蛋白N-糖基化分析方法研究進(jìn)展

張小倩, 張騰騰, 閆 攀, 楊畢超, 安鳳霞

亳州學(xué)院中藥學(xué)院, 安徽 亳州 236800

糖基化(glycosylation)是真核細(xì)胞最常見的蛋白轉(zhuǎn)譯后修飾方式之一，對(duì)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用，如蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞識(shí)別、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、薄膜保護(hù)作用、血型決定系統(tǒng)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等[1～3]。不僅如此，以重組蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)研制的藥品(例如單克隆抗體)成為當(dāng)下社會(huì)快速發(fā)展的制藥方向，許多新型藥物都是糖蛋白，包括一些癌癥標(biāo)志物和疫苗等。自從1986年市場引入了第一個(gè)治療型的單克隆抗體之后，治療型蛋白藥物的市場飛速增長。2017年，僅Humira一種單抗藥物全球銷售額就已高達(dá)184億美元[4]。據(jù)不完全估計(jì)，人類蛋白中有50%以上都發(fā)生了糖基化修飾，生物制藥中最亮眼的單克隆抗體100%都是糖蛋白藥物，因此針對(duì)蛋白糖基化的研究愈發(fā)重要[5]。

生物體中最常見的糖蛋白是N-糖苷鍵型糖蛋白，即寡聚糖與肽鏈上的天冬酰胺(asparagine，Asn)側(cè)鏈的酰胺氮連接而修飾的蛋白[6]。N-糖鏈在整個(gè)糖蛋白中只占很小的一部分，但是對(duì)整個(gè)糖蛋白的性質(zhì)影響巨大。關(guān)于N-糖基化的研究通?？梢詮娜齻€(gè)方面考量：①研究整體糖蛋白的糖鏈；②糖蛋白經(jīng)過酶切后，糖肽水平的研究；③經(jīng)過化學(xué)手段或酶切釋放寡糖鏈，對(duì)游離N-糖的研究，其中對(duì)酶切游離后N-糖鏈的研究也是最簡單、高效的方法[7,8]。目前，N-糖鏈主要是用肽N-糖苷酶F(PNGase F)酶解[9]，得到游離的N-糖鏈，再結(jié)合毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)、高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)和質(zhì)譜(mass spectrum, MS)等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析。但由于游離N-糖鏈為多羥基醛類化合物，本身沒有發(fā)色基團(tuán)，紫外檢測(cè)器幾乎無法檢測(cè)，且質(zhì)譜響應(yīng)也較差，常規(guī)電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI)正負(fù)離子模式下靈敏度都不高，這也造成常規(guī)高效的檢測(cè)方法如CE、HPLC及液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)等對(duì)其分析困難。針對(duì)這種情況，科學(xué)家多是通過柱前衍生法使糖鏈帶上紫外或熒光基團(tuán)，增加其檢測(cè)的靈敏度[10]，常規(guī)N-糖基化分析流程見圖1。

糖基化作為蛋白翻譯后修飾的重要步驟，其異常表達(dá)與疾病的發(fā)生發(fā)展、生理狀態(tài)的變化之間具有很高的關(guān)聯(lián)性，例如在炎癥反應(yīng)、惡性疾病、衰老等[11]不同的病理、生理?xiàng)l件下，糖鏈的結(jié)構(gòu)和表達(dá)量都會(huì)發(fā)生變化。不僅如此，大量研究表明，單抗藥物的N-糖基化修飾對(duì)其穩(wěn)定性、清除率、免疫原性、抗體依賴細(xì)胞毒性(antibody-dependentcellular cytotoxicity，ADCC)及補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)等都有一定的影響[12]。例如，缺少核心巖藻糖的糖型能夠增強(qiáng)對(duì)FcγRⅢa受體的親和力，從而提高ADCC[13]；而高水平的唾液酸化的糖型則會(huì)減少對(duì)FcγRⅢa受體的親和力，從而降低ADCC[14]。因此，對(duì)糖蛋白中N-糖基化修飾的研究具有重要意義，基于上述理念，本文對(duì)近年來科學(xué)家分離分析游離N-糖鏈的方法做了歸納與總結(jié)，這其中CE、HPLC以及MS聯(lián)用技術(shù)在N-糖鏈的分離分析上有著巨大優(yōu)勢(shì)，對(duì)糖蛋白上N-糖的定性定量分析、結(jié)構(gòu)表征具有重要意義。

圖1 N-糖鏈分析流程圖Fig.1 Analysis flow chart of N-glycans.

