法舒地爾調(diào)控巨噬細胞極化改善糖尿病小鼠心肌纖維化*

謝發(fā)江，蔣松辰，高尚遠，李 燕，冉茂霞，李家富，馮 健

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川 瀘州 646000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)系糖尿病(diabetes mellitus,D)患者中獨立于大血管及微血管病變的特異性心肌損害，是發(fā)達國家糖尿病患者致死的主要原因之一[1]。長期高血糖刺激導致心肌細胞肥大及纖維化，早期可出現(xiàn)心臟舒張功能下降，并逐漸累及收縮功能，最終發(fā)展為充血性心力衰竭[2]。

炎癥和纖維化是DCM發(fā)病的重要機制之一，單核-巨噬細胞滲出及分化是炎癥啟動及調(diào)節(jié)的關鍵環(huán)節(jié)，巨噬細胞受局部微環(huán)境的影響至少分化為2種亞型參與炎癥反應，這一過程稱之為巨噬細胞極化，其中以經(jīng)典活化型(M1型)巨噬細胞和選擇活化型(M2 型)巨噬細胞為主，M1型巨噬細胞上調(diào)誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)及炎癥因子的表達，過度極化可導致組織損傷，M2型巨噬細胞上調(diào)精氨酸酶1(arginase-1,Arg-1)及抗炎因子的表達，發(fā)揮抗炎效應，有利于組織修復[3]。M1/M2比例失調(diào)促進DCM發(fā)生，調(diào)控巨噬細胞極化顯示了良好的抗纖維化及對DCM的治療作用[4-7]。

RhoA蛋白是Ras超家族中一種小分子三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)結(jié)合蛋白，其下游效應分子為Rho激酶(Rho-associated kinases，ROCK)，后者屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，存在2種亞型: ROCK1(又稱ROKβ、p160 ROCK)和ROCK2(也稱ROKα)。RhoA/ROCK信號通路調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移和凋亡等生物學行為，扮演分子開關的角色[8]。研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/ROCK信號通路介導炎癥、氧化應激、鈣平衡、胰島素抵抗、心肌細胞凋亡、心肌纖維化和心臟舒縮功能等參與DCM發(fā)病，是具有巨大潛力的治療靶點[9]。法舒地爾能特異性結(jié)合ROCK中ATP依賴的激酶結(jié)構(gòu)域并抑制其活性，是目前臨床上唯一批準使用的ROCK抑制劑，因其強大的擴血管作用而被廣泛應用于蛛網(wǎng)膜下腔出血和缺血性心臟病等血管痙攣性疾病的治療中[10-11]。盡管動物實驗結(jié)果顯示法舒地爾能夠抗心肌纖維化進而治療DCM[12-13]，但其深入機制是否與通過調(diào)控巨噬細胞極化相關尚無相關文獻報道。本研究通過鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導1型糖尿病小鼠模型并給予法舒地爾干預，觀察其對巨噬細胞極化及心肌纖維化的影響。

材 料 和 方 法

1 實驗動物、藥品與試劑

60只SPF級健康雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體重(20.6±0.8)g，購自成都達碩實驗動物有限公司，合格證編號為SCXK(川)2015-030。實驗期間自由飲水，進食普通飼料，室溫(23±1)℃，每日12 h光照維持晝夜循環(huán)。

鏈脲佐菌素購自Sigma；鹽酸法舒地爾(hydroxyl fasudil,HF)注射液購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司(批準文號為國藥準字H20040356)；抗CD11c和CD206抗體均購自Proteintech Group；抗腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)和IL-10抗體均購自Bioworld Technology；抗p-MYPT1 Thr853、iNOS和Arg-1抗體均購自CST；抗β-actin抗體、山羊抗兔II抗和山羊抗鼠II抗購自Abcam；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自南京凱基生物公司。

2 方法

2.1糖尿病小鼠模型的建立、分組及處理 所有動物適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為正常組(normal saline組，NS組)、正常+法舒地爾組(N+HF組)、糖尿病組(D+NS組)、法舒地爾低劑量組(D+LHF組)、法舒地爾中劑量組(D+MHF組)和法舒地爾高劑量組(D+HHF組)，每組各10只。D+NS組及各治療組小鼠禁食12 h后，腹腔注射1% STZ (80 mg/kg)，NS組和N+HF組小鼠腹腔注射等體積0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液，連續(xù)7 d，2周后斷尾取血，測得血糖值≥16.7 mmol/L視為造模成功。成模后各治療組小鼠分別腹腔注射低劑量(10 mg/kg)、中劑量(40 mg/kg)和高劑量(60 mg/kg)法舒地爾，每天1次[14]，N+HF組予中劑量(40 mg/kg)法舒地爾，NS組和D+NS組腹腔注射等體積生理鹽水，連用8周，復測隨機血糖及體重，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，開胸取心臟，將其橫向?qū)Π肭虚_，心尖部組織用4%多聚甲醛固定后制作成厚4 μm石蠟切片，心底部組織凍存于-80 ℃冰箱，用于Western blot檢測。

