SPK1通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax途徑干擾LLC細胞凋亡*

呂冰潔, 趙 潔, 郝 東, 王曉芝, 王 濤, 李洪波, 楊 陽△

(濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院1呼吸與重癥醫(yī)學科，2老年醫(yī)學科，山東 濱州 256603)

近十幾年來非小細胞肺癌在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)增加的趨勢[1-2]，40%以上的非小細胞肺癌患者在接受治療后仍然會出現(xiàn)腫瘤復發(fā)[3]。目前針對非小細胞肺癌的治療手段主要包括手術(shù)治療、放療、化療及靶向治療，但晚期非小細胞肺癌患者的5年生存率仍然不到15%[4]。

細胞內(nèi)鞘磷脂代謝平衡在細胞的增殖與凋亡中發(fā)揮著重要的作用。體內(nèi)主要的鞘磷脂代謝物包括1-磷酸鞘氨醇、鞘氨醇以及神經(jīng)酰胺[5]，其中鞘氨醇和神經(jīng)酰胺可以促進細胞凋亡，抑制細胞生長，而1-磷酸鞘氨醇則可以抑制細胞凋亡，促進細胞生長。上述代謝產(chǎn)物之間相互平衡，保證了機體功能代謝的穩(wěn)定[6]。鞘氨醇激酶 1(sphingosine kinase 1，SPK1)是催化上述代謝產(chǎn)物之間相互轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，可以催化促凋亡因子鞘氨醇和神經(jīng)酰胺磷酸化形成抗凋亡因子1-磷酸鞘氨醇，因此SPK1的活化程度以及表達量的高低就決定了細胞凋亡的趨勢[7]。SPK1本身具有癌基因特性，當細胞中出現(xiàn)SPK1的過高表達時，一方面可促進細胞的增殖，一方面還有可能刺激細胞進行惡性轉(zhuǎn)化[8]。目前已有研究提出SPK1的高表達與多種腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)[9]。

雖然目前已有部分針對SPK1在細胞凋亡中作用的研究，但其相關(guān)下游信號通路的研究在國內(nèi)相對較少。小鼠Lewis肺癌(Lewis lung cancer，LLC)細胞可以在體外模擬非小細胞肺癌，本文通過將靶向SPK1基因的小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)真核表達載體轉(zhuǎn)染至LLC細胞，構(gòu)建SPK1沉默模型，觀察其凋亡率，并對轉(zhuǎn)染后的LLC細胞內(nèi)Bcl-2和Bax含量進行檢測，從而明確SPK1在Lewis肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及可能的機制。

材 料 和 方 法

1 細胞、主要試劑和儀器

LLC細胞購自于南京凱基生物有限公司。Lipofectamine 2000購自Invitrogen；T4 DNA ligase及T4 DNA ligase buffer 購自NEB；EcoR I及AgeI購自NEB；Taqpolymerase購自TaKaRa；Protein Marker及dNTP購自Promega；硝酸纖維素膜購自Pell；胰蛋白酶、高糖DMEM培養(yǎng)基以及胎牛血清購自Gibco； 抗SPK1抗體購自Abcam；抗GAPDH抗體購自Santa Cruz；所有引物委托上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司合成；抗Bcl-2及Bax抗體購自Cell Signaling；Bax ELISA試劑盒及Bcl-2 ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL化學發(fā)光試劑盒購自上海靜融生物科技有限公司。

熒光顯微鏡(Olympus)；全自動多功能酶標儀(Thermo)；流式細胞儀(Beckman Coulter)；紫外凝膠攝像分析儀(Bio-Rad)。

2 方法

2.1SPK1基因siRNA真核表達載體的構(gòu)建 根據(jù)既往研究中證實有效的針對SPK1基因的特異性siRNA序列，選擇5’-GGGCAAGGCTCTGCAGCTC-3’作為干涉靶序列，合成模板序列。引物序列由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司合成，正向引物序列為5′-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3′；反向引物序列為5′-GTAATACGGTTATCCACGCG-3′。將模版序列與AgeI及EcoR I雙酶切后的線性質(zhì)粒載體連接，然后將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細菌中，利用PCR擴增出全長序列，挑選陽性克隆送測序分析。

2.2siRNA轉(zhuǎn)染至LLC細胞 將LLC細胞接種在6孔板上，當細胞的密度約為70%～80%時進行轉(zhuǎn)染，嚴格按照Lipfectamine 2000說明書實驗步驟進行操作，取1 μg重組質(zhì)粒與2 μL Lipofectamine 2000混合．然后用無血清培養(yǎng)液稀釋至工作濃度。用稀釋后的Lipfectamine 2000-DNA混合液處理LLC細胞。在無血清培養(yǎng)基中，室溫下孵育20 min后開始轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換為含血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞。同時設置一個對照組，按上述步驟轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒(siRNA-SPK1-Neg)進入LLC細胞。