1 N-糖鏈的釋放

所謂N-糖鏈的釋放就是將N-糖鏈從糖蛋白上切下來，其主要是通過酶解或化學(xué)方法將N-糖鏈和糖基化的多肽分開，然后再對(duì)釋放的N-糖鏈單獨(dú)分析，從而獲得待檢測(cè)樣本中的糖鏈表達(dá)和變化情況，這樣有目的性的對(duì)N-糖鏈進(jìn)行分離分析可以大大提高分析效果[15,16]。

酶切釋放主要依賴于PNGase A/F/H+和糖苷內(nèi)切酶(endo-β-N-acetylglucosaminidase，Endo)F/H。PNGase可特異性識(shí)別并水解連接N-糖鏈的Asn殘基側(cè)鏈的氨基與羰基間的酰胺鍵[17]。其中，PNGase F是一種具有普適性的肽N-糖苷酶，已被廣泛應(yīng)用于釋放糖蛋白的N-糖鏈。例如，Kozak等[18]采用PNGase F酶切人免疫球蛋白G(Ig G)中的N-糖鏈，然后用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)衍生，19個(gè)N-糖鏈被穩(wěn)定釋放并檢測(cè)。為了進(jìn)一步分析β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)糖肽的肽鏈序列和糖鏈結(jié)構(gòu)，李玲梅等[19]結(jié)合使用PNGase F與Endo H兩種酶切技術(shù)鑒定糖基化位點(diǎn)。PNGase F可以特異性酶切Asn與糖鏈之間的糖肽鍵，而Endo H可以特異性酶切糖鏈五糖核心結(jié)構(gòu)中2個(gè)N-乙酰葡萄糖胺(N-GlcNAc)殘基之間的糖苷鍵，這2種方法酶解同一種糖肽所得肽段在分子量上相差202 Da，這一特點(diǎn)可用于精確鑒定糖基化位點(diǎn)。酶解后的N-糖鏈與肽段經(jīng)MS分析，發(fā)現(xiàn)PNGase F 酶解所得肽鏈共有16個(gè)質(zhì)譜峰，Endo H 酶解所得肽鏈共有14個(gè)質(zhì)譜峰，對(duì)Endo H 與PNGase F 酶解后所得肽鏈進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，2個(gè)樣品均有9條肽鏈，每條肽鏈都含有1個(gè)糖基化位點(diǎn)，而且每種Endo H 水解產(chǎn)物的分子量均比相應(yīng)的PNGase F 水解產(chǎn)物大202 Da。最后通過數(shù)據(jù)庫檢索對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)β-conglycinin上含有5個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別為α亞基199位和455位的Asn，α′亞基215位和489位的Asn以及β亞基326位的Asn。

針對(duì)研究目的不同，也有學(xué)者采用其他不同的酶來切割N-糖鏈，比如，徐莎等[20]為了簡化被切下來的N-糖鏈的衍生過程，使用非特異性酶鏈酶蛋白酶E(pronase E)對(duì)牛胰核糖核酸酶B(ribo B)和雞白蛋白(chicken albumin)進(jìn)行酶切，得到只帶一個(gè)天冬氨酸的閉環(huán)N-糖鏈，這樣由于引入了天然的-NH2活性基團(tuán)，再以9-氯甲酸芴甲酯(Fmoc-Cl)對(duì)其衍生，可以省略N-糖鏈進(jìn)一步分析前必須先衍生成糖胺的步驟，進(jìn)而提高了整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程的穩(wěn)定性。不管采用何種酶切與衍生手段，最終都是為了提供一個(gè)高靈敏度的檢測(cè)，便于后面的分析，但真正關(guān)鍵的地方在于N-糖鏈的分離與分析。N-糖鏈?zhǔn)且活悩O性很強(qiáng)的化合物，在反相色譜(reversed phase chromatography, RPLC)中基本沒有保留，實(shí)驗(yàn)多采用親水色譜(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)來對(duì)其分析，再結(jié)合熒光檢測(cè)、MS等對(duì)其檢測(cè)[21]。

