī)脫蠟至水，0.01mol/L枸緣酸鈉緩沖溶液（PH6.0）微波抗原修復(fù)，蒸餾水洗2min，PBS沖洗3次，5min/次，3%H2O2室溫避光孵育10 分鐘，除去內(nèi)源性過氧化氫酶，蒸餾水洗2min，PBS沖洗3次，5min/次，胰酶（1：1稀釋）37℃恒溫箱中消化20min，使抗原位點暴露，蒸餾水洗2min，PBS沖洗3次，5min/次，分別滴加一抗多克隆Ub、UbE1 （用PBS稀釋1：100、1：100），4℃冰箱孵育過夜，復(fù)溫，PBS沖洗3次，5min/次，滴加兔二抗IgG（PV6001），37℃孵育30min，PBS沖洗3次，5min/次，DAB液顯色，蘇木精輕度復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。1.8 圖像分析

通過Biomias 2000 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行計算分析，具有陽性表達(dá)的區(qū)域隨機選取4個視野，每個視野隨機選取陽性表達(dá)部位進(jìn)行平均灰度值測定，平均灰度高則表達(dá)強，反之則弱。

1.8 統(tǒng)計方法

運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件數(shù)據(jù)包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（D）表示，兩組間的比較采用獨立樣本T檢驗的分析方法，*P<0.05表示與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海洛因依賴戒斷大鼠模型評分、體重

大鼠在9d皮下注射遞增劑量的海洛因后，用納洛酮催促后30min內(nèi)出現(xiàn)了濕狗樣顫抖、伸展、清理皮毛、吞咽、站立、扭體、齒顫、上瞼下垂、流涎等戒斷癥狀，對戒斷癥狀進(jìn)行評分，短時組評分18.1±2.1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），長時組評分23.5±2.4，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），正常對照組評分2.8±1.5，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。短時組催促戒斷癥狀前體重230.4±15.1，戒斷后體重197.7±18.3，體重明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；長時組催促戒斷癥狀前體重225.6±13.9，戒斷后體重186.7±16.7，體重明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；對照組催促戒斷癥狀前體重265.9±19.7，戒斷后體重265.8±21.1，體重?zé)o明顯改變。

2.2 HE染色及尼氏染色

海洛因依賴組（包括短時組和長時組）前額葉、海馬區(qū)都出現(xiàn)正常神經(jīng)元數(shù)量減少、神經(jīng)元變性（包括神經(jīng)元固縮、深染、偏位，細(xì)胞核仁消失，尼氏體減少）、膠質(zhì)細(xì)胞增生、膠質(zhì)小結(jié)形成、嗜神經(jīng)現(xiàn)象等形態(tài)學(xué)改變，而對照組少見上述改變。尼氏染色顯示海洛因依賴組Nissl小體數(shù)量減少（P<0.05），且海馬區(qū)和前額葉皮質(zhì)均隨用藥時間延長Nissl小體減少更明顯（P<0.05）。

2.3 Ub免疫組織化學(xué)染色觀察

Ub陽性表達(dá)廣泛存在于前額葉皮質(zhì)及海馬區(qū)神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，免疫組織化學(xué)定量分析可見：長時組<短時組<對照組，統(tǒng)計有顯著差異，P<0.05；前額葉皮質(zhì)及海馬區(qū)陽性表達(dá)比較，無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。

2.4 UbE1免疫組織化學(xué)染色觀察

UbE1陽性表達(dá)廣泛存在于大腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，細(xì)胞外未見表達(dá)，免疫組織化學(xué)定量分析可見：長時組<短時組<對照組，統(tǒng)計有顯著差異，P<0.05；前額葉皮質(zhì)及海馬區(qū)陽性表達(dá)比較，無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

3 討論

海洛因容易通過血腦屏障直接作用于腦細(xì)胞，產(chǎn)生毒性作用。研究發(fā)現(xiàn)，海洛因依賴死者生前均出現(xiàn)不同程度的反應(yīng)遲鈍、情感淡漠、注意力不集中、懶言少語等表現(xiàn)，與阿爾茨海默病、帕金森癥等神經(jīng)變性疾病癥狀相似[3，7]。死亡病例腦組織病理學(xué)檢查可見不同程度的彌漫性神經(jīng)細(xì)胞變性壞死、嗜神經(jīng)現(xiàn)象多見，可見淀粉樣小體、膠質(zhì)細(xì)胞增生等[3]。