2.3熒光顯微鏡下觀察LLC細胞轉(zhuǎn)染情況 本實驗采用的質(zhì)粒含有增強型綠色熒光蛋白(enhanced green flurescent protein，EGFP)，成功導入細胞后能夠呈陽性表達，在波長488 nm的藍光激發(fā)下可發(fā)出綠色熒光。在轉(zhuǎn)染48 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染的情況，并拍照存檔。

2.4Western blot 檢測轉(zhuǎn)染后LLC細胞中SPK1、Bcl-2及Bax蛋白的表達水平 將收集的siRNA-SPK1組及siRNA-SPK1-Neg組細胞均用預冷的生理鹽水清洗，每孔加入裂解液150 μL，向其中加入1∶100的PMSF，置于冰上裂解 20 min。采用BSA法對蛋白總量進行檢測，制備后的蛋白樣本進行SDS-PAGE，用PVDF膜轉(zhuǎn)印蛋白。采用5%的脫脂奶粉將PVDF膜在室溫下封閉2 h，然后分別向siRNA-SPK1組及siRNA-SPK1-Neg組細胞中加入1∶1 000稀釋的I抗或1∶5 000用抗體稀釋液稀釋的GAPDH(內(nèi)參照)抗體，慢搖4 h后放置于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜。過夜后漂洗封閉液，向其中加入1∶3 000稀釋的 II 抗，室溫下置于搖床上孵育90 min，再次進行漂洗，然后采用電化學發(fā)光液化學發(fā)光試劑盒對其進行增強發(fā)光，最后用X線膠片進行顯影。實驗重復進行3次。

2.5Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后LLC細胞的凋亡率 選取處于對數(shù)生長期的LLC細胞，將其制備為細胞懸液，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。嚴格按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，用流式細胞儀進行LLC細胞凋亡率的檢測。每份樣品收集1×104個細胞。

2.6ELISA法檢測Bax和Bcl-2的蛋白水平 采用ELISA法檢測2組細胞中Bax和Bcl-2的蛋白水平，操作步驟嚴格按照試劑盒使用說明書進行，實驗重復3次。

3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 質(zhì)粒載體測序鑒定

經(jīng)測序結(jié)果證實質(zhì)粒載體構(gòu)建成功，見圖1(此部分由上海吉凱基因化學有限公司完成)。

Figure 1.Plasmid vector sequencing results.

圖1 質(zhì)粒載體測序結(jié)果

2 熒光顯微鏡下觀察LLC細胞的轉(zhuǎn)染情況

轉(zhuǎn)染后的LLC細胞在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光，表明轉(zhuǎn)染成功，見圖2。

Figure 2.The transfection efficiency of LLC cells was observed under fluorescence microscope (×10).

圖2 熒光顯微鏡下觀察LLC細胞轉(zhuǎn)染情況

3 Western blot 檢測轉(zhuǎn)染后LLC細胞中SPK1蛋白的表達水平

Western blot結(jié)果顯示，siRNA-SPK1組細胞SPK1的蛋白表達較siRNA-SPK1-Neg組低，表示siRNA-SPK1組細胞SPK1蛋白表達受抑制(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The protein expression level of SPK1 in the LLC cells after transfection was determined by Western blot. MeanSD.n=3.**P<0.01vssiRNA-SPK1-Neg group.

圖3 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后LLC細胞中SPK1蛋白表達水平的變化

4 Annexin V-FITC/PI雙染及流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后LLC細胞凋亡率

培養(yǎng)48 h后，siRNA-SPK1-Neg組凋亡率為7.33%±1.09%，siRNA-SPK1組凋亡率為21.37%±1.28%，與siRNA-SPK1-Neg組相比，siRNA-SPK1組細胞凋亡率明顯高于siRNA-SPK1-Neg組(P<0.01)，見圖4。這說明在LLC細胞中，干擾SPK1的表達可促進LLC細胞的凋亡。

5 Western blot 檢測LLC細胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達水平

Western blot結(jié)果顯示，siRNA-SPK1組中Bax蛋白表達水平高于siRNA-SPK1-Neg組，Bcl-2 蛋白表達水平低于siRNA-SPK1-Neg組，見圖5。

6 ELISA法檢測LLC細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達水平比較

ELISA 結(jié)果顯示，siRNA-SPK1組中Bax的表達水平為14.28±2.09，siRNA-SPK1-Neg組Bax的表達水平為6.49±1.17，siRNA-SPK1組中Bax表達水平顯著高于siRNA-SPK1-Neg組(P<0.01)；siRNA-SPK1組中Bcl-2的表達水平為5.49±0.99，siRNA-SPK1-Neg組Bcl-2的表達水平為10.28±1.32，siRNA-SPK1組中Bcl-2表達水平顯著低于siRNA-SPK1-Neg組(P<0.01)，見圖6。