酶解釋放N-糖鏈具有高效、快速、專一的特點(diǎn)，但成本高昂，近年來化學(xué)法釋放N-糖鏈因其較低的成本與廣譜性，也得到了一定的發(fā)展。N-糖鏈的化學(xué)釋放主要依賴于肼、次氯酸鈉和氨水等化學(xué)試劑。肼解反應(yīng)能在95℃反應(yīng)4 h的條件下釋放N-糖鏈，但它需要嚴(yán)格的無水肼條件，并且反應(yīng)伴有嚴(yán)重的脫乙?；狈磻?yīng)[22]。次氯酸鈉是通過氧化來釋放N-糖鏈，此方法雖然能大規(guī)模釋放N-糖鏈，但會(huì)使N-糖鏈還原末端的N-GlcNAc丟失[23]。針對(duì)上述情況，袁江北等[24]開發(fā)了一種簡單、經(jīng)濟(jì)、快速的非特異性釋放N-糖鏈的方法，實(shí)驗(yàn)采用NaOH體系對(duì)N-糖鏈進(jìn)行完整的釋放，糖蛋白樣品置于50℃、0.5 mol/L NaOH溶液中反應(yīng)16 h。MS分析結(jié)果表明該方法具有通用性好、釋放效率高、無副反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，N-糖鏈的釋放效率能達(dá)到PNGase F酶的90%以上，并且通過此方法得到的N-糖鏈都是還原性寡糖，可以標(biāo)記熒光試劑，目前已成功的用此方法對(duì)Ribo B、雞白蛋白、人胎球蛋白和人血漿的N-糖鏈進(jìn)行了解析。

2 N-糖鏈的分離分析方法

2.1 電泳法

CE以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場驅(qū)動(dòng)帶電荷樣品移動(dòng)實(shí)現(xiàn)分離，具有分離效率高、樣品消耗少等優(yōu)點(diǎn)，在復(fù)雜糖鏈結(jié)構(gòu)表征中具有很大的應(yīng)用潛力[25]。硫酸化、唾液酸化的糖鏈自身帶有負(fù)電荷，可用電泳法分離純化，中性糖鏈通過與8-氨基芘-1,3,6-三磺酸(APTS)等作用形成帶電荷且具有熒光基團(tuán)的復(fù)合物，然后電泳分離[26]。王文波等[27]采用CE對(duì)原研抗CD20人鼠嵌合單抗和4個(gè)生物類似藥的N-糖譜進(jìn)行分析，比較它們之間的差異性。實(shí)驗(yàn)首先使用PNGase F對(duì)單抗Fc上的N-糖鏈進(jìn)行酶切釋放，然后用APTS標(biāo)記；毛細(xì)管電泳使用Beckman N-CHO涂層毛細(xì)管，以分離膠為電泳緩沖液，在30 kV電壓下分離，最后使用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(LIF)檢測(cè)，最終原研抗CD20單抗中6種N-糖鏈被分離檢測(cè)到。整個(gè)分離過程在20 min就可以完成，且經(jīng)過APTS衍生的N-糖在LIF檢測(cè)器下靈敏度可以達(dá)到amol級(jí)別。

電泳技術(shù)不僅可以對(duì)糖蛋白糖鏈進(jìn)行一定的分離純化，還可以給出其相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息。熒光輔助糖電泳(fluorescence-assisted carbohydrate electrophoresis, FACE)、CE等是糖鏈分離純化、結(jié)構(gòu)解析的常用工具，糖鏈在熒光標(biāo)記后進(jìn)行的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)電泳即FACE，通過外切糖苷酶陣列法(reagent array analyses method,RAAM)和標(biāo)準(zhǔn)糖鏈的比對(duì)可以給出目標(biāo)糖蛋白糖鏈的結(jié)構(gòu)信息。CE可快速分離分析微量糖鏈，且不同緩沖體系中標(biāo)準(zhǔn)糖鏈的CE行為構(gòu)建的糖譜，可以用于相關(guān)未知糖鏈的結(jié)構(gòu)鑒定。Karger等[28]報(bào)道了基于CE-LIF檢測(cè)的糖鏈檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了7 min內(nèi)Ig G中12種糖鏈異構(gòu)體的高效分離，并將該方法成功應(yīng)用于單抗類藥物糖型表征，為抗體類藥物的質(zhì)量控制提供了簡單、快速、靈敏的分析方法。李鳳等[29]使用自制的聚乙烯醇中性涂層柱，乙酸銨緩沖體系，建立了寡聚葡萄糖的分析方法，通過擬合多項(xiàng)式分布曲線發(fā)現(xiàn)葡聚糖的聚合度值(glucose units, Gus)與各組分電泳遷移時(shí)間相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.99。然后采用此方法對(duì)5 μL人血清中N-糖鏈進(jìn)行分析，初步分離得到了17個(gè)N-糖鏈組分，并建立指紋圖譜，為探索血清蛋白的糖基化變化提供了分析方法。

