吡咯伯克霍爾德菌WY6-5的溶磷、抑菌與促玉米生長(zhǎng)作用研究

宮安東，朱梓鈺，路亞南，萬(wàn)海燕，吳楠楠，Cheelo Dimuna，龔雙軍，文淑婷，侯曉

（信陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/河南省茶樹(shù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南信陽(yáng) 464000）

0 引言

【研究意義】中國(guó)為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國(guó)，土壤保肥和糧食增產(chǎn)是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要議題。長(zhǎng)期以來(lái)，由于對(duì)作物增產(chǎn)的盲目追求，化學(xué)肥料施用量逐年增多，導(dǎo)致土壤生態(tài)惡化[1］、有機(jī)質(zhì)減少、微生物區(qū)系改變[2］、肥力降低[3］等問(wèn)題，嚴(yán)重制約了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為此，中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制訂了《到2020年化肥使用量零增長(zhǎng)行動(dòng)方案》，以解決土壤持續(xù)惡化問(wèn)題[4］。微生物在土壤中分布廣泛，種類和功能多樣[5］，到目前為止，已報(bào)道多種微生物具有固氮、溶磷、解鉀和促生長(zhǎng)等重要作用，可以改善土壤微環(huán)境，提升土壤肥力[6］。因此，開(kāi)展微生物菌肥研制，對(duì)土壤肥力的提升和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】磷肥是植物生長(zhǎng)所必需的三大肥料之一。在我國(guó)，約74%的土壤中缺磷[7］，且95%以上的磷以難溶性的鋁硅酸鹽和磷灰石存在，無(wú)法被植物吸收利用[8］，加之農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對(duì)化學(xué)磷肥的過(guò)度依賴，施用量逐年增多，進(jìn)一步加重了土壤的礦質(zhì)化污染[9］。據(jù)估算，1949—1992 年間，我國(guó)累計(jì)施入農(nóng)田的磷肥達(dá)3.4×107t，其中大約有2.6×107t磷累積在土壤中[10］，造成了土壤酸化、板結(jié)、肥力降低和水體富營(yíng)養(yǎng)化等問(wèn)題。如何改善土壤磷環(huán)境，提升可溶性磷含量，是目前研究的熱點(diǎn)。溶磷微生物可產(chǎn)生酸性代謝物，溶解土壤中的難溶性磷化物，轉(zhuǎn)化為可溶性磷肥，補(bǔ)充植物所需磷營(yíng)養(yǎng)[11］，并能促進(jìn)植物對(duì)N、K、Ca、Mg、Fe、Zn 等其他營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，進(jìn)一步提高作物的生物量和產(chǎn)量[12］。曾廣勤等[13］研究表明，施用溶磷菌可以提高小麥的氮、磷含量，改善農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量，并提高小麥的抗旱和抗寒能力。郝晶等[14］證明，溶磷菌能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，大幅度提高豌豆產(chǎn)量。溶磷菌廣泛使用不僅可以提升土壤磷肥力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，同時(shí)還有效緩解了土壤礦質(zhì)化污染問(wèn)題，具有較好的應(yīng)用價(jià)值和生態(tài)效益。到目前為止，已報(bào)道多種微生物具有溶磷能力，如放線菌（Actinomycetessp.）[15］、芽孢桿菌（Bacillussp.）[16］、假單胞菌屬（Pseudomonassp.）[17］、沙雷氏菌屬（Serratiasp.）[18］、腸桿菌屬（Enterobactersp.）[19］、根瘤菌屬（Rhizobiumsp.）[20］以及伯克霍爾德菌屬（Burkholderiasp.）等。但針對(duì)伯克霍爾德菌的溶磷效果研究相對(duì)較少，且篩選到的菌株僅在液體搖培條件下具有活性，而在土壤中的溶磷效果，以及對(duì)植物生長(zhǎng)的作用尚未可知[7,21］。與此同時(shí)，報(bào)道的多數(shù)溶磷微生物，僅有單一溶磷活性，其抑菌效果尚未揭示，在一定程度上制約了其廣泛應(yīng)用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究以篩選兼具有溶磷和抑菌的微生物菌株為研究目的，從百年茶齡茶樹(shù)根際土中，篩選高效溶磷且產(chǎn)氣抑菌的吡咯伯克霍爾德菌WY6-5，分析WY6-5在不同環(huán)境條件下的溶磷作用，驗(yàn)證對(duì)玉米植株生長(zhǎng)作用，檢測(cè)對(duì)不同病原真菌的抑菌效果，并鑒定抑菌功能物質(zhì)，確定其生物學(xué)功能?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】篩選高效溶磷抑菌微生物菌株，確定篩選菌株的分類學(xué)地位，并驗(yàn)證其在溶磷、抑菌和促生長(zhǎng)方面的重要作用，鑒定抑菌代謝物質(zhì)，為多功能微生物菌株的篩選，提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與植物材料

