lincRNA-p21通過STAT3信號抑制結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖*

朱克祥，張正聰，袁得峰，呂鵬飛，白小平

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院1普外二科,2東崗院區(qū)普外科,3甘肅省生物治療與再生醫(yī)學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

結(jié)直腸癌是發(fā)生于消化道結(jié)腸和直腸部位的惡性腫瘤，在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中其發(fā)病率和病死率較高[1-2]。隨著人們生活習(xí)慣的改變及環(huán)境的變化，結(jié)直腸癌發(fā)生率每年都有不同程度的增加趨勢[3]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類核苷酸長度超過200 bp、不編碼蛋白質(zhì)、對基因表達具有調(diào)控作用的RNA分子[4-5]。研究顯示，lncRNA的異常表達與一些腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌形成的過程中，lncRNA的表達表現(xiàn)出異常，在腫瘤組織中的表達與癌旁組織相比一些lncRNA表現(xiàn)為下調(diào)，另外一些lncRNA表現(xiàn)為上調(diào)[6]。最近研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌組織中基因間區(qū)長鏈非編碼RNA-p21(long intergenic non-coding RNA-p21,lincRNA-p21)的表達量顯著降低，提示lincRNA-p21在結(jié)直腸癌中起到抑癌作用，是一種抑癌性lncRNA[7]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)是一類轉(zhuǎn)錄因子，受上游激酶激活后可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等過程[8-9]。STAT3是STAT家族成員之一，磷酸化的STAT3進入到細(xì)胞核內(nèi)，啟動基因轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[10]。研究表明STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、增殖和凋亡抑制等過程[11]。lincRNA-p21可通過調(diào)控多種信號通路參與多種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)過程，目前未見關(guān)于lincRNA-p21對結(jié)直腸癌作用及分子機制的研究，因此本實驗通過體外培養(yǎng)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116，探討lincRNA-p21對結(jié)直腸癌細(xì)胞生長的影響并對其是否通過調(diào)控STAT3信號通路實現(xiàn)該功能進行初步探討，以期為結(jié)直腸癌的治療及預(yù)后提供分子治療靶點。

材 料 和 方 法

1 材料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116購于上海中科院細(xì)胞研究所。膠原酶、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Sigma；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；pcDNA-lincRNA-p21和pcDNA3.1 control購自CST；MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega；TRIzol提取RNA試劑盒購于武漢艾美捷公司；SYBR Green Gene Expression Assay購自大連寶生物公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購于江蘇凱基生物公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購自Thermo；ECL發(fā)光試劑盒購自Bio-Rad；MTT購自廣州朗日生物公司；抗STAT3抗體和抗p-STAT3抗體購自Abcam；辣根過氧化物標(biāo)記的 II 抗購于碧云天生物科技公司；實驗所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

2 方法

2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取生長對數(shù)期的HCT116細(xì)胞，按照每孔105個接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達到70%時，將pcDNA-lincRNA-p21和pcDNA3.1 control分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別記為pcDNA-lincRNA-p21組和pcDNA組;以不做任何處理的HCT116細(xì)胞為正常對照(control)組。按照轉(zhuǎn)染試劑說明書用Lipofectamine 2000進行轉(zhuǎn)染，于37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換為新的RPMI-1640培養(yǎng)液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2RT-qPCR測定lincRNA-p21的表達水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，按照TRIzo1提取RNA試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA、RNA經(jīng)濃度和純度檢測后用MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行合成cDNA。用SYBR Green Gene Expression Assay試劑盒進行熒光定量PCR擴增，反應(yīng)體系為20 μL(cDNA模板4 μL，SYBR Green 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DEPC-H2O 4 μL)，反應(yīng)條件為： 95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，用相對定量2-ΔΔCt法分析lincRNA-p21的表達水平。GAPDH的上游引物序列為5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游引物序列為5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’; lincRNA-p21的上游引物序列為5’-CCCGGGC-TTGTCTTTTGTT-3’，下游引物序列為5’-GAGTGGGTGGCTCACTCTTCTG-3’。

2.3MTT測定結(jié)直腸癌細(xì)胞的活力 將各組細(xì)胞接種到96孔板中，每個組設(shè)置5個重復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h后，將濃度為0.5 g/L的MTT 20 μL加入到每孔細(xì)胞中，將細(xì)胞放置在37 ℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h；取出細(xì)胞培養(yǎng)板，去掉上清后，在每個孔中依次添加100 μL的DMSO溶液，置于振蕩儀上緩慢搖動反應(yīng)10 min，于酶標(biāo)儀上測定每孔570 nm波長處的吸光度(A)值。以時間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制HCT116細(xì)胞的生長曲線。