PAGE膠上酶解法可同時(shí)分析糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)和糖基化位點(diǎn)，適用于不易純化或量少的樣品，是糖組學(xué)糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)研究的有力工具。Rudd等[30]利用PAGE將待分析糖蛋白分離后，切割感興趣的條帶并用PNGase F酶解釋放糖鏈，再對(duì)糖鏈進(jìn)行標(biāo)記、分析。

2.2 液相色譜法

HPLC在分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)以及生物化學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用很廣泛[31]。N-糖鏈作為一類極性化合物，易溶于水、甲醇等極性溶劑，特別適合HPLC的分析。但是由于N-糖類化合物極性較強(qiáng)，在經(jīng)典的RPLC上幾乎無法保留，大都會(huì)被一起洗脫出來，并不適用于分離，即使是經(jīng)過一些弱極性集團(tuán)衍生過的N-糖也沒有較好的保留。基于這種情況，科學(xué)家發(fā)明了HILIC用于這種強(qiáng)極性化合物的分析，它與正相色譜(normal phase liquid chromatography, NPLC)的保留機(jī)理相似，但卻可以使用RPLC的流動(dòng)相，使整個(gè)分離條件更溫和，且有利于后續(xù)樣品檢測(cè)的順利進(jìn)行。

Henry等[32]采用超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography, UPLC)分離曲妥珠單抗上的N-糖鏈，并采用FLR與MS表征被分離的N-糖。實(shí)驗(yàn)通過PNGase F酶將單抗中的N-連寡糖釋放出來，游離的寡糖先用2-AB進(jìn)行標(biāo)記，然后在HILIC模式下進(jìn)行分離并使用FLR和串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(quadrupole-time of flight mass spectrometry,QTof)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)比3個(gè)批號(hào)曲妥珠單抗的N-糖的HPLC-FLR分析結(jié)果，被標(biāo)記的N-糖均得到較好的分離，17個(gè)糖型在35 min內(nèi)完成分離，各峰之間都實(shí)現(xiàn)了基線分離，結(jié)合FLR可以很好地用于各糖型的定量，且整個(gè)分析結(jié)果表現(xiàn)了出了很好的重現(xiàn)性。王文波等[33]利用UPLC串聯(lián)單四極桿檢測(cè)器(QDa)對(duì)抗CD20人鼠嵌合單抗的N-糖譜進(jìn)行定性和定量分析。CD20單抗的N-糖鏈經(jīng)PNGase F酶切釋放后用RapiFluor MS試劑進(jìn)行標(biāo)記，通過QDa對(duì)N-糖進(jìn)行糖型鑒別、FLR進(jìn)行定量檢測(cè)。UPLC條件采用酰胺色譜柱、乙腈-乙酸銨流動(dòng)相體系，在熒光檢測(cè)器下檢測(cè)到15種N-糖類型，在35 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離，并對(duì)其進(jìn)行定量，再結(jié)合QDa質(zhì)譜檢測(cè)器定性，很好的實(shí)現(xiàn)了抗CD20人鼠嵌合單抗中N-糖的表征情況。

