CUG連接蛋白1在乳腺癌組織中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞活力和侵襲能力的影響*

翟媛媛，柴麗君，鄭英斌，梁 冰

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院乳腺科，河南 鄭州 450014)

乳腺癌作為女性較為常見(jiàn)的惡性腫瘤，是導(dǎo)致女性死亡的主要惡性腫瘤之一，且近年來(lái)發(fā)病率呈升高趨勢(shì)[1]，嚴(yán)重威脅女性生存健康。研究表明，乳腺癌早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響患者預(yù)后的主要因素[2]。因此，積極探討影響乳腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的相關(guān)分子機(jī)制對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。CUG連接蛋白1(CUG-binding protein 1，CUGBP1)作為RNA連接蛋白CELF家族成員，在調(diào)控mRNA前體剪切、翻譯及降解中發(fā)揮重要作用[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，CUGBP1與人類惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展關(guān)系密切[4-5]。本研究擬分析乳腺癌組織中CUGBP1蛋白表達(dá)，并觀察其對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞活力和侵襲能力的影響，以期為乳腺癌機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。

材 料 和 方 法

1 組織樣本

選取2015年3月～2017年9月在鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院擇期行改良根治性手術(shù)治療的乳腺癌患者96例，術(shù)前均未行放化療治療，術(shù)后病理診斷證實(shí)。均為女性，年齡25～74歲，平均年齡(54.67±10.14)歲，腫瘤直徑0.8～10.8 cm(中位數(shù)4.0 cm)；病理學(xué)類型：浸潤(rùn)性乳腺癌82例，其它14例；根據(jù)第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期19例，Ⅱ期47例，Ⅲ～Ⅳ期30例；組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)26例，Ⅱ級(jí)41例，Ⅲ級(jí)29例；孕激素受體(progesterone receptor，PR)：陽(yáng)性61例，陰性35例；雌激素受體(estrogen receptor，ER)：陽(yáng)性65例，陰性31例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例。術(shù)中留取乳腺癌及距離腫瘤邊緣>5 cm正常癌旁組織，一部分甲醛固定，石蠟包埋保存，另一部分快速置于液氮中，-80 ℃保存。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均行知情同意。

2 試劑和儀器

免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物公司；兔抗人CUGBP1多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；MCF-7細(xì)胞購(gòu)自中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；胎牛血清和胰酶購(gòu)自上海斯信生物科技公司；DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco；CUGBP1干擾序列和陰性對(duì)照序列由上海吉瑪制藥技術(shù)公司設(shè)計(jì)合成；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol總RNA提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen；MTT液購(gòu)自Sigma；Transwell小室購(gòu)自Corning；Matrigel購(gòu)自BD；兔抗人Twist多克隆抗體購(gòu)自Abcam；兔抗人E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物公司；兔抗人波形蛋白(vimentin)單克隆抗體購(gòu)自Epitomics。全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自BioTek；凝膠電泳分析系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad。

3 方法

3.1免疫組化檢測(cè)乳腺癌組織中CUGBP1蛋白的表達(dá) 取乳腺癌及癌旁組織石蠟標(biāo)本，按4 μm厚連續(xù)切片，浸入二甲苯5 min脫蠟，梯度濃度乙醇至水，利用檸檬酸緩沖液行熱修復(fù)15 min，PBS沖洗3次，浸入3%過(guò)氧化氫10 min，PBS沖洗3次，加入正常山羊血清封閉液，室溫下反應(yīng)15 min。將 I 抗兔抗人CUGBP1多克隆抗體按1 ∶800稀釋加入，4 ℃過(guò)夜孵育，以PBS替代 I 抗作為陰性對(duì)照。PBS沖洗3次，加入 II 抗，室溫下反應(yīng)120 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染3 min，自來(lái)水沖洗5 min，脫水、透明、封片，鏡下觀察。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定[6]：(1)染色強(qiáng)度：按無(wú)著色、強(qiáng)黃色、棕黃色和黃褐色分別賦予0～3分；(2)陽(yáng)性細(xì)胞比例：按<5%、5%～25%、25%～50%、50%～75%和>75%分別賦予0～4分；(3)根據(jù)(1)×(2)得分：陰性為0～2分，陽(yáng)性為>3分。

3.2細(xì)胞培養(yǎng) 將MCF-7細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為飽和濕度、5% CO2、37 ℃。24 h后傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.3實(shí)驗(yàn)分組及CUGBP1-siRNA的轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分成3組：(1)CUGBP1-siRNA組：細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染CUGBP1的干擾序列5’-GCUUUGGUUUUGUAAGUUA-3’；(2)陰性對(duì)照(negative control,NC)組：細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染合成的陰性對(duì)照序列5’-GCACAAUGAUUGAUACCAA-3’；(3)空白(blank)組：細(xì)胞不作任何處理。以每孔1×105將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，融合度達(dá)70%時(shí)轉(zhuǎn)染，各組處理后繼續(xù)恒溫培養(yǎng)48 h。

