方雪嬌,徐建昕,王思萱,龍露葉,管 晨,錢詩菡,呂建新
(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院,浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點實驗室,浙江 溫州 325035)
大多數(shù)國家女性腫瘤患者中乳腺癌的診斷率和腫瘤相關(guān)死亡率均位居第1位。據(jù)預(yù)測,2018年全球范圍內(nèi)女性乳腺癌新增患者將達(dá)210萬,占據(jù)女性腫瘤患者人數(shù)的四分之一[1]。乳腺癌根據(jù)細(xì)胞膜上受體[雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)和人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2, HER-2)]表達(dá)不同而分為4種類型,其中3種受體均不表達(dá)的三陰性乳腺癌由于缺乏有效的治療措施而成為當(dāng)前乳腺癌治療的一大難題。三陰性乳腺癌的預(yù)后差、易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率高成為乳腺癌致死的主要原因[2],因此探索和挖掘有效的治療方法迫在眉睫。
他莫昔芬(tamoxifen,Tam)是雌激素受體拮抗劑,在體內(nèi)與雌激素競爭受體,從而阻斷雌激素發(fā)揮作用,主要用于ER陽性乳腺癌的治療;近年來發(fā)現(xiàn)在ER陰性的乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌和膽管癌等腫瘤中,他莫昔芬以雌激素非依賴的方式發(fā)揮作用[3]。二甲雙胍(metformin,Met)廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的治療,通過激活A(yù)MP活化的蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK],促進肌肉攝取血液中的葡萄糖而達(dá)到降糖目的。研究顯示,二甲雙胍可以降低糖尿病患者的腫瘤發(fā)生率和腫瘤相關(guān)死亡率[4]。因此,近年來二甲雙胍用于腫瘤研究的熱度不減。轉(zhuǎn)錄因子MYC家族3個成員MYC、MYCN和MYCL1中,前者研究頗多。由其編碼的蛋白c-Myc,通過與MAX形成異源二聚體,識別并結(jié)合DNA上的CACGTG序列發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。Horiuchi等[5]利用生物信息學(xué)技術(shù)和I-SPY數(shù)據(jù)分析乳腺癌中c-Myc的表達(dá)以三陰性乳腺癌偏高;Korangath等[6]的研究中顯示MDA-MB-231細(xì)胞中c-Myc表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞HMEC1,且異常升高的c-Myc促進了三陰性乳腺癌的增殖、遷移、侵襲和抗凋亡作用[5]。
Kang 等[7]以1 mmol/L的他莫昔芬作用于三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞72 h后c-Myc的mRNA水平升高了5倍,蛋白水平升高了3倍;他莫昔芬耐藥的MCF-7細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)水平更高[8];他莫昔芬敏感的細(xì)胞中,他莫昔芬通過靶向mircoRNA-320a/ARPP-19/ERRY/c-Myc影響了MCF-7細(xì)胞和T47D細(xì)胞的增殖和平板集落形成[9],這說明他莫昔芬與c-Myc之間存在著關(guān)聯(lián)。二甲雙胍抑制唾液腺癌細(xì)胞生長具有濃度和時間依賴性,同時抑制c-Myc蛋白表達(dá);二甲雙胍調(diào)控JAK/STAT3/c-Myc通路阻止食管鱗狀細(xì)胞腫瘤微環(huán)境引起的正常上皮向腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)變[10];前期的工作也表明二甲雙胍可以抑制乳腺癌細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)[11]。二甲雙胍聯(lián)合他莫昔芬的協(xié)同作用已在ER陽性乳腺癌細(xì)胞中得到驗證[12-15],但是在三陰性乳腺癌中研究甚少,更不曾體內(nèi)水平驗證兩藥聯(lián)合的協(xié)同作用。因此本文對此進行了探討,在體內(nèi)和體外水平證明了二甲雙胍與他莫昔芬聯(lián)合使用對三陰性乳腺癌有協(xié)同抗腫瘤作用。
三陰性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所中國科學(xué)院細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清(Biological Industries)、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素(Solarbio)的DMEM(Gibco)培養(yǎng)基中,放置于溫度為37 ℃、5% CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4周齡SCID雌性小鼠16只購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,動物合格證號為SCXK(滬)2017-0005,飼養(yǎng)于SPF級動物房。
