小檗堿對高糖高脂飼料聯合鏈脲佐菌素誘導的糖尿病心肌病大鼠的保護作用

霍夢露，王瑞瑤，李超，關錫梅，倪偉建，唐麗琴

[1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，合肥 230031;2.中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)藥劑科]

糖尿病心肌病(DCM)糖尿病心肌病不加干預最終可發(fā)展成為心力衰竭、心律失常及心源性休克，是造成糖尿病患者高致死和致殘率的重要因素之一，因此積極的預防和治療糖尿病心肌病對糖尿病患者有著迫切的現實意義[1]。黃連是我國的常用中藥，古時常用于痢疾等胃腸道感染和消渴癥即糖尿病的治療。小檗堿(BBR)作為黃連的主要有效成分，已被現代動物實驗和臨床觀察證實可以降低血糖、降低血脂、改善胰島素抵抗，對2型糖尿病有積極的治療作用[2-3]，在糖尿病心肌病方面，課題組前期預實驗表明小檗堿可以降低糖尿病心肌病大鼠的血糖和血脂。本實驗將在預實驗的基礎上，通過檢測糖尿病心肌病大鼠心肌酶以及使用超聲心動圖法比較大鼠心臟結構和功能的變化，進一步觀察小檗堿對糖尿病心肌病大鼠心臟的作用。

1 材料與方法

1.1 動物及飼喂 清潔級雄性SD大鼠由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，生產許可證號：scxk (皖)2017-001，飼喂于中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院動物房，喂養(yǎng)時保持環(huán)境安靜，溫度控制在20～25 ℃，相對濕度控制在40%～70%，保持通風良好。實驗時間為2018年4月至10月。

1.2 試劑 高糖高脂飼料(20%蔗糖，10%豬油，6%蛋黃粉，0.5%膽鹽，63.5%基礎飼料[4])，由安徽中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供；鏈脲佐菌素(STZ)購自美國 Sigma-Aldrich 公司；BBR由中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院藥學實驗室提供；鹽酸二甲雙胍片(中美施貴寶公司生產)；鹽酸曲美他嗪片(天津施維雅公司生產)。

1.3 主要儀器 ME204E電子分析天平，Mettler Toledo 公司；ACS-DⅡ計重秤，上海乾峰電子儀器有限公司；SC-3610離心機，安徽中科中佳儀器有限公司；DMI3000B熒光倒置顯微鏡,德國萊卡；小動物超聲裝置vevo2100，加拿大Visual sonic公司；血糖檢測系統(tǒng)，湖南三諾生物傳感公司；日立全自動生化分析儀7600型，日立公司。

1.4 方法

1.4.1 模型的建立及指標檢測 雄性SD大鼠36只，按照隨機數字表法分為健康對照組(NC，n=6)和高糖高脂組(n=30)。

對照組大鼠以普通飼料喂養(yǎng)，高糖高脂組大鼠則喂以高糖高脂飼料，6周后，高糖高脂組的大鼠腹腔注射給藥STZ 30 mg/kg，(STZ溶液溶劑為pH 4.2～4.5枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液，避光，現配現用)，對照組注射等劑量的緩沖鹽溶液，3 d后和7 d后，禁食12h檢測大鼠的空腹血糖(FBG)，以連續(xù)2次血糖≥11.1 mmol/L視為糖尿病模型成功[5-6]，未成模大鼠再適量補充注射STZ，繼續(xù)高糖高脂飲食喂養(yǎng)12周成糖尿病心肌病模型。

模型大鼠隨機分為糖尿病心肌病模型組(DCM組，6只)，二甲雙胍組(二甲雙胍 200 mg/kg，6只)，曲美他嗪組(曲美他嗪 10 mg/kg，6只)，小檗堿低劑量組(BBR 100 mg/kg，6只)，小檗堿高劑量組(BBR 200 mg/kg，6只)。實際使用共30只模型大鼠及6只未建模對照鼠。

本實驗采用預防性給藥，即造成糖尿病模型開始給藥，持續(xù)12周。藥物均使用0.5%羧甲基纖維素鈉作為溶媒，每組按所示藥物種類和劑量進行灌胃，DCM組和NC組均以相同給藥途徑給予等量的溶媒，灌胃期間健康對照組以普通飼料喂養(yǎng)，其余各組繼續(xù)喂高糖高脂飼料。

1.4.2 超聲心動圖檢測大鼠心臟功能 灌胃給藥12周結束，對大鼠進行超聲心動圖檢測。將大鼠左胸前區(qū)域進行脫毛后，持續(xù)性用異氟烷(已使用霧化罐將其轉化為可吸入性氣體)麻醉，仰位固定于檢查臺上，臺溫設定為37℃[7]，使用超聲探頭尋找大鼠心臟胸骨旁左室長軸切面，左室短軸切面以及四腔心切面，分別保存長軸切面的B-MODE模式，短軸切面的M-MODE和四腔心切面的彩色多普勒模式下的動態(tài)圖像，所得圖像可使用儀器的所安裝的vevo 2100系統(tǒng)分析獲得大鼠的左心室射血分數(LVEF)，短軸收縮率(FS),E/A比值指標[8-10]。