2.4平板集落形成實驗檢測細(xì)胞集落形成的能力 取各組細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液，每組細(xì)胞分別以每個培養(yǎng)皿50、100和200個細(xì)胞接種到含10 mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周以后，肉眼觀察到培養(yǎng)皿中形成的細(xì)胞集落時，把培養(yǎng)液移除，用PBS小心洗滌2次，加入5 mL 4 %的多聚甲醛固定細(xì)胞15 min。去除固定液后用吉姆薩染色液染20 min，然后用流水沖洗掉染液，于空氣中干燥。將平皿倒置，肉眼直接計數(shù)細(xì)胞集落數(shù)。集落形成率(%)=細(xì)胞集落數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)×100 %。

2.5Western blot檢測STAT3和p-STAT3的蛋白水平 采用胰蛋白酶消化法收集轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，置于冰上加入細(xì)胞裂解液，4 ℃離心，收集上清，采用BCA法測定提取上清中蛋白濃度。取蛋白樣品加入等體積上樣緩沖液混合后煮沸5 min，使蛋白樣品充分變性。每個泳道加20 μL變性的蛋白樣品，采用5%的濃縮膠和12%的分離膠進行電泳，以90 V的低壓在濃縮膠中進行電泳，以120 V的電壓在分離膠中電泳。電泳結(jié)束后取出凝膠，放入電轉(zhuǎn)膜液中以300 mA恒流進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用洗液將PVDF膜洗滌15 min，之后把PVDF膜放在用TBST稀釋的牛血清白蛋白中室溫封閉 2 h。加入300倍稀釋的 I 抗4 ℃反應(yīng)過夜，加入1 000倍稀釋的 II 抗室溫孵育2 h。用ECL顯色試劑盒進行顯色，用凝膠成像儀進行拍照，以GAPDH為內(nèi)參照，分析蛋白表達水平。

2.6STAT3激活劑對上調(diào)lincRNA-p21后HCT116細(xì)胞活力的影響 以8 μmol/L的STAT3激活劑SD19處理未經(jīng)任何處理的及轉(zhuǎn)染pcDNA-lincRNA-p21后的HCT116細(xì)胞，分別記為SD19組和pcDNA-lincRNA-p21+SD19組。處理48 h后用MTT法檢測control組、pcDNA-lincRNA-p21組、pcDNA-lincRNA-p21+SD19組和SD19組的細(xì)胞活力變化，方法同2.3。Western blot法檢測細(xì)胞中STAT3和p-STAT3的蛋白水平，步驟同2.5。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡情況 收集處理48 h后的各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS對細(xì)胞進行洗滌3次，在細(xì)胞中加入400 μL的Binding Buffer結(jié)合緩沖液進行混合，再依次加入10 μL PI 和5 μL Annexin V-FITC，室溫下避光反應(yīng)5 min，用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HCT116細(xì)胞的凋亡情況。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗所得數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。用單因素方差分析進行多組間差異比較，用SNK-q檢驗進行多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染后HCT116細(xì)胞中l(wèi)incRNA-p21的表達

與control組和pcDNA組相比，pcDNA-lincRNA-p21組細(xì)胞中l(wèi)incRNA-p21的表達水平顯著升高(P<0.05)；與control組相比，pcDNA組細(xì)胞中l(wèi)incRNA-p21的表達水平無明顯變化，見圖1。這說明轉(zhuǎn)染pcDNA-lincRNA-p21的HCT116細(xì)胞中l(wèi)incRNA-p21的表達水平升高。

Figure 1.The expression level of lincRNA-p21 in HCT116 cells of each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group or pcDNA group.

圖1 各組HCT116細(xì)胞中l(wèi)incRNA-p21水平

2 過表達lincRNA-p21對STAT3和p-STAT3蛋白水平的影響

與control組和pcDNA組相比，pcDNA-lincRNA-p21組中STAT3和p-STAT3的蛋白水平明顯降低(P<0.05)；與control組相比，pcDNA組中STAT3和p-STAT3蛋白水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖2。這說明過表達lincRNA-p21可抑制STAT3和p-STAT3的蛋白水平，抑制STAT3信號通路的激活。

3 pcDNA-lincRNA-p21可抑制HCT116細(xì)胞的生長

過表達lincRNA-p21后，采用MTT法檢測各組HCT116細(xì)胞的活力，結(jié)果顯示，與control組和pcDNA組相比，pcDNA-lincRNA-p21組細(xì)胞的A值下降(P<0.05);與control組相比，pcDNA組細(xì)胞A值的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3。檢測HCT116細(xì)胞集落形成能力結(jié)果顯示，control組、pcDNA組和pcDNA-lincRNA-p21組細(xì)胞集落形成率分別為(41.11±4.05)%、(39.95±4.11)%和(19.11±2.24)%；與control組相比，pcDNA-lincRNA-p21組的細(xì)胞集落形成率明顯降低(P<0.05)，pcDNA組的細(xì)胞集落形成率的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖4。這些結(jié)果提示過表達lincRNA-p21可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力。

Figure 2.The protein levels of STAT3 and p-STAT3 in the HCT116 cells of each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group or pcDNA group.