供試細(xì)菌菌株WY6-5，為本試驗(yàn)分離野生菌株，分離于信陽(yáng)市車(chē)云山茶區(qū)，為百年樹(shù)齡茶樹(shù)根際土壤微生物。

供試玉米材料為鯤玉品種。供試真菌菌株有禾谷鐮刀菌、禾谷炭疽菌、鏈格孢菌、稻瘟病菌、煙曲霉菌、黃曲霉菌、黑曲霉菌和灰霉菌。

1.2 供試培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.5 g，MgSO40.3 g，NaCl 0.3 g，Ca3(PO4)28.0 g，葡萄糖 10.0 g，11% MnSO41 mL，1% FeSO41 mL，瓊脂20 g，pH 7.2，去離子水定容至1 L。

有機(jī)磷培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，CaCO35 g，11% MnSO41 mL，1% FeSO41 mL，卵磷脂 0.8 g，酵母膏 0.8 g，瓊脂 20 g，pH 7.0，去離子水定容至1 L。

1.3 溶磷菌株的篩選

取新鮮土壤樣品1 g于2 mL 離心管內(nèi)，加入1 mL無(wú)菌水混勻，梯度稀釋至10-5。取稀釋液100 μL，涂布棒涂布于無(wú)機(jī)磷平板表層，37℃恒溫培養(yǎng)72 h，挑取溶磷圈大、澄清且邊緣整齊的單菌落，于 NA（牛肉膏3 g，蛋白胨 10 g，氯化鈉 5 g，蒸餾水定容至1 L，瓊脂15 g，pH=7.2）平板劃線純化，獲取單菌落。

采用無(wú)機(jī)磷（有機(jī)磷）培養(yǎng)基篩選法，檢測(cè)菌株的溶磷效果，在培養(yǎng)基表面距中心位置1.5 cm處，放置5 mm直徑的無(wú)菌濾紙，中心位置另一端對(duì)稱處打孔器打孔（5 mm直徑），向?yàn)V紙片上和孔洞中分別加入10 μL細(xì)菌菌懸液（OD600=1.8），以接種等量無(wú)菌水的處理做對(duì)照。37℃恒溫培養(yǎng)5 d，當(dāng)兩種接種方法中同時(shí)出現(xiàn)溶磷圈時(shí)，認(rèn)定為溶磷菌。測(cè)定打孔培養(yǎng)法中，溶磷圈直徑與菌落直徑，計(jì)算溶磷率（溶磷圈直徑與菌落直徑比，D/d），篩選高活性菌株。

