吡格列酮對X線照射后成纖維細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶-9和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1表達(dá)的影響

張一思，劉秀麗，潘潔，劉思涵，王文聞

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤一科，哈爾濱 150001)

X線放射治療是臨床治療惡性腫瘤的常見手段。射線除了對腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，還可能對正常組織有損傷，其中較嚴(yán)重的放射性損傷為炎性損傷和纖維化損傷。過氧化物酶體增殖因子活化受體γ(PPAR-γ)可以調(diào)節(jié)糖脂類的代謝及血管的炎性增殖等關(guān)鍵蛋白的基因表達(dá)，對非放療導(dǎo)致的炎性反應(yīng)及間質(zhì)纖維化有抑制作用。但PPAR-γ對放療導(dǎo)致的纖維化損傷及炎性損傷方面尚無太多報道?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)高表達(dá)可導(dǎo)致膠原系統(tǒng)破壞及變性膠原纖維增多。TIMPs家族中的組織金屬蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)是組織中MMPs的特異性抑制物之一。TIMPs與MMPs在體內(nèi)的平衡是保障組織細(xì)胞的增殖、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要條件。本文擬觀察正常小鼠L929細(xì)胞受到X線照射后分泌的MMP-9和TIMP-1表達(dá)的變化，及加入PPAR-γ配體吡格列酮活化L929細(xì)胞后對以上因子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞獲取及種植 L929細(xì)胞購自上海細(xì)胞庫(批號：170622)。使用復(fù)蘇后第3～10代細(xì)胞，細(xì)胞密度為2×104/mL。按每孔200 μL接種于96孔板中。每組設(shè)5個重復(fù)孔。將胰酶加入10 %胎牛血清+1 %青鏈霉素+RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute,洛斯維·帕克紀(jì)念研究所)培養(yǎng)液，消化3 min，放入離心機(jī)(離心半徑15 cm,轉(zhuǎn)速1000 r/min)離心5 min，棄上清，加培養(yǎng)液吹打成細(xì)胞懸液，移至培養(yǎng)瓶，放入5 % CO2、37 ℃的CO2孵箱。采用RT-PCR法證實L929細(xì)胞中是否存在PPAR-γ表達(dá)。

1.2 細(xì)胞照射及藥物處理 采用X線(劑量率450 cGy/min，10 Gy)于室溫下對L929細(xì)胞分別照射。L929細(xì)胞生長至90 %融合狀態(tài)時更換0.1 %胎牛血清培養(yǎng)基孵育24 h，使細(xì)胞不處于增殖狀態(tài)，用RT-PCR方法觀察照射前與照射后0 h、2 h、7 h、24 h和48 h時 L929細(xì)胞中的MMP-9，TIMP-1的表達(dá)情況。再給予上述L929細(xì)胞以吡格列酮(北京太洋藥業(yè)股份有限公司，批號:161008)，30 μmol/L處理10 h后照射，照射結(jié)束后不更換培養(yǎng)基，將細(xì)胞送回CO2孵箱，按實驗設(shè)計時間收取樣品。用RT-PCR方法觀察照射48 h時L929細(xì)胞中的MMP-9，TIMP-1表達(dá)。用二甲基亞砜(DMSO)溶解PPAR-γ配體，DMSO終濃度<1‰。

1.3 細(xì)胞總RNA提取 處理后的L929細(xì)胞去除培養(yǎng)基，PBS沖洗2次置于直徑10 cm培養(yǎng)皿中，加入1 mL Trizol在室溫下輕搖培養(yǎng)皿5 min；再移至離心管中加入200 μL氯仿震動15 s，室溫下放置3 min后離心(離心半徑15 cm,轉(zhuǎn)速12 000 r/min，4℃)15 min。吸出上層水相移至離心管，再加入0.5 mL異丙醇，充分混勻后于室溫下擱置10 min再離心(離心半徑15 cm,轉(zhuǎn)速12 000 r/min，4 ℃)10 min，棄上清；RNA沉于管底，用1 mL 75 %乙醇輕輕沖洗后再離心(離心半徑15 cm,轉(zhuǎn)速8 000 r/min，4 ℃)5 min，棄上清；再加入DMSO的0.9%氯化鈉注射溶液溶解RNA，采用酶標(biāo)儀A260、A280檢測RNA的純度和濃度。樣本用后至于-80 ℃冰箱長期保存。