圖2 各組HCT116細(xì)胞中STAT3和p-STAT3蛋白水平的變化

Figure 3.The effect of transfection on growth curve of HCT116 cells in different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group or pcDNA group.

圖3 轉(zhuǎn)染后對各組HCT116細(xì)胞生長曲線的影響

4 STAT3信號通路激活劑對過表達lincRNA-p21的HCT116細(xì)胞中STAT3和p-STAT3蛋白水平的影響

與control組相比，pcDNA-lincRNA-p21組細(xì)胞STAT3和p-STAT3蛋白水平下調(diào)，SD19組細(xì)胞STAT3和p-STAT3蛋白上調(diào)(P<0.05)，pcDNA-lincRNA-p21+SD19組細(xì)胞STAT3和p-STAT3蛋白表達的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與pcDNA-lincRNA-p21組相比，pcDNA-lincRNA-p21+SD19組細(xì)胞的STAT3和p-STAT3蛋白水平上調(diào)(P<0.05)，見圖5。這說明SD19誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞中STAT3和p-STAT3蛋白上調(diào)，激活STAT3信號通路。

Figure 4.The colony formation rate of the HCT116 cells after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group or pcDNA group.

圖4 轉(zhuǎn)染后各組HCT116細(xì)胞集落形成率的變化

5 STAT3信號通路激活劑對過表達lincRNA-p21的HCT116細(xì)胞活力和凋亡的影響

處理后48 h對各組細(xì)胞的活力進行檢測結(jié)果顯示，control組、pcDNA-lincRNA-p21組、pcDNA-lincRNA-p21+SD19組和SD19組細(xì)胞的A值分別為0.41±0.03、0.20±0.02、0.39±0.04和0.68±0.05；對各組細(xì)胞凋亡率進行檢測結(jié)果顯示，control組、pcDNA-lincRNA-p21組、pcDNA-lincRNA-p21+SD19組和SD19組的細(xì)胞凋亡率分別為(7.36±0.65)%、(31.25±2.99)%、(8.12±0.79)%、(2.84±0.19)%。與control組相比，pcDNA-lincRNA-p21組細(xì)胞的A值降低，凋亡率升高，SD19組細(xì)胞的A值升高，凋亡率降低(P<0.05)，pcDNA-lincRNA-p21+SD19組細(xì)胞A值和凋亡率的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與pcDNA-lincRNA-p21組相比，pcDNA-lincRNA-p21+SD19組細(xì)胞的A值升高,凋亡率降低(P<0.05)，見圖6。這說明SD19可通過激活STST3信號通路而消除lincRNA-p21過表達對結(jié)直腸癌細(xì)胞生長的抑制作用。

Figure 5.The changes of STAT3 and p-STAT3 protein levels in the HCT116 cells of each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vspcDNA-lincRNA-p21 group.

圖5 各組HCT116細(xì)胞中STAT3和p-STAT3蛋白水平的變化

Figure 6.The changes of the viability (A) and apoptotic rate (B) of the HCT116 cells in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vspcDNA-lincRNA-p21 group.

