TLR2/4配體增強的非特異性肝臟炎癥對BALB/c小鼠自身免疫性肝炎的影響*

池 剛，榮 凱，裴晉紅，馮作化

(1長治醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，山西 長治 046000；2太原市公安局小店分局，山西 太原 030032；3華中科技大學(xué)，湖北 武漢 430074)

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是慢性的界面性肝炎，其特點是淋巴細胞浸潤及自身抗體和肝纖維化的產(chǎn)生[1-2]。臨床研究表明，細菌和病毒可以引起AIH，某些藥物也可以引起AIH[3-4]。這些因素的共同特點是能夠引起肝臟非特異性炎癥(non-specific liver inflammation)。然而，這些非特異性炎癥最終如何引起AIH的產(chǎn)生目前尚未完全清楚。前期研究發(fā)現(xiàn)，腺病毒促進模擬抗原CYP2D6誘導(dǎo)易感型小鼠C57BL/6產(chǎn)生了AIH[5]。本研究通過觀察由四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)誘導(dǎo)的強烈的非特異性肝臟炎癥對耐受型小鼠BALB/c AIH的影響，分析其在BALB/c小鼠AIH的啟動中的原因，對進一步了解AIH的形成和發(fā)展的致病機制具有重要意義。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和試劑

6～9周齡雌性BALB/c小鼠購于湖北省醫(yī)學(xué)實驗動物中心(合格證號為211002300024158)。小鼠隨機分為對照組(21只)和實驗組(40只)。pcDNA3.1質(zhì)粒購自Invitrogen；實驗室構(gòu)建CYP2D6質(zhì)粒(pCYP2D6)和可溶性Toll樣受體(soluble Toll-like receptor,sTLR)2/4質(zhì)粒(psTLR2/4)，保存于-20 ℃冰箱；人CYP2D6蛋白購自Abcam。

2 方法

2.1動物接種 將小鼠隨機分為：對照(naive)組、CCl4組、pcDNA3.1空質(zhì)粒對照(p3.1)組、pCYP2D6組、psTLR2/4組、CCl4/psTLR2/4組和CCl4/psTLR2/4/pCYP2D6組，每組6只小鼠。腹腔注射CCl4，每3 d 1次，至第12天停止注射，劑量為0.5 mL/kg；尾靜脈注射質(zhì)粒pCYP2D6和psTLR2/4，其中pCYP2D6質(zhì)粒使用濃度為每只小鼠每次50 μg，psTLR2/4質(zhì)粒使用濃度為100 μg或400 μg。尾靜脈注射pCYP2D6質(zhì)粒從造模前2 d開始，每5 d 注射1次，至第20天停止注射，而psTLR2/4質(zhì)粒從造模前2 d開始注射，每3 d 注射1次，至第15天停止注射。在指定時間處理小鼠并進行相關(guān)實驗。

2.2病理學(xué)檢測 取小鼠肝組織，4%甲醛固定后，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色和天狼星紅染色，顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。肝臟AIH炎癥評分：肝小葉炎癥的評分，無炎癥(0分)，輕微的肝小葉炎癥(1分;<10%的肝實質(zhì)面積)，中度肝小葉炎癥(2分;10%～50 %的肝實質(zhì)面積)，嚴重的肝小葉炎癥(3分;>50 %肝實質(zhì)面積)；肝臟匯管區(qū)的評分，無炎癥(0分),輕微的匯管區(qū)炎癥(1分;<1/3的匯管區(qū)面積)，中度的匯管區(qū)炎癥(2分;接近匯管區(qū)面積的1/2)，嚴重匯管區(qū)炎癥(3分;>2/3的匯管區(qū)面積);總評分為肝小葉和匯管區(qū)炎癥之和[6]。肝纖維化評分：無纖維化記為0分;輕微肝小葉纖維化記為1分；匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成記為2分；局部橋接纖維化記為3分；嚴重的橋接纖維化記為4分[7]。

2.3ELISA檢測 取小鼠血清和正常肝組織蛋白，包被肝組織蛋白或人CYP2D6蛋白于96孔板中，4 ℃孵育過夜后，洗板、封閉、抗體孵育、底物顯示并用H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)，用Excel分析整理結(jié)果。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩獨立樣本間比較采用t檢驗，多組間均數(shù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。 以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TLR2/4配體增強了BALB/c小鼠非特異性肝臟炎癥

研究結(jié)果顯示，用sTLR2/4封閉TLR2/4配體減弱了由CCl4引起的肝臟非特異性炎癥，而且隨著sTLR2/4濃度的增加，最終消除了由CCl4引起的肝臟非特異性炎癥，見圖1。這表明CCl4引起的BALB/c小鼠非特異性肝臟炎癥可能由TLR2/4配體介導(dǎo)。