二甲雙胍、他莫昔芬和DMSO購自中國上海西格瑪奧德里奇公司。二甲雙胍以PBS配制成濃度為1 mol/L的原液,-20 ℃儲存?zhèn)溆?,他莫昔芬則用DMSO為溶劑配成濃度為10 mmol/L的原液,-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>
4.1CCK-8法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞胰酶消化后,配制3.5×107/L的懸液,再以100 μL懸液接種于96孔板。細(xì)胞貼壁后,每孔加入100 μL含有不同藥物[0.1% DMSO(control組)、18.75 μmol/L他莫昔芬(Tam組)、5 mmol/L二甲雙胍(Met組)或5 mmol/L二甲雙胍+18.75 μmol/L他莫昔芬(Met+Tam組)]的DMEM培養(yǎng)基,作用24、48和72 h后,加入CCK-8工作液100 μL,37 ℃孵育1 h后用酶標(biāo)儀測450 nm處的吸光度(A)值,繪制生長曲線。
4.2平板集落形成實驗 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞以每孔1×103個鋪于6孔板內(nèi)。 72 h后按分組更換為2 mL含有不同藥物的DMEM培養(yǎng)基,每3 d更換 1 次培養(yǎng)基,直至形成肉眼可見的細(xì)胞集落。隨后進行4%多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色,室溫干燥后進行拍照,統(tǒng)計并計算相對集落形成率。
4.3流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞以每孔1.5×105鋪于6孔板,24 h細(xì)胞貼壁后,更換為含有0.1% DMSO、18.75 μmol/L他莫昔芬、5 mmol/L二甲雙胍及5 mmol/L二甲雙胍+18.75 μmol/L他莫昔芬的培養(yǎng)基持續(xù)作用72 h,收集細(xì)胞,PBS洗滌2次,將含有annexin V-FITC和PI的結(jié)合緩沖液500 μL加入細(xì)胞沉淀中,重懸后室溫避光孵育,在15 min至1 h內(nèi)進行流式細(xì)胞術(shù)分析,統(tǒng)計并分析細(xì)胞凋亡率。
4.4Transwell小室遷移實驗 收集對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞,無血清DMEM培養(yǎng)基重懸混勻并計數(shù)。Transwell小室上室加入200 μL細(xì)胞懸液(MDA-MB-231細(xì)胞為2×104個),下室加入600 (L含20% FBS的培養(yǎng)基用于誘導(dǎo)細(xì)胞向下遷移,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h,取出小室,棄上室內(nèi)培養(yǎng)基后將小室放入4%多聚甲醛中固定20 min,去掉多聚甲醛,室溫晾干后放入結(jié)晶紫中染色20 min,棉簽輕輕擦凈上室細(xì)胞及染料,10×10倍鏡下隨機選取5個視野,顯微鏡下計數(shù),比較各組間細(xì)胞數(shù)的差異。
4.5Transwell小室侵襲實驗 4 ℃冰上過夜融化基質(zhì)膠,按照基質(zhì)膠∶DMEM無血清培養(yǎng)基=1∶9的比例配制所需體積混合液,混勻后每孔40 μL混合液加入小室上室,于37 ℃溫育12 h使基質(zhì)膠完全聚合。種植細(xì)胞前吸去小室內(nèi)殘余液體,每孔加入100 μL DMEM培養(yǎng)基原液水化30 min,其余步驟同Transwell遷移實驗。
4.6Western blot實驗 用預(yù)冷的RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白。經(jīng)10% SDS-PEAG電泳后轉(zhuǎn)膜1 h,室溫脫脂牛奶封閉1 h,4 ℃的 I 抗(c-Myc 1∶2 000,β-actin 1∶1 000)孵育過夜;室溫 II 抗孵育1 h;SuperSignal Protein Detection Kit增強化學(xué)發(fā)光顯色,Bio-Rad凝膠成像儀系統(tǒng)曝光獲取圖像。
4.7小鼠皮下成瘤實驗 雌性SCID小鼠16只飼養(yǎng)于SPF級動物房,隨機分為對照組、二甲雙胍組、他莫昔芬組和二甲雙胍+他莫昔芬組。收集MDA-MB-231細(xì)胞,以8×106個細(xì)胞注射到小鼠右側(cè)腹部皮下,15 d后,每組小鼠分別接受相應(yīng)的處理。對照組:生理鹽水;二甲雙胍組:125 mg/kg;他莫昔芬組:60 mg/kg;二甲雙胍+他莫昔芬組:125 mg/kg+60 mg/kg。其中二甲雙胍溶于生理鹽水,他莫昔芬溶于玉米油。此后每 3 d進行 1 次如上處理。21 d后處死小鼠,剝?nèi)×鲶w并進行下一步分析。
4.8免疫組化分析 4% 多聚甲醛固定腫瘤組織,石蠟包埋,切片、脫蠟、復(fù)水、抗原修復(fù)、5% BSA封閉切片,加入c-Myc抗體(5 mg/L)4 ℃孵育過夜、室溫 II 抗30 min、SABC室溫30 min、DBA顯色、蘇木精復(fù)染。5% BSA作為陰性對照。顯微鏡下觀察棕色顆粒,并于400倍鏡下拍照。利用Image-Pro Plus軟件分析其積分吸光度。