圖6 各組HCT116細(xì)胞活力和凋亡率的比較

討 論

結(jié)直腸癌是我國常見的消化道內(nèi)腫瘤之一，近30年來發(fā)病率年均上升3%～4%，嚴(yán)重危害人類健康。目前治療結(jié)直腸癌的核心手段仍然是手術(shù)切除，手術(shù)的發(fā)展趨勢是最大程度的保留功能，盡量減少創(chuàng)傷。因此，尋找診斷、預(yù)后和治療結(jié)直腸癌的特異性分子標(biāo)志物及有效靶點成為近年來研究的熱點[12]。近年來對lncRNA了解的深入，發(fā)現(xiàn)lncRNA具有多種生理病理生物學(xué)功能，如mRNA的降解、染色體失活、調(diào)控染色質(zhì)重塑和調(diào)控細(xì)胞生長等[13-14]。有關(guān)研究表明，不同種類的lncRNA在腫瘤組織和正常組織中的表達水平存在差異，一些lncRNA已被證實與某些疾病的發(fā)生存在密切的關(guān)系[15]。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展常伴隨著lncRNA的異常表達，lncRNA在結(jié)直腸癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要的作用，識別并確認(rèn)lncRNA的生物學(xué)功能可為治療、診斷結(jié)直腸癌提供新的理論依據(jù)[16]。lincRNA-p21是位于人第6號染色體上一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，具有抑癌作用。研究表明，lincRNA-p21在腫瘤組織中表達明顯低于健康組織，lincRNA-p21下調(diào)表達可參與肝癌細(xì)胞周期停滯，lincRNA-p21上調(diào)表達可促進肝癌細(xì)胞凋亡[17]。LincRNA-p21還可通過調(diào)控Bax、Noxa和Puma等基因的表達抑制腎細(xì)胞癌的增殖[18]。本實驗通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染法上調(diào)HCT116細(xì)胞中l(wèi)incRNA-p21水平，通過MTT法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCT116細(xì)胞活力顯著降低，說明過表達lincRNA-p21的HCT116細(xì)胞生長受到抑制，lincRNA-p21可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長，具有抑制結(jié)直腸癌的作用，與上述研究相符。

STAT3屬于STAT家族，是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子，可被細(xì)胞膜上生長因子及細(xì)胞因子激活發(fā)揮調(diào)控核內(nèi)轉(zhuǎn)錄的作用。STAT3信號通路可通過調(diào)控具有重要功能的基因發(fā)揮調(diào)節(jié)生物學(xué)功能的作用，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞免疫和新陳代謝等[19-20]。姜黃素通過上調(diào)STAT3信號通路中靶基因Bax的表達，下調(diào)Bcl-2、Bak及survivin的表達，抑制STAT3信號分子的活化，最終抑制人胰腺癌SW1990細(xì)胞的增殖[21]。2’-羥基黃烷酮阻斷Akt/STAT3信號通路抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲遷移，并伴隨STAT3信號通路中相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶9和p-STAT3的表達下調(diào)[22]。本實驗采用STAT3信號通路激活劑SD19處理HCT116細(xì)胞，通過Western blot法檢測STAT3信號通路中STAT3和p-STAT3蛋白水平，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)STAT3和p-STAT3蛋白水平顯著升高，說明STAT3信號通路的激活劑SD19可激活STAT3信號通路。之后對結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞的活力進行檢測，發(fā)現(xiàn)HCT116細(xì)胞的活力明顯升高，凋亡率降低。以上實驗結(jié)果提示，激活STAT3信號通路可促進結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞的生長，與上述研究一致。

Zhai等[23]在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者的結(jié)直腸癌組織中l(wèi)incRNA-p21的表達明顯低于癌旁組織，結(jié)直腸癌患者lincRNA-p21的表達水平低于直腸癌患者。lincRNA-p21與抑癌基因p53密切相關(guān)，p53途徑可調(diào)控下游基因lincRNA-p21，通過激活lincRNA-p21的表達抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長，起到抑癌作用[23-24]。下調(diào)lincRNA-p21可抑制乏氧人肝癌SMMC7721細(xì)胞和腦膠質(zhì)瘤U251MG細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，使細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞增殖和遷移受到抑制，細(xì)胞中HIF-1α降解，GLUT1蛋白表達下降，并調(diào)控HIF-1/Akt/mTOR/P70通路而抑制細(xì)胞自噬[25-26]。表達譜分析顯示在結(jié)直腸癌組織中l(wèi)incRNA-p21表達降低。上調(diào)lincRNA-p21表達可抑制β-連環(huán)蛋白表達，促進凋亡相關(guān)基因Noxa表達，從而增強放射治療對人結(jié)直腸癌的敏感性[27]。這提示lincRNA-p21可通過靶向Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)途徑促進結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。以上研究結(jié)果顯示lincRNA-p21可通過多個重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本實驗結(jié)果得出，lincRNA-p21可通過調(diào)控STAT3信號通路影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長。在本實驗中，過表達lincRNA-p21的結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞中STAT3和p-STAT3蛋白水平有不同幅度的下調(diào)，細(xì)胞生長受到抑制，且通過STAT3信號通路激活劑SD19處理過表達lincRNA-p21的結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞中STAT3和p-STAT3蛋白水平有不同幅度的下調(diào)，細(xì)胞生長抑制被消除，說明lincRNA-p21可通過調(diào)控STAT3信號通路影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長。

綜上所述，lincRNA-p21上調(diào)可抑制結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞的增殖，并且其表達水平的升高引起STAT3和p-STAT3蛋白水平的降低，提示其作用機制與抑制STAT3信號有關(guān)。這表明lincRNA-p21可能成為預(yù)防和治療結(jié)直腸癌的新的分子標(biāo)志物和靶點。