2.2心臟組織病理學觀察 分別選取各組石蠟切片，脫蠟至水，行HE及Masson染色，于光鏡下觀察拍照。采用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0進行心肌膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)測定，CVF(%)=膠原面積/視野總面積×100%。

2.3免疫組化觀察心臟組織中巨噬細胞極化及炎癥因子和抗炎因子水平 將切片脫蠟后浸入0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)，微波爐中高火加熱至沸騰后斷電，間隔5 min后，重復1次，冷卻后，PBS洗2次，每次5 min，進行抗原修復，并滴加山羊血清室溫封閉20 min。分別加入抗CD11c(1 ∶50)、CD206(1 ∶100)、IL-6(1 ∶100)、TNF-α(1 ∶100)和IL-10(1 ∶50)抗體，4 ℃孵育過夜，滴加 II 抗，37 ℃繼續(xù)孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min，DAB顯色。最后用蘇木素復染，脫水，中性樹膠封片。IL-6、TNF-α和IL-10染色切片于100倍鏡下選取6個不同觀察區(qū)域，并進行400倍鏡下拍片，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定所采集6個視野全部圖像的積分吸光度(integrated absorbance，IA)和陽性表達面積(stained area,SA)，并計算每張圖像的平均吸光度(mean absorbance,MA)，使用6張圖像的平均吸光度再計算平均數(shù)，得出每例樣本的平均吸光度，再進行分析，按同樣的方式測算CD11c和CD206陽性細胞數(shù)。

2.4Western blot測定蛋白水平 取各組小鼠心臟凍存組織樣本，37 ℃水浴解凍后按質(zhì)量體積比1 ∶10加入RIPA 裂解液，快速剪碎組織，置碎冰上裂解10 min，收集裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，按BCA蛋白定量試劑盒說明測定蛋白濃度。根據(jù)所需樣本體積，按4:1比例加入5×Loding Buffer，混勻后熱循環(huán)儀95 ℃、 15 min使蛋白變性。配制8%、10%分離膠和5%濃縮膠，按蛋白量60 μg上樣，進行電泳分離，轉(zhuǎn)PVDF膜，經(jīng)5% BSA液封閉2 h后，加入抗p-MYPT1 Thr853(1∶500)、iNOS(1 ∶200)、Arg-1(1 ∶300)及β-actin (1 ∶5 000)抗體，4 ℃孵育過夜，TBST(pH 7.4)洗膜3次，每次5 min，將膜放入相應 II 抗(1 ∶5 000)中，室溫孵育2～3 h，TBST洗膜3次,每次10 min，ECL發(fā)光液顯色，采用ChemiDoc XRS凝膠掃描成像儀及Image Lab凝膠分析系統(tǒng)進行條帶分析。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗，方差齊則組間采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠體重及血糖的變化

與NS組相比，D+NS組小鼠成模后出現(xiàn)體重明顯下降，血糖水平亦明顯升高(P<0.05)。N+HF組較NS組體重與血糖值的差異并無統(tǒng)計學顯著性。同樣，各治療組體重與血糖值較D+NS組相比差異也無統(tǒng)計學顯著性，說明法舒地爾對小鼠體重及血糖無明顯影響，見圖1。

Figure 1.The body weight and blood glucose of the mice in each group were detected. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsNS group.

圖1 各組小鼠體重及血糖的變化

2 小鼠心臟組織HE染色

HE染色觀察可見NS組和N+HF組心肌細胞排列整齊，輪廓清晰，細胞質(zhì)著色均勻；D+NS組心肌細胞排列紊亂，胞質(zhì)著色不均，中膜層心肌纖維呈波浪樣變性，部分斷裂；各治療組較D+NS組心肌細胞排列較整齊，輪廓大致清晰，細胞質(zhì)著色較均勻，中膜層心肌纖維波浪樣變性及斷裂改變明顯減輕，見圖2。

Figure 2.The representative images of cardiac tissues in each group under light microscope (HE staining, ×400).

圖2 各組小鼠心臟組織HE染色結(jié)果

3 小鼠心臟組織Masson染色及CVF的變化

Masson染色時膠原纖維呈藍色，心肌細胞胞漿呈紅色。NS組和N+HF組心肌間質(zhì)可見少許膠原纖維分布，CVF的差異無統(tǒng)計學顯著性；與NS組相比，D+NS組心肌間質(zhì)膠原纖維分布明顯增加，CVF顯著增大(P<0.05)；與D+NS組相比，各治療組心肌間質(zhì)膠原纖維分布明顯較少，CVF下降(P<0.05)；與D+LHF組相比，D+MHF組和D+HHF組CVF進一步下降(P<0.05)，提示DCM存在明顯心肌纖維化，法舒地爾能劑量依賴性地減輕DCM心肌纖維化，見圖3。

Figure 3.Masson staining showed the changes of CVF of cardiac tissues in each group (×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsD+NS group；$P<0.05vsD+LHF group.