HPLC因其高效穩(wěn)定的分離能力在N-糖的分析中非常重要，經(jīng)過HPLC的分離后，結(jié)合高靈敏度FLR檢測(cè)的數(shù)據(jù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)N-糖的定量分析，同時(shí)MS又能幫助確認(rèn)N-糖的結(jié)構(gòu)信息。鐵偲等[34]為了滿足IgG藥物N-糖分析的實(shí)際需要，建立了穩(wěn)定、靈敏的IgG藥物N-糖的分析方法，采用全新的肼基衍生化試劑對(duì)游離N-糖進(jìn)行衍生化，并對(duì)衍生化后的N-糖進(jìn)行LC-MS分析。實(shí)驗(yàn)同樣采用酰胺色譜柱，乙腈-碳酸氫銨流動(dòng)相體系。14個(gè)類型的N-糖被檢測(cè)到，其中麥芽五糖在30 ng/mL的低濃度下仍然實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)。整個(gè)分析方法高效快速，而且具有極高的靈敏度。

2.3 質(zhì)譜

ESI和基質(zhì)輔助激光解析(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)是目前用于糖鏈電離的兩種主要方法，并且在糖鏈離子化方面具有很強(qiáng)的互補(bǔ)性。此外，通過與多種高性能質(zhì)量分析器(三重四極桿、時(shí)間飛行、離子阱、傅里葉變換離子回旋共振等)串聯(lián)后，可以實(shí)現(xiàn)串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)或多級(jí)質(zhì)譜(MSn)分析，從而獲得更多的糖結(jié)構(gòu)信息。

2.3.1電噴霧電離質(zhì)譜 電噴霧電離質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)使溶液中的被分析化合物在電噴霧針里帶電、霧化后形成帶電荷的分子離子峰，離子再經(jīng)過質(zhì)量分析器分析獲得分子量相關(guān)信息。ESI-MS根據(jù)樣品的性質(zhì)可以產(chǎn)生多電荷離子，使得其質(zhì)量檢測(cè)范圍成倍增加，并且能夠獲得比單電荷母離子更多的結(jié)構(gòu)信息，對(duì)于大分子化合物的分子具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。但是對(duì)于ESI-MS而言，樣品的制備是十分復(fù)雜的，主要是因?yàn)槠淙菀资艿綐悠诽砑觿┖途彌_鹽的影響[35]。因此，其常常需要與HPLC、CE等技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用，結(jié)合HPLC與CE的分離能力對(duì)組分更為復(fù)雜的樣品進(jìn)行分離分析。例如Sethi等[36]通過使用PNGase F酶對(duì)3種不同表型的結(jié)腸癌細(xì)胞中的糖蛋白進(jìn)行酶解，得到的游離N-糖采用LC-ESI-MS/MS在負(fù)離子模式下進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種表型的結(jié)腸癌細(xì)胞中的甘露糖均有較高的表達(dá)(70%～90%)，同時(shí)揭示了二天線α-2，3-唾液酸N-糖結(jié)構(gòu)對(duì)于腫瘤細(xì)胞分型的影響。

N-糖鏈結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不同單糖之間具有多種連接方式，而一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)只能提供N-糖的質(zhì)量數(shù)，對(duì)其鏈接方式較難確定，串聯(lián)質(zhì)譜豐富的數(shù)據(jù)可以判斷、確定糖鏈的線性結(jié)構(gòu)。如潘麗英等[37]使用ESI-MS/MS分析人肝癌細(xì)胞HepG2和正常肝細(xì)胞L02中N-糖的差異，被PNGase F酶酶切下的游離N-糖鏈經(jīng)過串聯(lián)四極桿質(zhì)譜分析后，通過分析母離子與碎片離子，26種N-糖鏈被檢測(cè)并確認(rèn)，通過比較發(fā)現(xiàn)，HepG2的大多數(shù)高甘露糖型糖鏈、唾液酸化糖鏈和巖藻糖基化糖鏈的數(shù)量較L02都明顯升高。

對(duì)于糖鏈結(jié)構(gòu)的完全解析，則需要多級(jí)質(zhì)譜的數(shù)據(jù)來確定單糖的組成、序列、糖鏈的連接方式、糖鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等信息。在多級(jí)質(zhì)譜模式下，可以選擇特定的母離子，使用氣體進(jìn)行碰撞，依次產(chǎn)生子離子碎片。通過分析單糖與單糖之間的裂解信息，可以確定糖鏈序列，分析單糖的環(huán)內(nèi)裂解信息，可以確定糖鏈的分支情況。在確定碎片結(jié)構(gòu)后，將所有的碎片信息重組，可以獲得完整的糖鏈結(jié)構(gòu)信息。Reinhold團(tuán)隊(duì)[38～40]就應(yīng)用多級(jí)質(zhì)譜對(duì)糖鏈進(jìn)行測(cè)序，并提供了三種分析的策略和算法，對(duì)糖鏈的連接位點(diǎn)、單體、空間構(gòu)型等信息進(jìn)行了推測(cè)與判斷。