本試驗通過海洛因遞增皮下注射成癮、催促戒斷癥狀法建立海洛因依賴大鼠模型，腹腔注射5.0 mg/kg納洛酮后，大鼠出現(xiàn)明顯的濕狗樣顫抖、伸展、清理皮毛、吞咽、站立、跳躍、齒顫、上瞼下垂、流涎等癥狀，且體重急劇下降，與人使用海洛因后產(chǎn)生的戒斷癥狀相似。本試驗通過HE、尼氏染色發(fā)現(xiàn)，海洛因依賴大鼠前額葉、海馬區(qū)都出現(xiàn)正常神經(jīng)元數(shù)量減少、神經(jīng)元變性、膠質(zhì)細(xì)胞增生、膠質(zhì)小結(jié)形成、嗜神經(jīng)現(xiàn)象、Nissl小體數(shù)量減少等形態(tài)學(xué)改變，該研究與以往的研究結(jié)果相一致[3，5]，肯定了海洛因?qū)δX組織的損害作用，提示海洛因依賴對腦組織的損傷以神經(jīng)元變性、壞死為主，可能與海洛因引起呼吸抑制致全身缺氧，進(jìn)而造成大量脫髓鞘改變及神經(jīng)元變性有關(guān)。

泛素蛋白降解系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)一系列生命進(jìn)程的重要調(diào)節(jié)方式，與疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。它主要由泛素、泛素啟動酶（包括泛素激活酶、泛素結(jié)合酶、泛素連接酶）、26S蛋白酶體和去泛素化酶組成。泛素蛋白酶體系在高等真核生物細(xì)胞中的功能主要體現(xiàn)在兩個方面：一方面降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白，另一方面是非降解作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)不同蛋白的定位和活性[8]。泛素活化酶1（ubiquitin-activating enzyme 1，UbE1）可以活化所有參與結(jié)合反應(yīng)的泛素，并將活化泛素轉(zhuǎn)移到E2酶。張利達(dá)[9]等對脫毒大鼠針刺百會和大椎治療發(fā)現(xiàn)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)大鼠海馬、中腦腹側(cè)背蓋區(qū)（VTA）的Ub、E3、26s mRNA和蛋白的表達(dá)，可干預(yù)海洛因致腦損傷作用。本研究觀察海洛因依賴大鼠腦組織中Ub、UBE1廣泛定位于神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，甚至在軸突和樹突中也有表達(dá)，應(yīng)用圖像分析陽性信號顯示，Ub、UBE1在海洛因依賴長時組、短時組中表達(dá)水平均較正常對照組有不同程度的降低（p<0.05）。目前已知，蛋白質(zhì)的多泛素化是一種控制信號，凡被Ub標(biāo)記的蛋白質(zhì)最終被降解。一些易聚集蛋白（如Tau蛋白、α-Synuclein、淀粉樣前體蛋白等）有纖維狀的形態(tài)學(xué)特點，不易被相應(yīng)的酶降解，并且異常蛋白的增加和腦內(nèi)的聚集在神經(jīng)變性疾病的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用，可對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用[10]。泛素蛋白酶體系統(tǒng)具有識別這類多余的和錯誤折疊的蛋白質(zhì)，以保持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)平衡的作用，UbE1失活和泛素化水平功能障礙是致死性的。由實驗結(jié)果可見，海洛因依賴成癮可致額葉、海馬區(qū)腦組織的UbE1表達(dá)量減少，且泛素化水平降低，可以推測泛素蛋白酶體系功能紊亂可能是海洛因?qū)Υ笫蟪砂a復(fù)吸或腦組織損害的原因之一。

（通訊作者：汪元河）

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作者簡介

黃仕美（1982-），女，貴州省貴陽市人。碩士學(xué)位。貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院講師，兼主檢法醫(yī)師。主要研究方向為神經(jīng)病理。