1.4 RT-PCR方法 取500 μg的RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA(complementary DNA，互補(bǔ)DNA)，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa:DRR037A)說明書進(jìn)行規(guī)范化操作，于總反應(yīng)體積10 μL中加入反轉(zhuǎn)錄酶和引物，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，得到cDNA。PCR擴(kuò)增：用擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa:DRR003A)中PremixTaq 12.5 mL得到的cDNA 2 μL，上下游引物(20 μM)各0.5 μL，補(bǔ)足滅菌蒸餾水至25 μL。引物序列分別為:PPAR-γ順式5′-TTTTCAAGGGTGCCAGTTC-3′，反式5′AATCCTTGGCCCTCTGAGAT-3′，擴(kuò)增片斷長198 bp。MMP-9順式5′-TTCACCGGCTAAACCACCTC-3′反式5′-CATGCATGTGAACATAACCTCA-3′擴(kuò)增片斷長73 bp。TIMP-1順式5′-ACAGACAGCCTTCTGCAACTCPC-3′，反式5′-ACTGCGGTTCTGGGACTTG-3′，擴(kuò)增片斷長217 bp。GAPDH順式5′-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3′，反式5′GGACACATTGGGGGTAGGAACA-3′，擴(kuò)增片斷長225 bp。反應(yīng)條件為95 ℃，5 s一個循環(huán)，95 ℃，5 s；55 ℃，30 s；70 ℃，30 s，30個循環(huán)。用3%的瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物。用凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)分析結(jié)果。內(nèi)參照為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 11.5軟件對不同時點MMP-9、TIMP-1的電泳結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果有差異后采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPAR-γ表達(dá) RT-PCR的電泳結(jié)果顯示，L929細(xì)胞中存在PPAR-γ的表達(dá)，如圖1所示。

圖1 L929細(xì)胞表達(dá)PPAR-γ的電泳圖

2.2 單純照射的RT-PCR結(jié)果 經(jīng)X線照射不同時間L929細(xì)胞中MMP-9的電泳結(jié)果顯示，未經(jīng)照射(0 h)的L929細(xì)胞和經(jīng)X線照射的L929細(xì)胞胞核中都有MMP-9的表達(dá)，照射后0 h、2 h、7 h、24 h、48 h每一時間點與照射前的MMP-9表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，P均<0.05；照射后0 h、2 h、7 h、24 h每一時間點與其后各時間點的MMP-9表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，P均<0.05，而且隨照射后時間的延長其表達(dá)逐漸增加，在10 Gy照射后48 h表達(dá)最高(F=4.135，P=0.022)，見圖2。X線照射時間對TIMP-1表達(dá)的影響規(guī)律與MMP-9相反，隨照射后時間的延長TIMP-1表達(dá)逐漸減少，照射后0 h、2 h、7 h、24 h、48 h每一時間點與照射前的TIMP-1表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，P均<0.05；照射后0 h、2 h、7 h、24 h每一時間點與其后各時間點的TIMP-1表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，P均<0.05，在10 Gy照射后48 h TIMP-1表達(dá)最低(F=3.646，P=0.041)，見表1和圖3。

表1 不同時點L929細(xì)胞中MMP-9、TIMP-1表達(dá)的比較

注：MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶-9，TIMP-1為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1，下表、圖同；與其照射后各時間點同指標(biāo)的比較，aP<0.05；與其后各時間點同指標(biāo)的比較，bP<0.05

