川芎嗪對(duì)LPS致神經(jīng)認(rèn)知障礙的影響及功能影像學(xué)評(píng)價(jià)*

李光明，管雪琴, 劉思思，梁敏杰，潘 銳, 唐海杰, 顏學(xué)勤，王會(huì)麗，顏 亮，付詠梅，周 全，董 軍△

(1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，國家中醫(yī)藥管理局病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院，2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，3暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像中心，廣東 廣州 510632；4南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510630)

神經(jīng)退行性疾病包括阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)、帕金森病(Parkinson disease，PD)、亨廷頓(Huntington disease，HD) 和HIV 相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知障礙(HIV-associated neurocognitive disorders，HAND)等[1]，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)在大腦中錯(cuò)誤折疊、聚集和積累導(dǎo)致神經(jīng)毒性，可影響抽象思維、熟練動(dòng)作、情緒感受、 認(rèn)知和記憶等能力[2]，從而出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。然而，目前臨床上治療神經(jīng)認(rèn)知障礙的藥主要是緩解癥狀，并沒有改變神經(jīng)元的丟失和退化。中藥川芎嗪是從川芎塊莖提取的酰胺類生物堿，主要成分是四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)[3]。研究表明，川芎嗪可擴(kuò)張腦血管，降低血管阻力，顯著增加腦及肢體血流量，改善微循環(huán)；能降低血小板表面活性、抑制血小板凝聚、預(yù)防血栓的形成；抗炎、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)等作用[4]。但川芎嗪對(duì)神經(jīng)認(rèn)知障礙的研究尚未見報(bào)道。

我國老齡化進(jìn)程加劇，對(duì)神經(jīng)認(rèn)知障礙的認(rèn)識(shí)和預(yù)防迫在眉睫。神經(jīng)認(rèn)知障礙是神經(jīng)退行性疾病的主要表現(xiàn)之一，進(jìn)一步惡化可能導(dǎo)致阿爾茨海默病[5]。 因此，早期發(fā)現(xiàn)及診斷神經(jīng)認(rèn)知障礙并對(duì)其進(jìn)行干預(yù)對(duì)于延緩其向神經(jīng)退行性疾病轉(zhuǎn)化具有現(xiàn)實(shí)意義。神經(jīng)影像學(xué)檢查是癡呆及神經(jīng)認(rèn)知障礙診斷不可或缺的一部分，但是功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging，fMRI)還只限于臨床研究[6]。本研究應(yīng)用體素內(nèi)非相干運(yùn)動(dòng)(intra-voxel incoherent motion，IVIM)技術(shù)分辨神經(jīng)影像學(xué)特征，特別是認(rèn)知障礙早期的影像學(xué)及腦微觀結(jié)構(gòu)的改變。IVIM是近年興起的一項(xiàng) MRI 新技術(shù)，由Le Bihan等[7]在20世紀(jì)80年代提出，理論前提是在生物組織內(nèi)，除考慮組織內(nèi)水分子擴(kuò)散外，微循環(huán)毛細(xì)血管灌注的影響也是不可或缺的[8]。IVIM成像可通過擴(kuò)散系數(shù)(diffusion coefficient, D)和偽擴(kuò)散系數(shù)(pseudodiffusion coefficient, D*)分別評(píng)價(jià)純水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)成分和血流灌注相關(guān)的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，從而達(dá)到無創(chuàng)評(píng)價(jià)組織微觀結(jié)構(gòu)及微循環(huán)灌注情況的目的[9]。

神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷部位的潛在炎癥過程有關(guān)，稱為“神經(jīng)炎癥”[10]。原發(fā)性神經(jīng)元損傷可能通過釋放營養(yǎng)因子和炎癥介質(zhì)引起局部神經(jīng)炎癥[11]。腦立體定向注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是目前用來誘導(dǎo)腦內(nèi)神經(jīng)炎癥的模型[12]。脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的一種組成成分，能誘導(dǎo)炎癥，對(duì)免疫細(xì)胞有不同的作用，可作為腦炎癥誘導(dǎo)劑[13]。本研究通過觀察川芎嗪對(duì)LPS所致大鼠神經(jīng)認(rèn)知障礙的影響，并測定腦純水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)和血流灌注探討川芎嗪減輕LPS致神經(jīng)認(rèn)知障礙的作用及功能影像學(xué)分子機(jī)制，為防治神經(jīng)退行性疾病提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