1.4.3 大鼠血糖血脂和心肌酶的檢測 超聲心動圖檢測完畢后，大鼠禁食12 h，腹主動脈取血，3700 r/min,10 min，收集上層血清，采用全自動生化分析儀檢測血清中的肌酸激酶(CK),乳酸脫氫酶(LDH)，天冬氨酸氨基轉移酶(AST)[11-12],三酰甘油(TG)，膽固醇(TC)以及空腹血糖FBG的含量[13]。

1.4.4 計算心臟質量與體質量比(HW/BW) 大鼠處死前稱重，記錄下體質量(BW)，腹主動脈采血后，取下心臟使用冷的PBS清洗殘余血液，剪去多余的結締組織，天平稱心臟質量(HW)。計算HW/BW。

1.4.5 心臟組織的病理學檢測 沿心臟左心室橫切，將橫切面至心臟基底方向組織置于10倍體積的4%多聚甲醛中固定48 h后，石蠟包埋，切片，進行HE染色和Masson染色，顯微鏡觀察心肌組織切片病理變化[14]。

2 結果

2.1 動物一般情況觀察 實驗期間，NC組大鼠皮毛光潔，尾巴完整并呈現出健康粉紅色，精神狀況較好，DCM組大鼠毛發(fā)較臟，發(fā)暗發(fā)灰，爛尾，尿液中有糖類結晶析出，行動遲緩，有部分大鼠眼睛出現白色陰翳，BBR組和TMZ組相較于DCM組大鼠，毛色和精神狀態(tài)有明顯好轉。

2.2 HW/BW 相較于NC組，DCM組大鼠心臟質量與體質量比顯著升高(P<0.05)，提示DCM組已經發(fā)生了心臟的肥大病變；二甲雙胍組HW/BW相較于DCM組，比值有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),BBR高劑量組和TMZ組心臟質量占比與DCM組相比下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示BBR和TMZ對大鼠的心肌肥厚有抑制作用。見表1。

表1 小檗堿對糖尿病心肌病大鼠心臟質量/體質量的影響

注：與健康對照組比較，aP<0.05;與糖尿病心肌病模型組比較，bP<0.05

2.3 大鼠血糖血脂和心肌酶的檢測結果 DCM組大鼠的FBG、TG、TC含量顯著高于NC組(P<0.05)，這與文獻報道的糖尿病心肌病大鼠的特征相符，CK、LDH、AST值也呈現相同趨勢(P<0.05)；二甲雙胍可明顯降低大鼠血清中FBG、TC、AST(P<0.05)的含量而對其余指標無明顯影響。TMZ無法緩解糖尿病引起的高血糖(P>0.05)，高膽固醇(P>0.05)和高三酰甘油(P>0.05)癥狀，但可以減少心肌酶CK、LDH和AST(P<0.05)釋放入血的量；BBR高劑量組給藥12周后，與DCM組相比，高劑量組空腹血糖、三酰甘油、膽固醇、肌酸激酶、乳酸脫氫酶(P<0.05)都明顯降低，天冬氨酸氨基轉移酶的含量也有所下降(P<0.05)，低劑量組給藥組各指標水平也均下降，但僅TC、CK、LDH(P<0.05) 的水平與DCM組有差異，提示BBR對糖尿病心肌病的大鼠具有保護作用且呈一定的劑量相關性。見表2。

2.4 超聲心動圖檢測大鼠心臟的功能結果 臨床上常用來評價心臟收縮功能的主要有兩個指標：左室射血分數(LVEF)和短軸縮短率(FS),LVEF是指每搏輸出量占心室舒張末期容積量的百分比，FS是指左心室舒張末期內徑與收縮期內徑之差占左心室舒張末期內徑的百分比。E/A比值是心臟左心室舒張功能的標志。它表示舒張前期重力引起的從心房到心室血流的峰值流速(E波)與后期心房收縮引起的峰值流速(A波)之比。根據心臟短軸切面獲得M-mode圖像分析統(tǒng)計EF和FS值，四腔心切面的彩色多普勒圖像分析E/A值，具體結果如下圖3，與NC組相比，DCM組大鼠的LVEF，FS，E/A比值(P<0.05)下降,提示糖尿病心肌病模型組大鼠心肌已經出現了收縮和舒張功能的損傷；二甲雙胍組的LVEF，FS，E/A有輕微的提升，但與DCM組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；TMZ提高心臟功能的作用較為顯著，LVEF，FS和E/A(P<0.05)值與DCM組比較上升明顯；BBR低劑量組可提高EF值(P<0.05),而高劑量組可以改善心臟的LVEF，FS，E/A(P<0.05)，提高心臟的收縮的舒張功能。見表3。