注：GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，下圖同

圖2不同劑量X線照射不同時間后L929細(xì)胞MMP-9 表達(dá)的典型電泳結(jié)果

圖3 不同劑量X線照射不同時間后L929細(xì)胞TIMP-1表達(dá)的典型電泳結(jié)果

2.3 加入吡格列酮后RT-PCR結(jié)果 照后48 h 用RT-PCR檢測結(jié)果顯示，吡格列酮降低了10 Gy照射誘導(dǎo)的MMP-9過度表達(dá)[0.76∶0.52 (F=3.735,P=0.024)]。吡格列酮升高了10 Gy照射誘導(dǎo)的TIMP-1過度抑制[0.17∶0.27 (F=3.908,P=0.032)]。見圖4,5。

注：Pio為吡格列酮；DMSO為二甲基亞砜

圖4X線照射后48 h不同處理條件下L929細(xì)胞MMP-9表達(dá)的典型電泳結(jié)果

圖5 不同處理條件下L929細(xì)胞TINMP-1表達(dá)的典型電泳結(jié)果

3 討論

腫瘤放療過程中組織出現(xiàn)的放射損傷在病理學(xué)上表現(xiàn)為慢性炎癥和修復(fù)共同作用的結(jié)果。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，MMPs與慢性炎性滲出和纖維化關(guān)系密切[1-4]。MMPs中MMP-9在多種細(xì)胞內(nèi)具有表達(dá)，作用底物廣泛。TIMP-1主要來源于L929細(xì)胞、各種腫瘤細(xì)胞、單核細(xì)胞等，其主要功能為調(diào)節(jié)細(xì)胞粘著，參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解與重建。TIMP-1是降解Ⅳ型膠原的主要酶，后者是細(xì)胞基膜的主要成分，其損傷可導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)異常通透性增高和炎性介質(zhì)滲出，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積纖維化形成。MMP-9在體內(nèi)的表達(dá)受多種因子的調(diào)控，包括特異性及非特異性調(diào)控因子。其中TIMP-1即為MMP-9的特異性抑制劑[5-6]。

肺纖維化(PF)的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確[7]。目前認(rèn)為，PF為肺間質(zhì)性疾病。其病理特點為長期的彌漫性肺泡炎癥和胞外基質(zhì)的過度沉積。對PF的治療尚缺乏有效、且副作用低的藥物。近年來PPAR-γ在PF中的作用受到學(xué)者們越來越多的關(guān)注。PPAR-γ屬于有配體激活的Ⅱ核受體超家族，其作用廣泛，除了參與脂質(zhì)代謝和體內(nèi)糖平衡外，還參與多種疾病的炎癥和纖維化過程。PPAR-γ具有抗炎抗纖維化作用[8-10]。