討 論

本研究中選取的LLC細胞可以在體外模擬非小細胞肺癌。在既往研究中，Song等[10]發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌的病例中SPK1水平顯著增加，人為的上調(diào)SPK1表達水平可以抑制由多西紫杉醇及阿霉素誘導的細胞凋亡，其機制可能與抗凋亡蛋白Bcl-xL、TRAF1、C-IAP1以及C-IAP2的表達有關(guān)[10]。Johnson等[11]發(fā)現(xiàn)在25例非小細胞肺癌標本中SPK1的mRNA以及蛋白水平均明顯增加，說明了SPK1在非小細胞肺癌肺癌的發(fā)生過程中起到了一定的作用。Salinas等[12]在研究中提出，腹腔注射SPK1可以增強化療藥物多西他賽對非小細胞肺癌的敏感性。Pchejetski等[13]也提出在多種腫瘤的發(fā)展過程中,抑制SPK1活性可以增強化療的敏感性。本研究通過流式細胞術(shù)檢測siRNA-SPK1組與siRNA-SPK1-Neg組細胞的凋亡率得出，SPK1蛋白低表達的siRNA-SPK1組凋亡率高于SPK1蛋白正常表達的siRNA-SPK1-Neg組，說明在LLC細胞中，干擾SPK1的表達可促進LLC細胞的凋亡，與上述既往的研究結(jié)果一致。雖然目前已有部分針對SPK1在細胞凋亡中的研究，但其相關(guān)下游信號通路的研究相對較少。

Figure 4.The apoptosis of LLC cells after transfection was analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiRNA-SPK1-Neg group.

圖4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后LLC細胞凋亡

Figure 5.The images of Western blot for determining the protein levels of Bcl-2 and Bax in the LLC cells.

圖5 Western blot 檢測LLC細胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達水平

Figure 6.The protein expression levels of Bcl-2 and Bax in the LLC cells measured by ELISA. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiRNA-SPK1-Neg group.

圖6 ELISA法檢測LLC細胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達水平

為了進一步了解SPK1在LLC細胞凋亡發(fā)展過程中所處的地位和作用，我們利用Western blot技術(shù)及ELISA技術(shù)對完成SPK1轉(zhuǎn)染后的LLC細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax進行了檢測。Bcl-2蛋白家族可以分為促凋亡因子以及抗凋亡因子，其中促凋亡因子主要有Bax、Bak、Bad、BclXS、Bid以及Bik等，而抗凋亡因子則主要有Bcl-2及Bcl-xL等，它們在細胞中的表達對調(diào)控細胞凋亡具有重要意義[14]。本研究中所選取的Bcl-2和Bax則是近年來Bcl-2家族研究中最具有代表性的抗凋亡因子及促凋亡因子。Bcl-2和Bax蛋白相互作用可形成異源二聚體，從而抑制凋亡；而若是Bax蛋白之間相互作用則可形成同源二聚體，從而促進凋亡[15]。若細胞中出現(xiàn)Bax過表達，可導致細胞內(nèi)caspase激活數(shù)量增加[16]，并且可拮抗Bcl-2對細胞的保護作用從而引起細胞的凋亡[17]。本研究對凋亡相關(guān)蛋白進行檢測后發(fā)現(xiàn)，LLC細胞在完成轉(zhuǎn)染后，細胞中SPK1蛋白含量減少，并且在SPK1蛋白含量減少的siRNA-SPK1組中Bcl-2和Bax含量與siRNA-SPK1-Neg組相比發(fā)生顯著改變，其中抗凋亡蛋白Bcl-2含量減少，促凋亡蛋白Bax含量增加。結(jié)合本研究中流式細胞術(shù)檢測到的結(jié)果(siRNA-SPK1組較siRNA-SPK1-Neg組的凋亡率高)，可以得出結(jié)論，干擾SPK1的表達可以通過提高Bax表達水平和降低Bcl-2表達水平的途徑來發(fā)揮誘導非小細胞肺癌細胞凋亡的作用。

綜上所述，本研究在細胞水平初步證實了SPK1在LLC細胞中的表達與細胞凋亡率有關(guān)，SPK1在Lewis肺癌發(fā)生發(fā)展過程中可能有著重要的作用，并且可能通過Bcl-2/Bax途徑來影響LLC細胞凋亡。人為干擾SPK1在非小細胞肺癌細胞中的表達可能通過對Bcl-2/Bax途徑的調(diào)節(jié)來發(fā)揮誘導凋亡的作用。這一結(jié)果有可能達到提高目前治療非小細胞肺癌療效的目的，為治療提供新的思路及靶點。這將是本研究后續(xù)探索的方向。針對相關(guān)靶點開發(fā)新的治療方法有可能為非小細胞肺癌提供個體化治療策略以及新的治療思路。