圖3 Masson染色觀察各組小鼠心臟組織的CVF變化

4 免疫組化觀察小鼠心臟組織中巨噬細胞極化及炎癥因子和抗炎因子的水平

CD11c識別M1型巨噬細胞，CD206識別M2型巨噬細胞。NS組和N+HF組中M1和M2型巨噬細胞數(shù)量及IL-6、TNF-α和IL-10的蛋白水平差異無統(tǒng)計學顯著性；與NS組相比，D+NS組M1型巨噬細胞數(shù)量增加，M2型巨噬細胞數(shù)量減少，IL-6和TNF-α的蛋白水平顯著增加(P<0.05)，IL-10的蛋白水平顯著下降(P<0.05)；與D+NS組相比，各治療組的M1型巨噬細胞數(shù)量及IL-6和TNF-α的蛋白水平均呈劑量依賴性減少(P<0.05)，M2型巨噬細胞數(shù)量及IL-10的蛋白水平隨著劑量增大而增加(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.Immunohistochemical identification of macrophage phenotype marker proteins and the protein expression of IL-6, TNF-α and IL-10 in different groups (×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsD+NS group;$P<0.05vsD+LHF group;&P<0.05vsD+MHF group.

圖4 各組小鼠心臟組織巨噬細胞極化及炎癥因子和抗炎因子蛋白水平的變化

5 小鼠心臟組織中p-MYPT1 Thr853、iNOS和Arg-1的蛋白水平

NS組和N+HF組p-MYPT1 Thr853、iNOS和Arg-1的蛋白水平差異無統(tǒng)計學顯著性；與NS組相比，D+NS組p-MYPT1 Thr853和iNOS的蛋白水平升高，Arg-1的蛋白水平降低(P<0.05)；與D+NS組相比，D+LHF組p-MYPT1 Thr853、iNOS和Arg-1的蛋白水平差異無統(tǒng)計學顯著性；與D+NS組相比，D+MHF組和D+HHF組p-MYPT1 Thr853和iNOS的蛋白水平下降(P<0.05)，Arg-1的蛋白水平升高(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The protein levels of p-MYPT1 Thr853, iNOS and Arg-1 in different groups were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsD+NS group;$P<0.05vsD+LHF group.

圖5 各組小鼠心臟組織中p-MYPT1 Thr853、iNOS和Arg-1的蛋白水平變化

6 相關性分析

通過兩變量間相關性分析(Pearson相關分析)發(fā)現(xiàn)，小鼠心臟組織中p-MYPT1 Thr853的蛋白水平與iNOS的蛋白水平明顯呈正相關(r=0.914，P<0.01)，與Arg-1的蛋白水平明顯呈負相關(r=-0.887，P<0.01)，見圖6。

Figure 6.Correlations between p-MYPT1 Thr853 and iNOS or Arg-1 expression.