2.5 HE染色和Masson染色結果 HE染色中心肌纖維紅染，細胞核藍染，從圖1可看出NC組鼠心肌纖維形態(tài)均勻，排列規(guī)律緊密，細胞核藍染清晰可見；DCM組心肌排列疏松紊亂，肌纖維肥大斷裂，有空泡樣變性，細胞核深染；二甲雙胍組，TMZ組和BBR組經藥物治療后，心肌損傷情況有不同程度的改善，心肌排列較DCM組規(guī)則且細胞核清晰可見。

Masson染色可直觀顯示出心肌組織內膠原沉積情況，肌纖維經著色后成紅色，膠原纖維呈藍色。NC組大鼠心臟膠原組織分布均勻，含量適宜，血管周圍纖維化程度較輕；DCM組大鼠可見藍染部分即膠原組織明顯增多，相互連接成網狀，排列紊亂，分布不均，血管周圍纖維組織明顯增多；各給藥組心肌纖維化情況均有所改善，以TMZ組效果最佳，BBR高劑量和低劑量組也顯示出了抗纖維化的作用。見圖2。

表2 小檗堿對大鼠血清血脂和心肌酶指標的影響

注：FBG為空腹血糖，TG為三酰甘油，TC為膽固醇，CK為肌酸激酶，AST為天冬氨酸氨基轉移酶，LDH為乳酸脫氫酶；與健康對照組比較，aP<0.05;與糖尿病心肌病模型組比較，bP<0.05

表3 小檗堿對糖尿病心肌病大鼠心臟功能的影響

注：與健康對照組比較，aP<0.05;與糖尿病心肌病模型組比較，bP<0.05

圖1小檗堿對心肌組織的影響(HE染色，200×)。A：健康對照組，B：糖尿病心肌病模型組(紅色箭頭處肌纖維斷裂，黑色箭頭處細胞核呈空泡樣改變)，C：二甲雙胍組，D：曲美他嗪組，E：小檗堿低劑量組(100 mg/kg)，F：小檗堿高劑量組(200 mg/kg)

圖2小檗堿對心肌組織纖維化的影響(Masson染色，200×)。A：健康對照組，B：糖尿病心肌病模型組(黑色箭頭所指示為血管，紅色箭頭所指示為膠原纖維)，C：二甲雙胍組，D：曲美他嗪組，E：小檗堿低劑量組(100 mg/kg)，F：小檗堿高劑量組(200 mg/kg)

3 討論

糖尿病心肌病是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，現糖尿病心肌病的動物造模多采用先高糖高脂飼料加上小劑量的注射STZ建立糖尿病模型[15]，再繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)6～16周時間以誘導出糖尿病心肌病，目前糖尿病心肌病模型的驗證尚無統(tǒng)一定論，主要集中在血糖血脂水平的檢測，大鼠心臟功能的評價以及病理切片染色觀察等方面，本實驗結合了急性心肌梗死死心肌細胞釋放入血的心肌酶譜，在常規(guī)的血糖血脂指標檢測的基礎上考察了CK、LDH、AST的含量，并使用無創(chuàng)的超聲心動圖進一步驗證實驗結束時糖尿病心肌病模型建立的成功與否以及小檗堿對糖尿病心肌病大鼠的保護作用。

CK、LDH、AST是心肌細胞胞內酶，亦是屬于心肌酶譜的酶類，在正常狀態(tài)時催化細胞的代謝活動，當心肌細胞受到損傷發(fā)生壞死時，可破裂釋放入血，血液中含量增加，因此，臨床上一般用心肌酶的水平來間接衡量心肌細胞的損害程度。非侵入式超聲心動圖作為臨床上檢測心臟功能的常用手段，受限于儀器昂貴的成本，近些年才在動物實驗中普及開，其相較于之前常采用的左心室插管測定血流動力學指標的方法，具有無創(chuàng)性、直觀性、節(jié)約樣本量的優(yōu)點。本研究從超聲心動圖所獲得的心臟信息中選取較為常用的收縮功能指標(EF和FS)，舒張指標(E/A)，通過數理統(tǒng)計分析的方法比對模型組與對照組的，給藥組和模型組的數據得出造模和藥物干預得結果。

本實驗采用高糖高脂飲食喂養(yǎng)6周后小劑量注射STZ并繼續(xù)高糖高脂喂養(yǎng)12周成功復制出糖尿病心肌病的大鼠模型。小檗堿給藥12周后可降低大鼠的血糖、血膽固醇和三酰甘油、心臟質量與體質量比，其中高劑量干預組與模型組差異有統(tǒng)計學意義，與本課題前期的預實驗結果相一致。小檗堿高劑量組也能顯著性地降低血清中CK、LDH、AST的含量，顯示出了對心肌細胞的保護作用，糖尿病心肌病大鼠的收縮和舒張功能經過灌胃給藥小檗堿后，也有顯著性提高，HE和Masson特異性染色可看出小檗堿給藥組心肌纖維化降低，肌纖維排列緊密，有序化程度升高，細胞核均勻分布，染色深淺適宜。因此可得出結論，小檗堿對糖尿病心肌病大鼠的心肌和心臟功能具有一定的保護作用，這種保護作用可能與調節(jié)AMPK相關信號轉導通路有關。