關(guān)于PPAR-γ在非放射性導(dǎo)致的炎癥和纖維化過程中的作用，現(xiàn)已有不少的報道。已有的研究顯示，PPAR-γ配體可抑制MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)TIMP-1的表達(dá)。Liu等[11]實驗中采用大鼠肝纖維化模型來考察羥基紅花黃色素A(HSYA)抗肝纖維化的作用機(jī)制。其實驗結(jié)果顯示，PPAR-γ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是肝纖維化病程中的關(guān)鍵通路，其在H SYA抑制肝纖維化作用機(jī)制中系通過促進(jìn)PPARγ表達(dá)、上調(diào)TIMP-1蛋白表達(dá)而起到預(yù)防肝纖維化的作用。周瑾等[12]實驗中考察腎間質(zhì)L929細(xì)胞(NRK-49F)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化時的MMP-9及其抑制因子TIMP-1表達(dá)的變化。其結(jié)果表明，TIMP-1基因蛋白表達(dá)水平的上調(diào)可減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而誘導(dǎo)腎間質(zhì)L929細(xì)胞的活化。周曉霞等[13]研究中應(yīng)用PPARγ激動劑-曲格列酮或GW9662-PPARγ拮抗劑分別對宮頸癌HeLa細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較,在干預(yù)后的不同時點(0、24 h、48 h和72 h)，激動劑組HeLa細(xì)胞的活性隨時間依賴性降低。其中干預(yù)48 h后激動劑組的ICAM-1和MMP-9和蛋白表達(dá)均明顯降低，而其HeLa細(xì)胞PPARγ和蛋白表達(dá)和PPARγ 核轉(zhuǎn)位水平均顯著增加。該研究結(jié)果表明，促進(jìn)PPARγ表達(dá)和PPARγ核轉(zhuǎn)錄水平可下調(diào)HeLa 細(xì)胞ICAM-1和MMP-9的合成,抑制HeLa細(xì)胞的增殖。尹鵬等[14]研究中探討替米沙坦對PPAR-γ及結(jié)腸癌SW480細(xì)胞TIMP-1表達(dá)水平的影響。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，替米沙坦干預(yù)后在不同時點(0、24 h和72 h) SW480細(xì)胞活性逐漸降低，而TIMP-1、PPAR-γ和蛋白的表達(dá)呈時間依賴性遞增。該結(jié)果表明，上調(diào)PPAR-γ表達(dá)可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞TIMP-1的合成和分泌,而導(dǎo)致SW480細(xì)胞生長和侵襲能力的降低。王闖[15]研究中探討了肝細(xì)胞癌PPARγ/PTEN/MMP-9信號通路的存在及其MMP-9表達(dá)水平。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PPARγ配體即15-脫氧-前列腺素J2(15-d-PGJ2)處理后，對肝癌細(xì)胞增殖有劑量依賴性的抑制作用，且上調(diào)PTEN和蛋白的表達(dá)，減少MMP-9和蛋白的表達(dá)；而PPARγ抑制劑GW9662可扭轉(zhuǎn)這一作用。該結(jié)果表明，通過PPARγ/PTEN/MMP-9信號通路下調(diào)MMP-9表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。還有其他學(xué)者的研究結(jié)果表明，PPAR-γ配體能抑制MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)TIMP-1的表達(dá)。李春陵等[16]研究中考察丹參酮ⅡA 磺酸鈉對慢性阻塞性肺疾病(COPD)氣道重塑大鼠PPARγ和核因子-κB 表達(dá)的作用。其結(jié)果顯示，經(jīng)丹參酮ⅡA 磺酸鈉干預(yù)后大鼠血清MMP-9等含量明顯降低，而TIMP-1、TIMP-2表達(dá)明顯升高。該結(jié)果表明，調(diào)節(jié) PPARγ表達(dá)可抑制MMP-9、TIMP-1、TIMP-2等因子的表達(dá)水平。Chuang等[17]考察槲皮素代謝產(chǎn)物qP對細(xì)胞侵襲和遷移的作用。其結(jié)果可見，qP以劑量依賴的方式可抑制MMPs表達(dá)和細(xì)胞的侵襲和遷移，而PPAR-γ拮抗劑GW9662可對抗這一作用。該結(jié)果表明，對PPARγ的上調(diào)作用于MMP-9、TIMP-1、TIMP-2等因子從而抑制了細(xì)胞的侵襲和遷移。鄒娜等[18]研究中對子癇前期患者胎盤組織中的MMP-2、TIMP-2、PPARγ表達(dá)及臨床意義進(jìn)行考察。其結(jié)果可見，MMP-2的表達(dá)水平從正常足月妊娠、到輕度子癇前期、再到重度子癇前期呈下降趨勢，而TIMP-2、PPARγ表達(dá)水平有升高趨勢。其相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MMP-2與TIMP-2和PPARγ表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。該結(jié)果表明，子癇前期患者胎盤組織中可見MMP-2表達(dá)的下調(diào)，而TIMP-2和PPARγ的表達(dá)為上調(diào)，可見MMP-2、TIMP-2、PPARγ的表達(dá)是負(fù)相關(guān)的。