1.4 菌株 WY6-5 的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將菌株WY6-5劃線培養(yǎng)于NA培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取單菌落進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定[22］采用Tris-HCl（Amresco公司）和EDTA（Amresco公司）法提取基因組DNA，16S rRNA通用引物27 F（AGAGTTTGATCCTGGC TCAG）和 1492 R（AAGGAGGTG ATCCAGCCGCA）擴(kuò)增保守序列。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶，回收純化PCR產(chǎn)物，送武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性分析，歸類為伯克霍爾德菌屬，篩選同屬中同源性高，且已鑒定的模式菌株為參比，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建。CLUSTAL X1.83 進(jìn)行多重序列比對(duì)，MEGA 7軟件 Neighbor joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4.3 生理生化鑒定 將菌株WY6-5在NA培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線活化，12 h后挑取單菌落接種至IF-A GEN III inoculating fluid培養(yǎng)液混合均勻，并轉(zhuǎn)接至Biolog Gen III 培養(yǎng)板中，37℃下培養(yǎng) 10—20 h，BIOLOG MicroStation? System微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生理生化特性分析，與數(shù)據(jù)庫(kù)中已鑒定模式菌株進(jìn)行比對(duì)分析，選取生理生化反應(yīng)相似度最高的種，確定同源菌種。

1.5 液體培養(yǎng)條件菌株 WY6-5 的溶磷效果

將菌株 WY6-5 培養(yǎng)于NB培養(yǎng)液（牛肉膏3 g，蛋白胨 10 g，氯化鈉 5 g，蒸餾水定容至1 L，pH=7.2）中，200 r/min，37℃搖培24 h，離心收集菌體，無(wú)菌水清洗 2 次，按 6%（v/v）比例接種菌液至裝有40 mL無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基的三角瓶中，以接種等量無(wú)菌水的處理為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，所有處理培養(yǎng)于37℃200 r/min。分別于第0、3、6、12、20天取樣，測(cè)定可溶性磷含量，分析菌株溶磷能力。

應(yīng)用 AMS France連續(xù)流動(dòng)分析儀進(jìn)行菌株溶磷能力的測(cè)定。取優(yōu)級(jí)純磷酸二氫鉀粉末4.3871 g，溶解到400 mL dd H2O水中，定容到1 000 mL，配成1 g·L-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。依次稀釋至3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)液，檢測(cè)不同濃度下，可溶性磷峰面積，與對(duì)應(yīng)濃度構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算樣品中可溶性磷含量。

1.6 菌株WY6-5 在土壤中的溶磷效果

供試土壤取自信陽(yáng)市浉河區(qū)車(chē)云山茶廠，地表下5—10 cm深茶樹(shù)根跡土壤，土質(zhì)為黃褐土，有機(jī)質(zhì)含量偏低，呈弱酸性[23］。烘干過(guò) 10目篩，將其分裝成每袋 1.4 kg，121℃下滅菌 30 min，滅菌3次。按 20%（v/w）接種量添加無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)液，按 1%（v/w）接種量接種 WY6-5菌懸液（OD600=1.8），混合均勻；以接種等量無(wú)菌水的處理作為對(duì)照，每個(gè)處理組重復(fù)3次，于室溫下靜置培養(yǎng)。兩組分別培養(yǎng)至第0、3、12、20天時(shí)取樣，采用Olsen法對(duì)所取土樣前處理[24］，使用連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定可溶性磷含量。

1.7 菌株WY6-5 對(duì)玉米生長(zhǎng)的作用

土壤滅菌處理后，自然晾干，分別取1.4 kg，添加于每個(gè)花盆（開(kāi)口直徑19.2 cm，高14.2 cm）中，按照 20%（v/w）接種量添加無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)液，按 1%（v/w）接種量添加WY6-5的菌懸液，以接種等量無(wú)菌水的處理為對(duì)照，混合均勻后播種萌發(fā)的玉米籽粒，每盆播種4粒，每個(gè)處理重復(fù)3次。自然環(huán)境條件下培養(yǎng)27 d后，測(cè)定玉米植株葉長(zhǎng)、葉寬、單葉葉面積、葉片數(shù)、株高、莖粗、鮮重和地上、地下干重等指標(biāo)。