2 TLR2/4配體增強的非特異性肝臟炎癥對BALB/c小鼠自身免疫應(yīng)答的影響

ELISA檢測結(jié)果顯示，封閉TLR2/4配體后，體內(nèi)抗CYP2D6抗體(anti-CYP2D6)和抗自身肝蛋白抗體(anti-HP)的滴度下降，增大sTLR2/4濃度后，無抗CYP2D6抗體和自身抗體產(chǎn)生，見圖2。這表明由TLR2/4配體增強的非特異性肝臟炎癥促進模擬抗原人CYP2D6使BALB/c小鼠產(chǎn)生自身免疫應(yīng)答。

3 TLR2/4配體增強的肝臟非特異性炎癥對BALB/c小鼠AIH的影響

HE染色結(jié)果顯示，封閉了TLR2/4配體后，AIH減弱，而且增大sTLR2/4濃度后，無AIH產(chǎn)生，見圖3。這表明在模擬抗原CYP2D6存在的情況下，TLR2/4配體增強的非特異性肝臟炎癥促進了BALB/c小鼠AIH。

4 TLR2/4配體增強的肝臟非特異性炎癥對BALB/c小鼠肝臟纖維化的影響

天狼星紅染色結(jié)果顯示，封閉了TLR2/4配體后肝纖維化減弱，而且增大sTLR2/4濃度后，肝纖維化消失，見圖4。這表明在模擬抗原CYP2D6存在的情況下，TLR2/4配體增強的非特異性肝臟炎癥可能使BALB/c小鼠肝纖維化惡化。

討 論

AIH的形成與病毒感染和藥物作用有密切關(guān)系[3, 8-9]。無論是病毒還是藥物，這些因素的共同特點均是引起了非特異性肝臟炎癥，造成了肝臟損傷，從而釋放危險信號，包括TLR2/4配體[10-12]。研究表明，非特異性的肝損傷釋放的TLR2/4配體與AIH可能存在密切聯(lián)系[12]。

Figure 1.TLR2/4 ligand enhanced liver non-specific inflammation in the BALB/c mice. A: the liver tissues with HE staining on day 10 (×200); B: inflammatory score of HE staining. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsCCl4group.

圖1 TLR2/4配體增強了BALB/c小鼠的肝臟非特異性炎癥

Figure 2.TLR2/4 ligand enhanced liver autoimmune responses in the BALB/c mice. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsCCl4/pCYP2D6 group.

圖2 TLR2/4配體增強了BALB/c小鼠肝臟自身免疫應(yīng)答反應(yīng)

我們的研究結(jié)果顯示，在封閉了體內(nèi)TLR2/4配體后，非特異性肝臟炎癥和AIH均下降，并且隨著可溶性受體sTLR2/4濃度增加，非特異性肝臟炎癥和AIH均消失，重要的是，在前期封閉體內(nèi)TLR2/4配體后，后期纖維化也降低或消失。所以推測TLR2/4配體可能參與了AIH在耐受型小鼠BALB/c的啟動。

盡管前期研究表明在C57BL/6易感型小鼠中由腺病毒和模擬抗原能引起AIH[5]，而且攜帶模擬抗原人CYP2D6的腺病毒載體的FVB小鼠也能觀察到產(chǎn)生AIH的特征[13]。然而，攜帶模擬抗原的腺病毒載體在耐受型小鼠BALB/c中無法誘導(dǎo)產(chǎn)生AIH[4]，提示弱炎癥可能無法啟動耐受型小鼠的AIH。我們的研究結(jié)果表明，由CCl4引起的強烈的非特異性肝臟炎癥可以誘導(dǎo)模擬抗原人CYP2D6打破耐受型小鼠BALB/c的免疫耐受，從而產(chǎn)生AIH和肝纖維化，并且我們發(fā)現(xiàn)，這種強烈的非特異性肝臟炎癥是通過TLR2/4信號啟動了BALB/c小鼠的AIH。

Figure 3.TLR2/4 ligand enhanced autoimmune hepatitis (AIH) in BALB/c mice. A: the liver tissues with HE staining in week 7 (×200); B: inflammatory score of HE staining. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsCCl4/pCY2D6 group.

圖3 TLR2/4配體增強了BALB/c小鼠AIH

Figure 4.TLR2/4 ligand enhanced liver fibrosis in the BALB/c mice. A: the liver tissues with Sirius red staining in week 9 (×200); B: fibrosis score of Sirius red staining. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsCCl4/pCYP2D6 group.

圖4 TLR2/4配體增強了BALB/c小鼠肝纖維化

綜上所述，非特異性肝臟炎癥可能參與了AIH的啟動和發(fā)展，然而，弱的非特異性肝臟炎癥可能無法啟動耐受型小鼠BALB/c的AIH，只有強烈的非特異性肝臟炎癥才能啟動耐受型小鼠BALB/c的AIH，而且這種強烈的非特異性肝臟炎癥可能是由TLR2/4配體介導(dǎo)的。因此，本研究結(jié)果對深入研究AIH的致病機制具有重要意義，為設(shè)計相應(yīng)的藥物靶點提供了有效路徑。