實驗數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析處理。數(shù)據(jù)采用3次以上獨立實驗結(jié)果的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,利用單因素方差分析(one-way AVONA)比較各實驗組和對照組及各實驗組間的差異,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
CCK-8實驗結(jié)果顯示,單獨用藥對MDA-MB-231細(xì)胞活力的抑制作用具有濃度和時間依賴性。當(dāng)他莫昔芬濃度為18.75 μmol/L、二甲雙胍濃度為5 mmol/L及作用時間達(dá)到72 h時,抑制作用明顯增強,因此選擇此藥物濃度及作用時間做后續(xù)研究。當(dāng)他莫昔芬和二甲雙胍聯(lián)合作用于MDA-MB-231細(xì)胞72 h后,細(xì)胞活力為對照組的53.8%,明顯低于對照組和單獨用藥組(P<0.01),見圖1。
為進一步探討聯(lián)合用藥對腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響,我們檢測了處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)不同處理培養(yǎng)72 h后的集落形成能力。結(jié)果顯示,與對照和單獨用藥組相比,聯(lián)合用藥對MDA-MB-231細(xì)胞的集落形成能力的抑制率為72%,顯著高于對照組、他莫昔芬組和二甲雙胍組(P<0.05或P<0.01),見圖2。這一結(jié)果表明聯(lián)合用藥對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用大于單獨用藥。
利用Annexin V-FITC/PI熒光雙染法和流式細(xì)胞術(shù)檢測兩藥單獨及聯(lián)合作用對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡能力的影響。結(jié)果顯示,兩藥聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率為11.6%,高于對照組、他莫昔芬組和二甲雙胍組(P<0.01),見圖3。
在Transwell實驗中,不同處理作用72 h,MDA-MB-231細(xì)胞從小室上層向下層的遷移和侵襲能力明顯減弱,兩藥聯(lián)合組遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)減少的程度更顯著(P<0.05或P<0.01),見圖4。
Figure 1.Metformin (Met) enhanced the inhibition of the viability of MDA-MB-231 cells induced by tamoxifen (Tam). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;&&P<0.01vsTam group;##P<0.01vsMet group.
圖1 二甲雙胍增強了他莫昔芬對MDA-MB-231細(xì)胞活力的抑制作用
Figure 2.Metformin (Met) enhanced tamoxifen (Tam)-induced inhibition of the colony formation of MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;&&P<0.01vsTam group;##P<0.01vsMet group.
圖2 二甲雙胍增強了他莫昔芬對MDA-MB-231集落形成能力的抑制作用
Figure 3.Metformin (Met) promoted the apoptosis of MDA-MB-231 cells induced by tamoxifen (Tam). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;&&P<0.01vsTam group;##P<0.01vsMet group.
圖3 二甲雙胍促進他莫昔芬誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡
Figure 4.Metformin (Met) enhanced tamoxifen (Tam)-induced inhibition of migration (A) and invasion (B) abilities of MDA-MB-231 cells (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;&&P<0.01vsTam group;##P<0.01vsMet group.
圖4 二甲雙胍增強他莫昔芬對MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用
當(dāng)二甲雙胍和他莫昔芬單獨作用于MDA-MB-231細(xì)胞時,c-Myc蛋白表達(dá)出現(xiàn)輕微下降;而聯(lián)合用藥后c-Myc蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.01),見圖5。
Figure 5.The effect of combination use of metformin (Met) and tamoxifen (Tam) on down-regulation of c-Myc protein expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;&&P<0.01vsTam group;##P<0.01vsMet group.