采用SPF級(jí)健康雌雄各半SD大鼠36只，鼠齡4～8周，體重120～180 g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證編號(hào)3700920006246)。飼養(yǎng)于暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，12 h晝/夜交替照明，自由進(jìn)飲進(jìn)食；在暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)環(huán)境，過10 d隔離檢疫期后，開始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)完全按照暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求進(jìn)行。

2 主要試劑及儀器

戊巴比妥鈉購自Sigma；LPS購自Sigma；鹽酸川芎嗪注射液購自成都倍特藥業(yè)有限公司(國藥準(zhǔn)字號(hào)H32013383)；大鼠白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1β(SEA563Ra)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α(SEA133Ra)ELISA試劑盒購自武漢優(yōu)爾生有限公司。腦立體定位儀和顱骨鉆購自瑞沃德公司；3.0T核磁共振成像儀購自飛利浦公司。

3 主要方法

3.1構(gòu)建LPS致神經(jīng)認(rèn)知障礙模型及分組 側(cè)腦室注射(intracerebroventricular injection，icv):首先用3%的戊巴比妥鈉對(duì)大鼠腹腔注射(1.5 mL/kg)進(jìn)行麻醉，后將其固定于腦立體定位儀上，碘伏消毒頭頂部皮膚，頭頂正中由前向后作長約1 cm手術(shù)切口，參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟后1.0 mm、矢狀縫(mediolateral，ML)左右1.8 mm為注射點(diǎn)，進(jìn)針深度(dorsoventral，DV)3.8 mm。準(zhǔn)確定位后，先用黑筆標(biāo)記，然后用顱骨鉆打孔，見腦脊液溢出停止鉆孔，然后把制作好的套管，插入側(cè)腦室里，用牙科水門汀封膠固定。手術(shù)觀察3 d后，把用人工腦脊液 (artifical cerebrospinal fluid,ACSF)配制的LPS溶液 (1 g LPS溶入10 mL ACSF中，配成100 mg/L LPS母液；取15 μL LPS母液，加入35 μL ACSF配成150 μg/5 μL的LPS溶液)5 μL用微量進(jìn)樣針沿套管插入緩慢注射，每注射2 μL停針2 min。注射完畢后，留針10 min，緩慢退針；消毒后，用牙科水門汀封膠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)，水迷宮訓(xùn)練完成后，根據(jù)水迷宮逃避潛伏期，利用隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為6組，每組6只：(1)空白對(duì)照組(control group)：腹腔注射0.9%生理鹽水，每只10 mL/kg，注射5 d；(2)假手術(shù)組(sham group)：先行腹腔注射0.9%生理鹽水，每只10 mL/kg，注射5 d；icv法將ACSF注射入大鼠腦內(nèi)，每只5 μL，注射1次；(3)模型組(model group, LPS group):先行腹腔注射0.9%生理鹽水，每只10 mL/kg，注射5 d;再icv法將150 μg, 5 μL LPS注射入大鼠腦內(nèi)，每只5 μL，注射1次；(4)低劑量組(low dose group)：先行腹腔注射鹽酸川芎嗪注射液每只50 mg/kg(按1 mL/100 g注射，需把50 mg/kg鹽酸川芎嗪注射液配制成5 g/L)，注射5 d；再icv法將150 μg/5 μL LPS注射入大鼠腦內(nèi)，每只5 μL，注射1次；(5)中劑量組(medium dose group)：先行腹腔注射鹽酸川芎嗪注射液,每只100 mg/kg(按1 mL/100 g注射，需把100 mg/kg鹽酸川芎嗪注射液配制成10 g/L)，注射5 d；再icv法將150 μg/5 μL LPS注射入大鼠腦內(nèi)，每只5 μL，注射1次；(6)高劑量組(high dose group)：先行腹腔注射鹽酸川芎嗪注射液每只200 mg/kg(按1 mL/100 g注射，需把200 mg/kg鹽酸川芎嗪注射液配制成20 g/L)，注射5 d；再icv法將150 μg/5 μL LPS注射入大鼠腦內(nèi)，每只5 μL，注射1次。術(shù)程順利，高劑量組死亡1只。側(cè)腦室注射后第9天，麻醉處死大鼠，取出全腦，備用。