3.4Western blot檢測(cè)MCF-7細(xì)胞中CUGBP1、Twist、E-cadherin和vimentin蛋白的表達(dá) 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，加入預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解40 min，4 ℃條件下離心5 min，取上清，按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取50 μg總蛋白，行SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉60 min，PBST沖洗3次，將 I抗兔抗人CUGBP1、Twist、E-cadherin和vimentin抗體(稀釋比例1 ∶600、1∶800、1∶500和1∶1 200)加入，4 ℃過(guò)夜孵育，PBST沖洗3次，加入 II抗，室溫下孵育120 min，PBST沖洗3次，加入化學(xué)發(fā)光液，暗室下反應(yīng)15 min，成像、拍照。利用ImageJ圖像分析軟件以GAPDH為內(nèi)參照計(jì)算細(xì)胞中各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取各組細(xì)胞，胰酶消化，接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為每孔2×103個(gè)，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h和96 h時(shí)，分別向各孔加入MTT液(5 g/L)20 μL，培養(yǎng)3 h，各孔再加入二甲基亞砜150 μL，利用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度(A)值，每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.6Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲力 用無(wú)血清培養(yǎng)液按1∶3對(duì)Matrigel進(jìn)行稀釋，加入到Transwell小室上室，37 ℃風(fēng)干備用。用胰酶對(duì)各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，胰酶消化，離心取細(xì)胞沉淀，用不含血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度為5×107/L，取200 μL細(xì)胞懸液加入小室上室，將含10%胎牛血清的培養(yǎng)液600 μL加入下室，恒溫培養(yǎng)1 d，0.1%結(jié)晶紫染色，鏡下觀察，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用n(%)表示，其統(tǒng)計(jì)推斷采用2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組資料比較采用單因素方差分析，多重比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 乳腺癌組織中CUGBP1蛋白表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，乳腺癌組織中CUGBP1陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，見(jiàn)圖1及表1。

Figure 1.The protein expression of CUGBP1 in the breast cancer and adjacent tissues was detected by immunohistochemistry (×200).

圖1 免疫組化法檢測(cè)乳腺癌和癌旁組織中CUGBP1蛋白表達(dá)

2 CUGBP1的表達(dá)對(duì)乳腺癌臨床指標(biāo)的影響

由表2可知，CUGBP1的表達(dá)與乳腺癌患者年齡、腫瘤直徑、病理學(xué)類型、PR和ER無(wú)關(guān)(P>0.05)，而與TNM分期、組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。

表1 免疫組化檢測(cè)乳腺癌和癌旁組織中CUGBP1蛋白表達(dá)情況

Table 1.The CUGBP1 protein expression in the breast cancer and adjacent tissues detected by immunohistochemistry (n=96)

TissuePositiveNegative2PBreast cancer72 (75.00%)24 (25.00%)28.900<0.001Adjacent35 (36.46%)61 (63.54%)

表2 CUGBP1表達(dá)對(duì)乳腺癌臨床指標(biāo)的影響

Table 2.The relationships between protein expression of CUGBP1 and clinical indicators of breast cancer

Clinical indicatornCUGBP1 positive2PAge (year)0.3550.551 ≥555540 (72.73%) <554132 (78.05%)Tumor diameter (cm)1.3910.238 >24637 (80.43%) ≤25035 (70.00%)Pathological type0.1110.738 Invasive8261 (74.39%) Others1411 (78.57%)TNM staging5.2360.022 Ⅰ～Ⅱ6645 (68.18%) Ⅲ～Ⅳ3027 (90.00%)Histological grading8.7120.003 Ⅰ～Ⅱ6756 (83.58%) Ⅲ2916 (55.17%)PR0.7340.391 Positive6144 (72.13%) Negative3528 (80.00%)ER0.0160.900 Positive6549 (75.38%) Negative3123 (74.19%)Lymph node metastasis6.1280.013 Yes4942 (85.71%) No4730 (63.83%)

3 CUGBP1在轉(zhuǎn)染CUGBP1-siRNA的細(xì)胞中的表達(dá)

NC組CUGBP1的蛋白表達(dá)與blank組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而CUGBP1-siRNA組細(xì)胞CUGBP1的蛋白表達(dá)顯著低于blank組(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

4 各組MCF-7細(xì)胞中Twist、E-cadherin和vimentin蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果

Western blot結(jié)果表明，CUGBP1-siRNA組Twist和vimentin的蛋白水平均顯著低于blank組(P<0.01)，而E-cadherin的蛋白水平顯著高于blank組(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

Figure 2.The protein expression of CUGBP1 in the MCF-7 cells transfected withCUGBP1-siRNA. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank group.