圖5 二甲雙胍對他莫昔芬的增效作用與c-Myc蛋白表達(dá)下降相關(guān)
經(jīng)過二甲雙胍和他莫昔芬處理后,小鼠腫瘤體積明顯減??;然而兩藥聯(lián)合組對腫瘤體積的影響較對照組和單獨用藥組更為顯著,見圖6A、B。單獨用藥組小鼠腫瘤重量與對照組比較有輕微下降,而聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤的重量明顯低于對照組和單獨用藥組(P<0.05),見圖6C。利用Western blot檢測二甲雙胍和他莫昔芬單獨或聯(lián)合作用后腫瘤組織中c-Myc蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示c-Myc蛋白表達(dá)均受到抑制,聯(lián)合用藥組抑制程度更大(P<0.05或P<0.01),見圖6D;同樣的結(jié)果通過免疫組化對c-Myc蛋白定量得到驗證,見圖6E。這與體外細(xì)胞實驗結(jié)果一致。
三陰性乳腺癌相關(guān)研究和論著逐年增加[2]。因受體蛋白表達(dá)缺乏,導(dǎo)致患者對內(nèi)分泌治療不敏感,主要依靠化療。三陰性乳腺癌因預(yù)后差、易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高,中位生存期不超過18個月[16],因此探索新的治療方式改善病人預(yù)后至關(guān)重要。
絕經(jīng)前ER陽性原發(fā)性乳腺癌,輔以他莫昔芬治療2年,總體死亡率影響甚微,乳腺癌相關(guān)死亡率降低顯著。研究指出服用他莫昔芬5年,對女性健康有保護作用[17]。英國國家健康與臨床卓越研究所2013年制定將他莫昔芬作為乳腺癌預(yù)防措施之一。早期研究表明他莫昔芬對ER陰性乳腺癌無明顯效果,而近期的研究表明ER陰性乳腺癌也可以從他莫昔芬治療中受益[18]。二甲雙胍作為2型糖尿病治療藥物已有60多年歷史[19],其藥效安全性已被證實,單一用藥無副作用,對體重?zé)o明顯影響[20]。
在本研究中,二甲雙胍與他莫昔芬單獨作用均能抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,兩者聯(lián)合后增強了這些作用;另外,二甲雙胍和他莫昔芬單獨用藥致c-Myc蛋白出現(xiàn)輕微下降,聯(lián)合作用后顯著抑制了c-Myc蛋白的表達(dá)。進一步研究表明,二甲雙胍和他莫昔芬單獨或聯(lián)合能抑制人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞移植SCID小鼠皮下的瘤體生長,且腫瘤組織中c-Myc蛋白表達(dá)量明顯下降。以上結(jié)果與其他學(xué)者的研究結(jié)果相一致。在ER陽性乳腺癌細(xì)胞中,二甲雙胍協(xié)同他莫昔芬激活了AMPK/mTOR/p70S6、PARP/caspase7[13]和EGFR/HER/Akt[15]等,本研究最初對MAPK通路進行了驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERK、p-ERK、JNK和p-JNK均未發(fā)生改變。文獻(xiàn)報道異常升高的c-Myc與三陰性乳腺癌的惡性行為相關(guān)[5],且二甲雙胍通過抑制與周期相關(guān)蛋白的合成從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展,因此對c-Myc蛋白的表達(dá)情況進行了驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二甲雙胍聯(lián)合他莫昔芬影響了c-Myc蛋白的表達(dá),這與其他學(xué)者報道的二甲雙胍聯(lián)合他莫昔芬能都抑制c-Myc蛋白表達(dá)相一致[14]。
綜上所述,我們研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍與他莫昔芬共同處理三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞能顯著抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且體內(nèi)和體外實驗都證實能同時抑制腫瘤的c-Myc蛋白表達(dá)。雖然聯(lián)合用藥作用的具體機制尚未研究清楚,但本實驗結(jié)果為三陰性乳腺癌的藥物治療提供了新的依據(jù)。
Figure 6.Metformin (Met) enhanced the inhibitory effect of tamoxifen (Tam) on xenograft tumor growth in the SCID mice. A and B: the images of the growth and size of xenograft tumors in the SCID mice with different treatments; C: the changes of the xenograft tumor weight in different groups; D: the effects of different treatments on the protein expression level of c-Myc in the xenograft tumor tissues; E: the result of immunohistochemical staining of the xenograft tumor tissues in different groups (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.05vsMet group.
圖6 二甲雙胍增強他莫昔芬對SCID小鼠皮下移植瘤生長的抑制作用