3.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)并檢測大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力 術(shù)后第2天，大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。水深約26 cm，平臺(tái)隱藏于水下，水溫(24±1)℃。(1) 第1～6天的定位航行實(shí)驗(yàn)檢測大鼠學(xué)習(xí)能力:水迷宮分為 4 個(gè)象限，隨機(jī)將大鼠從任一象限以臉部面向池壁放入水中，記錄大鼠找到隱藏平臺(tái)所需時(shí)間，作為潛伏期; 探尋總時(shí)長為90 s，若大鼠未能在規(guī)定時(shí)間內(nèi)找到平臺(tái)，則引導(dǎo)其游上平臺(tái)并在平臺(tái)停留10 s，其潛伏期記為90 s。(2) 第7天的空間探索實(shí)驗(yàn)檢測大鼠記憶能力: 實(shí)驗(yàn)第7天撤去水下平臺(tái)，選取平臺(tái)所在象限的對(duì)角象限為大鼠入水點(diǎn)，記錄大鼠在 90 s 內(nèi)穿過平臺(tái)區(qū)的次數(shù)及在平臺(tái)象限內(nèi)停留的時(shí)間。

3.3ELISA檢測炎癥因子IL-1β和TNF-α的含量 各組織大鼠4%多聚甲醛灌注完全后，各取3只冰上迅速斷頭取腦，分離皮層和海馬。低溫勻漿將大腦組織研磨制成勻漿液。4 ℃、12 000×g離心15 min,取上清，后續(xù)實(shí)驗(yàn)按照IL-1β和TNF-α的ELISA說明書嚴(yán)格操作。

3.4MRI檢查 第7天水迷宮結(jié)束后，大鼠進(jìn)行MRI掃描，先用3%戊巴比妥鈉麻醉，拆去套管，放到核磁共振成像機(jī)器掃描。除了普通序列外，主要掃描IVIM。所有納入的實(shí)驗(yàn)對(duì)象均采用 GE 3.0T MR 掃描儀(GE Healthcare Discovery MR 750)完成 MRI 檢查，所有數(shù)據(jù)由腕關(guān)節(jié)線圈采集。行軸位 T2WI propeller 掃描及IVIM-DWI掃描，掃描參數(shù)：(1)T2WI propeller 序列：TR 4295 ms, TE 76 ms,視野(FOV)600 mm×600 mm，矩陣 256×256，層厚 2 mm，層間隙 0 mm，激勵(lì)次數(shù) 2 次; (2)軸位 IVIM-DWI 序列：使用單次激發(fā)自旋回波成像序列，TR 3500 ms，TE minimum ms，15個(gè)不同的 b 值(0、 20、 30、 50、 80、100、200、 400、 600、 800、 900、1 000 s/mm2)，F(xiàn)OV 600 mm×600 mm，矩陣 128×128，層厚2 mm，層間隙 0 mm，帶寬125 kHz。

3.5圖像后處理 IVIM-DWI圖像后處理：根據(jù)經(jīng)典雙指數(shù)模型，應(yīng)用 GE AW 4.5 后處理工作站內(nèi)置軟件，分析圖像數(shù)據(jù)的信號(hào)衰減，計(jì)算D、D*及灌注分?jǐn)?shù)(perfusion fraction, f)。結(jié)合 T2WI序列，分別在海馬的2個(gè)層面分別勾勒出左右的海馬輪廓，畫4個(gè)感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)，并在同層面左右皮層各勾畫2個(gè)ROI(約2 mm×2 mm)，ROI 的放置應(yīng)避開右側(cè)側(cè)腦室注射通道，每個(gè) ROI重復(fù)勾畫3次后取平均值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤 (mean±SEM) 表示。組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA),方差齊時(shí)組間兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)；若方差不齊，則組間兩兩比較用 Tamhane’s T2 檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 川芎嗪對(duì)LPS致大鼠神經(jīng)認(rèn)知障礙的空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)0 d(訓(xùn)練結(jié)束后的逃避潛伏期)、1 d、3 d、5 d和6 d結(jié)果表明，與空白對(duì)照組和假手術(shù)組相比，模型組大鼠的逃避潛伏期顯著延長(P<0.05)；而川芎嗪低劑量治療組，大鼠的逃避潛伏期縮短(P<0.05),見圖1A。第 6天定位航行代表性路徑圖表明，與模型組相比，川芎嗪低劑量治療組大鼠導(dǎo)航策略變得更好,見圖1D。第7天的空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比假手術(shù)組，模型組穿梭平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間均降低；相比模型組，川芎嗪低劑量組大鼠穿梭平臺(tái)次數(shù)增加，目標(biāo)象限停留時(shí)間延長(P<0.05)，見圖1B、C。