2.3.2基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜 MALDI-MS是一種直接氣化并離子化非揮發(fā)性樣品的質(zhì)譜離子化方式，整個(gè)電離過程可在極短的時(shí)間內(nèi)完成，且不產(chǎn)生熱分解。而且這種溫和的電離方式只產(chǎn)生單電荷分子離子，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)簡單，在糖組學(xué)分析中具有重要意義[41]。對(duì)N-糖鏈結(jié)構(gòu)分析時(shí)，酸性末端如唾液酸常在高能量的碰撞中丟失，MALDI因其溫和的電離方式可以得到準(zhǔn)確的分子離子峰。MALDI離子源常用Tof進(jìn)行檢測(cè)，這種組合成的質(zhì)譜被稱為基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)，主要用于完全甲基化的糖鏈分析[42]。MALDI-TOF-MS具有靈敏度高、分子質(zhì)量檢測(cè)精確度高、檢測(cè)速度快、成本低等特點(diǎn)。基于這些特征，Canis等[43]先用凝膠色譜和親和色譜對(duì)血清中的血管性血友病因子(vWF)進(jìn)行純化，并對(duì)酶解游離出的N-糖進(jìn)行了正負(fù)離子兩種模式的MALDI-TOF-MS分析，分析了300個(gè)人血管性血友病因子攜帶的N-糖譜，同時(shí)也證明了H抗原不受N-糖基化位點(diǎn)的影響。此外，MALDI-TOF-MS也是用于大規(guī)模體外診斷和生物標(biāo)志物研究的有力工具，Holst等[44]應(yīng)用MALDI-TOF-MS對(duì)25種不同的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系的N-糖譜進(jìn)行了大規(guī)模研究，發(fā)現(xiàn)了α-2，3和α-2，6連接的唾液酸糖肽在不同細(xì)胞膜蛋白的改變，并證明了高甘露糖型N-糖不僅存在于細(xì)胞內(nèi)前體上，也存在于細(xì)胞膜上。

3 展望

蛋白質(zhì)的糖基化作為調(diào)控蛋白質(zhì)功能的重要因素之一，糖基化位點(diǎn)的改變或者糖鏈結(jié)構(gòu)的改變都會(huì)引起蛋白質(zhì)功能的改變。無論是基于病變機(jī)理對(duì)糖基化的研究，還是糖蛋白藥物質(zhì)量穩(wěn)定性中關(guān)于糖基化的研究都至關(guān)重要。HPLC、CE與MS都是N-糖分析的有力手段，HPLC與CE用于不同糖型的分離，高效穩(wěn)定，且使用性非常廣，基本的N-糖都可以通過二者來分離，同時(shí)由于二者分析機(jī)理的差異性，又可以互補(bǔ)使用。FLR與MS作為N-糖分析時(shí)常用的檢測(cè)方式，具有非常高的靈敏度，尤其是經(jīng)過衍生后的N-糖被檢出的靈敏度更是大大增加。N-糖基化作為糖蛋白中最主要的糖基化類型，對(duì)其的定量定性分析既重要又困難。糖復(fù)合物中糖類分子的異常表達(dá)，重組糖蛋白生產(chǎn)時(shí)，生物合成共價(jià)寡糖出錯(cuò)都是非常致命的問題。而且N-糖鏈在整個(gè)糖蛋白中占比非常少，準(zhǔn)確、可重復(fù)的將其富集出來有較大的難度，在N-糖鏈的分離與解析時(shí)，因空間立體結(jié)構(gòu)差異較大，同樣也存在非常大的困難。應(yīng)該著重發(fā)展更穩(wěn)定可靠的N-糖釋放、富集方法，再結(jié)合現(xiàn)代高效分析手段，以及有針對(duì)性的N-糖解析措施，為N-糖基化高通量、高準(zhǔn)確性的分析提供依據(jù)。