如上已有的研究結(jié)果均提示，MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平的變化與非放療所致的炎性反應(yīng)、間質(zhì)纖維化的進(jìn)程等有關(guān)，而PPAR-γ能夠調(diào)節(jié)炎性增殖相關(guān)的關(guān)鍵蛋白的基因表達(dá)、從而起到抑制炎癥和組織纖維化的作用。但目前PPAR-γ在放射導(dǎo)致的炎癥和纖維化過程中的作用還少有報道。

本研究中通過添加PPAR-γ配體吡格列酮使其活化后作用于被X線照射后的L929細(xì)胞，旨在觀察L929細(xì)胞分泌MMP-9，TIMP-1表達(dá)的變化情況。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，X射線照射L929細(xì)胞后出現(xiàn)纖維化相關(guān)因子MMP-9表達(dá)升高，TIMP-1表達(dá)降低。筆者分析，L929細(xì)胞受X線照射48 h后出現(xiàn)了早期炎性反應(yīng)，故MMP-9表達(dá)增高，TIMP-1表達(dá)降低。

熊園園[19]考察了2型糖尿病患者血清中TIMP-2、hs-CRP及腎臟NF-κB表達(dá)的相關(guān)性。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療后NF-κB在吡格列酮組大鼠腎組織中的表達(dá)多呈弱陽性，較糖尿病模型組大鼠的表達(dá)降低，表明吡格列酮能抑制TIMP-2、NF-κB、hs-CRP等炎性因子的表達(dá)，降低血糖,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡。劉春麗等[20]考察了吡格列酮對高脂血癥大鼠MMP-2、MMP-9表達(dá)的作用。其結(jié)果可見吡格列酮組大鼠MMP-2、MMP-9表達(dá)水平均顯著下降，表明吡格列酮可抑制MMP-2、MMP-9表達(dá)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，吡格列酮可使MMP-9高表達(dá)降低，使TIMP-1低表達(dá)升高，本研究結(jié)果表明吡格列酮可以抑制MMP-9表達(dá)、促進(jìn)TIMP-1表達(dá)。

徐龍[21]研究中對放療所致放射性肺纖維化的發(fā)生規(guī)律與其分子機(jī)制進(jìn)行了考察。其實驗中建立了雌性C57BL/6小鼠放射性肺纖維化模型，分別于照射后1、3、6個月觀察小鼠肺組織中MMP-9及其抑制劑TIMP-1的表達(dá)。其結(jié)果可見，照射后小鼠肺組織的MMP-9、TIMP-1表達(dá)均顯著性增加,隨時間延長MMP-9增加更明顯。其結(jié)果表明，調(diào)節(jié)肺組織內(nèi)MMP-9/TIMP-1比例可減輕小鼠放射性肺纖維化的病變程度。在本研究中，將添加PPAR-γ配體的吡格列酮活化后作用于被X線照射后的L929細(xì)胞，本研究得到的結(jié)果證實TIMP-1為MMP-9的特異性抑制劑、兩者在體內(nèi)表達(dá)水平的相反升降趨勢，本研究結(jié)果也表明PPAR-γ配體吡格列酮對成纖維細(xì)胞分泌MMP-9，TIMP-1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。本研究得出的結(jié)果與如上已有的文獻(xiàn)對于PPAR-γ、MMP-9及TIMP-1的報道均有一定程度的吻合。

綜上所述，X線照射初期使L929細(xì)胞分泌MMP-9增多，TIMP-1減少，可能促使炎性因子的急性期滲出，最終促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積導(dǎo)致纖維化的形成，而PPAR-γ配體吡格列酮可以抑制這種表達(dá)，最終可能抑制X線導(dǎo)致的放射性纖維化的損傷反應(yīng)。