2 川芎嗪對(duì)神經(jīng)認(rèn)知障礙大鼠體內(nèi)炎癥因子IL-1β和TNF-α的影響

ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，LPS處理組大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)IL-1β和TNF-α分別增加(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組大鼠大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)IL-1β和TNF-α分別降低(P<0.05)，中、高劑量組無顯著差異(P>0.05),見圖2。

3 川芎嗪改善LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)認(rèn)知障礙的MRI功能影像學(xué)影響

MRI功能影像學(xué)掃描圖層及ROI測量范圍見圖3。與假手術(shù)組相比，模型組的皮層和海馬各組間的D、D*和f值均顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，川芎嗪低劑量組的D、D*和f值均顯著升高(P<0.01),見表1。

討 論

神經(jīng)認(rèn)知障礙是神經(jīng)退行性疾病主要的臨床表現(xiàn)癥狀，防治神經(jīng)認(rèn)知障礙將為神經(jīng)退行性疾病的研究提供新的策略。隨著一些中藥新的藥理作用和分子機(jī)制被發(fā)現(xiàn)和揭示，中藥將為防治神經(jīng)認(rèn)知障礙的治療提供新方法[14]。本研究行為學(xué)檢測結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的川芎嗪低劑量組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力顯著改善。已有研究顯示川芎嗪可以降低腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)炎癥從而減輕腦損傷[15]。在本研究中，我們觀察到川芎嗪還可以減輕神經(jīng)認(rèn)知障礙程度。

根據(jù)現(xiàn)有研究猜測，川芎嗪減輕神經(jīng)認(rèn)知障礙的機(jī)制可能是川芎嗪可以抑制腦中神經(jīng)炎癥反應(yīng)，緩解神經(jīng)細(xì)胞的水腫，增加腦中血流循環(huán)，從而緩解神經(jīng)認(rèn)知障礙。本研究檢測到模型組大鼠皮層和海馬的IL-1β和TNF-α均顯著增加，表示模型組發(fā)生了神經(jīng)炎癥，這與 Wu等[16]用LPS誘導(dǎo)大鼠腦神經(jīng)炎癥的結(jié)果相似；神經(jīng)炎癥導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡、壞死，從而引起神經(jīng)認(rèn)知障礙。而用低劑量川芎嗪治療的大鼠，其皮層和海馬區(qū)IL-1β和TNF-α均顯著降低，表明低劑量川芎嗪可以抑制腦中神經(jīng)炎癥，從而減輕神經(jīng)認(rèn)知障礙。

Figure 1.Tetramethylpyrazine improved the spatial learning and memory abilities of SD rats with LPS-induced neurocognitive impairment. A: water maze escape latency; B and C: the times of each animal entering the small target zone and the time spent in the target quadrant; D: the representative swimming path at day 6 of training with space exploration. Mean±SEM.n=6.*P<0.05，**P<0.01vsmodel group.

圖1 川芎嗪對(duì)LPS所致神經(jīng)認(rèn)知障礙大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的影響

Figure 2.The effect of tetramethylprazine on the relative expression of inflammatory factors induced by LPS. A: the relative expression of IL-1β in the cortex and hippocampus detected by ELISA; B: the relative expression of TNF-α in the cortex and hippocampus measured by ELISA. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsmodel group.

圖2 川芎嗪對(duì)神經(jīng)認(rèn)知障礙相關(guān)炎癥因子相對(duì)表達(dá)的影響

Figure 3.Representative MRI functional imaging scan layer and measurement range. A： the scanned T2WI layer； B: 1 and 2 of regions represent the hippocampus, while 3 and 4 of regions represent the cortex; C: the merged A and B scan sequences.