圖6 各組小鼠心臟組織中p-MYPT1 Thr853的蛋白水平分別與iNOS和Arg-1蛋白水平的相關性

討 論

在病理狀況下，單核細胞由循環(huán)系統(tǒng)遷移并滲出到組織中分化形成巨噬細胞。未分化M0型巨噬細胞在不同微環(huán)境下可誘導分化成不同類型。M1型巨噬細胞主要受脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)及干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)誘導，此外促炎因子TNF-α和IL-12等也能產(chǎn)生誘導作用。活化的M1型巨噬細胞分泌大量的活性氮，加強Th1細胞免疫，隨著大量炎癥介質(zhì)的釋放產(chǎn)生強大的抗菌及細胞毒性作用，具有抗感染及抗腫瘤效應，在急性損傷炎癥初期，首先滲出起到清除壞死組織的作用[15]。M2型巨噬細胞受誘導因子不同可分化為M2a、M2b和M2c 3種不同功能的亞型，M2a型由IL-4和IL-13誘導，M2b型由免疫復合物和IL-1誘導，IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和糖皮質(zhì)激素誘導形成M2c型。M2a型能抑制INF-γ、IL-1和IL-6等炎癥介質(zhì)的釋放，同時能促進TGF-β表達及細胞間基質(zhì)的沉積，但其吞噬功能較差，因具有修復組織的功能而又被稱為“組織修復型巨噬細胞”；M2b和M2c型通過介導慢性炎癥限制M1型巨噬細胞的異常持續(xù)活化造成的組織破壞，并未直接參與組織修復，而被稱為“調(diào)節(jié)型巨噬細胞”[16]。在炎癥的不同階段M1和M2型巨噬細胞發(fā)揮不同的作用，M1/M2型巨噬細胞比例的動態(tài)變化決定了炎癥的進展及嚴重程度。Urbina等[5]發(fā)現(xiàn)在糖耐量減低小鼠模型的心臟組織中M2型巨噬細胞與正常組相比差異并無統(tǒng)計學顯著性，但經(jīng)骨形成蛋白7(bone morphorgenic protein-7, BMP-7)干預的模型小鼠M2型巨噬細胞數(shù)量較對照組明顯升高，同時伴有促炎因子TNF-α和IL-6降低及抗炎因子IL-1RA和IL-10的升高，干預組心肌纖維化及心臟功能明顯改善。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，DCM心臟組織中巨噬細胞以M1型為主，過度活化的M1型巨噬細胞加重心臟損傷，當完全抑制小鼠中巨噬細胞的增殖及分化時，DCM病變并未有效減輕，但通過誘導M2型巨噬細胞極化，抑制M1型巨噬細胞的極化，促炎因子明顯下降，抗炎因子升高，DCM的病變明顯減輕[4]。越來越多的證據(jù)表明，調(diào)控M1/M2型巨噬細胞的比例是DCM治療有效靶點[6-7]。本實驗中，我們選擇CD11c和iNOS作為M1型巨噬細胞的標志物，CD206和Arg-1作為M2型巨噬細胞的標志物，TNF-α和IL-6為觀察的促炎因子，IL-10為觀察的抗炎因子。與正常組相比，糖尿病組小鼠中M1型巨噬細胞數(shù)量及促炎因子的表達明顯增加，M2型巨噬細胞數(shù)量明顯減少，而通過法舒地爾的干預M1型巨噬細胞極化明顯抑制，M2型噬細胞數(shù)量增加，炎癥水平明顯下降，DCM心肌纖維化有效改善，且隨著劑量增加抗纖維化作用越明顯，提示法舒地爾調(diào)控巨噬細胞極化，恢復異常的M1/M2型巨噬細胞的比例，可能是其抗心肌纖維化的機制之一。

大量的研究表明，法舒地爾能有效改善DCM，目前認為其可能與下列機制有關：(1)抑制纖維化關鍵信號通路JNK 和TGF-β/Smad的表達，減輕間質(zhì)纖維化[13]；(2)提高心肌細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)和單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)的活性，抑制脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde，MDA)的生成，提高抗氧化水平，并通過減少線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)開放數(shù)量，保護線粒體結(jié)構(gòu)與功能[17]；(3)抑制心肌細胞Bax 表達，促進Bcl-2表達，減輕心肌細胞凋亡[12, 18]；(4)提高心肌細胞舒張期Ca2+回收相關轉(zhuǎn)運蛋白的表達與活性，促進舒張期胞質(zhì)Ca2+回收，并且修復受損的肌動蛋白與橫橋空間結(jié)構(gòu)，直接改善心肌的舒縮功能[19-20]。法舒地爾能特異性結(jié)合ROCK中ATP依賴的激酶結(jié)構(gòu)域并下調(diào)其活性，進而抑制RhoA/ROCK信號通路轉(zhuǎn)導，MYPT1是ROCK下游結(jié)合底物之一，MYPT1的磷酸化程度能有效反映ROCK的活性[21]。本研究中，糖尿病組小鼠p-MYPT1 Thr853的蛋白水平增加，提示DCM中存在RCOK的激活，經(jīng)法舒地爾干預后，p-MYPT1 Thr853的蛋白水平下降，RCOK的活性受到抑制，同時我們發(fā)現(xiàn)MYPT1 Thr853磷酸化水平與iNOS的蛋白水平呈正相關，反之與Arg-1的蛋白水平呈負相關，說明ROCK活性與巨噬細胞極化存在相關性。RhoA/ROCK信號通路過度激活是DCM發(fā)病的關鍵機制之一[22]。Cheng等[23]發(fā)現(xiàn)高糖狀態(tài)下培養(yǎng)的巨噬細胞中RhoA/ROCK信號通路異常激活并調(diào)控巨噬細胞的黏附和分泌等多種生物學功能。由此我們推測，DCM發(fā)病中巨噬細胞的極化可能受RhoA/ROCK信號通路的調(diào)控，其機制有待進一步體外研究。

綜上所述，法舒地爾可能通過抑制M1型巨噬細胞極化，誘導M2型噬細胞極化，下調(diào)心臟炎癥水平，進而減輕DCM心肌纖維化，有望成為DCM治療的一種新策略。同時，本實驗對DCM發(fā)病中RhoA/ROCK信號通路與巨噬細胞極化的關系做了初步探究，巨噬細胞極化是否受RhoA/ROCK信號通路調(diào)控有待進一步研究。