圖2 CUGBP1在轉(zhuǎn)染CUGBP1-siRNA的MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)

Figure 3.The protein expression of Twist, E-cadherin and vimentin in the MCF-7 cells of each group was determined by Western blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank group.

圖3 Western blot法檢測(cè)Twist、E-cadherin和vimentin蛋白在各組MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)

5 各組細(xì)胞活力的變化

MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，與blank組比較，CUGBP1-siRNA組24、48、72和96 h時(shí)的細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)表3。

6 各組MCF-7細(xì)胞侵襲能力的變化

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CUGBP1-siRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于blank組(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

討 論

乳腺癌作為影響女性健康的主要惡性腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率呈逐漸升高趨勢(shì)，且出現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[7]，由于該腫瘤發(fā)病較為隱匿，早期不易被發(fā)現(xiàn)，盡管該腫瘤診療水平不斷提高，但患者總體預(yù)后改善有效，死亡率仍然較高，且呈升高趨勢(shì)[8]。研究表明[9-10]，乳腺癌細(xì)胞高侵襲、轉(zhuǎn)移性是影響患者預(yù)后的重要因素。因此，從分子水平積極探討影響乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展的敏感基因，對(duì)患者早期診斷及臨床綜合診療具有重要意義。CUGBP1是CELF家族重要成員，其基因位于人染色體11p11，與維持細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中mRNA穩(wěn)定及功能發(fā)揮密切相關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，CUGBP1在胚胎發(fā)育、骨骼及脂肪分化、生殖細(xì)胞形成中發(fā)揮重要作用[12]。最近研究表明，CUGBP1在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，參與了腫瘤發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程[13]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中CUGBP1陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，說(shuō)明CUGBP1在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，提示CUGBP1可能參與了乳腺癌發(fā)生過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中CUGBP1蛋白在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、組織學(xué)分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中呈高表達(dá)，說(shuō)明CUGBP1參與了乳腺癌進(jìn)展過(guò)程。

本研究利用轉(zhuǎn)染CUGBP1基因干擾序列的方法特異性沉默乳腺癌MCF-7細(xì)胞中CUGBP1基因表達(dá)，結(jié)果顯示，CUGBP1-siRNA組細(xì)胞中CUGBP1蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照序列組和空白組，提示乳腺癌細(xì)胞中CUGBP1基因表達(dá)被抑制。有研究指出，CUGBP1參與了肺癌細(xì)胞增殖過(guò)程[14]。本研究MTT結(jié)果顯示，CUGBP1-siRNA組細(xì)胞24 h、48 h、72 h和96 h時(shí)細(xì)胞活力均低于blank組，說(shuō)明CUGBP1可能參與了乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程，特異性沉默乳腺癌細(xì)胞中CUGBP1表達(dá)可有效抑制細(xì)胞活力。本研究結(jié)果顯示，CUGBP1-siRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)少于blank組，說(shuō)明特異性沉默乳腺癌細(xì)胞中CUGBP1表達(dá)可有效抑制細(xì)胞侵襲能力。有研究指出，CUGBP1可能有助于顯著增加上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的進(jìn)展[15]。而EMT在乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，且與乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過(guò)程密切相關(guān)[16]。在EMT過(guò)程中，上皮標(biāo)志物(如E-cadherin)會(huì)表達(dá)丟失，而間充質(zhì)標(biāo)志物(如vimentin)會(huì)表達(dá)上調(diào)，同時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子(如Twist)則參與調(diào)控了EMT過(guò)程[17]。本研究結(jié)果顯示，CUGBP1-siRNA組細(xì)胞中Twist和vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于blank組，而E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量則升高，說(shuō)明特異性沉默乳腺癌細(xì)胞中CUGBP1表達(dá)可有效抑制細(xì)胞EMT過(guò)程，提示CUGBP1可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞EMT過(guò)程而參與了乳腺癌細(xì)胞惡性增殖和侵襲過(guò)程。

表3 不同時(shí)點(diǎn)各組MCF-7細(xì)胞活力的變化

*P<0.01vsblank group.

Figure 4. The invasion ability of the MCF-7 cells in each group detected by Transwell assay (crystal violet staining, ×200). Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank group.

圖4 Transwell法檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力的變化