圖3 MRI功能序列掃描層和ROI測量范圍

表1 各組大鼠皮層和海馬的D、D*和f值

Table 1.The values of diffusion coefficient (D), pseudodiffusion coefficient (D*), perfusion fraction (f) in the cortex and hippocampus of the rats in each group (mm2/s. Mean±SEM)

GroupnCortexHippocampusD (×10-4)D* (×10-3)fD (×10-4)D* (×10-3)fControl67.25±0.1145.80±3.110.28±0.027.73±0.2340.90±2.530.28±0.03Sham67.19±0.18**44.70±3.12**0.27±0.02**7.64±0.24**41.20±2.11**0.27±0.00**Model66.21±0.2020.60±2.240.18±0.026.78±0.1017.50±1.120.16±0.01Low dose69.46±0.49**39.90±3.56**0.28±0.00**8.79±0.52**39.80±1.63**0.25±0.01**Medium dose66.67±0.2121.60±3.010.20±0.017.04±0.1421.30±1.120.16±0.01High dose56.65±0.2819.30±3.960.21±0.006.76±0.2219.50±1.660.17±0.02

**P<0.01vsmodel group.

本研究應(yīng)用fMRI檢查結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥分別導(dǎo)致大鼠腦皮層和海馬神經(jīng)細(xì)胞實(shí)質(zhì)水分子的彌散程度(D)、水分子之間的偽擴(kuò)散系數(shù)(D*)和血管的灌注分?jǐn)?shù)(f)分別顯著降低。分析原因發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，引起細(xì)胞的毒性水腫、變性壞死，導(dǎo)致水分子彌散受限；而白細(xì)胞聚集，導(dǎo)致微循環(huán)淤滯，腦血流量灌注水平降低，引起大腦學(xué)習(xí)記憶能力降低。這與van Bussel等[8]觀察到微血管壁組織彌散能力降低會(huì)影響糖尿病引起的學(xué)習(xí)記憶能力損傷一致，說明影像學(xué)結(jié)果可以評(píng)價(jià)海馬區(qū)發(fā)生變化，而是否能評(píng)價(jià)神經(jīng)認(rèn)知障礙的發(fā)生，是本研究所致力于探討的。本研究觀察到低劑量川芎嗪治療的大鼠，其皮層和海馬區(qū)的實(shí)質(zhì)水分子彌散系數(shù)顯著升高，表明皮層和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞水分子彌散能力增強(qiáng)，細(xì)胞變性水腫得到緩解，炎癥反應(yīng)下降。恰恰如我們期待的那樣，我們檢測低劑量組大鼠皮層和海馬區(qū)IL-1β和TNF-α顯著降低，神經(jīng)認(rèn)知障礙減輕，這可能證實(shí)了我們的假設(shè)，即我們可以用功能影像學(xué)對(duì)神經(jīng)認(rèn)知障礙進(jìn)行評(píng)價(jià)。

慢性低灌注腦損傷是導(dǎo)致神經(jīng)障礙和認(rèn)知衰退的重要因素之一[17]，而川芎嗪可降低腦缺血后活化的巨噬細(xì)胞、浸潤性淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[18]，使微循環(huán)恢復(fù)正常；并且川芎嗪可以增加腦血流量，改善腦微循環(huán)，使血流量增加。本研究觀察到低劑量川芎嗪治療的大鼠，其灌注分?jǐn)?shù)顯著增加，大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力得到顯著改善，進(jìn)一步驗(yàn)證川芎嗪可以減輕神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)的神經(jīng)認(rèn)知障礙，同時(shí)也進(jìn)一步表明功能影像學(xué)可以用于神經(jīng)認(rèn)知障礙的評(píng)價(jià)。

綜上所述，本研究首次觀察到中藥單體川芎嗪可以減輕LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)認(rèn)知障礙，并從IVIM D、IVIM D*和f這3個(gè)方面進(jìn)行神經(jīng)認(rèn)知障礙緩解情況的評(píng)價(jià)。這些結(jié)果將為防治神經(jīng)退行性疾病的影像學(xué)評(píng)價(jià)提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。