1.8 菌株WY6-5的廣譜抑菌作用分析

采用雙皿（直徑9 cm）對(duì)扣培養(yǎng)法[25］，檢測(cè)菌株WY6-5對(duì)不同病原真菌的抑菌活性。挑選活化的真菌菌絲塊接種于含 PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央。100 μL菌株WY6-5（OD600=1.8）涂布于另一個(gè)含NA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿表面。將接種真菌菌絲塊的培養(yǎng)皿對(duì)扣于涂布WY6-5的培養(yǎng)皿之上，透明膠帶密閉封口。以僅接種真菌菌絲塊的處理作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，所有培養(yǎng)皿于28℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d，統(tǒng)計(jì)真菌菌絲直徑，計(jì)算抑菌率。

抑菌率（%）=（對(duì)照菌絲直徑-處理菌絲直徑）/對(duì)照菌絲直徑×100。

1.9 菌株WY6-5揮發(fā)性代謝物質(zhì)鑒定

將菌株WY6-5接種于100 mL三角瓶中的NA培養(yǎng)基表面，用涂棒涂布均勻，以接種等量無(wú)菌水的NA培養(yǎng)基為對(duì)照，所有接種的三角瓶用雙層塑料薄膜密封，并置于28℃黑暗條件下培養(yǎng)48 h[26］。培養(yǎng)后的三角瓶轉(zhuǎn)移到40℃的水浴鍋中平衡30 min。采用固相微萃取柱（Solid phase micro-extraction，SPME，DVB/CAR/PDMS，30/50 μm）進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)的富集，將SPME的金屬針插入塑料薄膜下，推出內(nèi)部的富集針，使富集針處于樣品瓶中部正上空位置，吸附微生物產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)，30 min后，將富集針收回金屬針內(nèi)，并轉(zhuǎn)入氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS/MS）進(jìn)樣口，手動(dòng)進(jìn)樣進(jìn)行檢測(cè)。

GC-MS/MS檢測(cè)過(guò)程中，進(jìn)樣口溫度250℃；離子源為EI源，溫度為230℃，轟擊能量為70 eV，四極桿溫度 150℃，采用不分流進(jìn)樣，全掃描的模式進(jìn)行檢測(cè)。載氣為氦氣，柱流速1 mL·min-1。氣相色譜采用程序升溫：起始溫度60℃，保持2 min；以5℃·min-1的速度升溫至150℃，保持2 min；以10℃·min-1速率升至280℃，保持2 min。檢出所有物質(zhì)進(jìn)行譜庫(kù)檢索National Institute of Standards and Technology（NIST 17）。每個(gè)處理檢測(cè)兩次，兩次重復(fù)中微生物組均出現(xiàn)，且對(duì)照組中未檢出的物質(zhì)，確定為WY6-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為3次重復(fù)數(shù)據(jù)取平均值，采用獨(dú)立性T檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤，計(jì)算顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 高效溶磷微生物的篩選

采用稀釋涂平板法，將稀釋液涂布于無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)平板表面，培養(yǎng)3 d后，篩選可形成溶磷圈的微生物菌株。本研究中，共計(jì)獲得 11個(gè)溶磷細(xì)菌，其中 3株細(xì)菌兼具有降解難溶性無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷的生物學(xué)功能。溶磷活性分析表明，菌株 WY6-5溶磷效果最好，明顯優(yōu)于其他菌株，對(duì)難溶性無(wú)機(jī)磷的溶解直徑為2.3 cm，溶磷率D/d值高達(dá)4.6；對(duì)難溶性有機(jī)磷溶解直徑 3.6 cm，溶磷率 D/d值為7.2（圖 1）。因此本試驗(yàn)中以 WY6-5為優(yōu)勢(shì)生物菌株，進(jìn)行后續(xù)溶磷作用分析。

2.2 菌株 WY6-5的鑒定

細(xì)菌WY6-5于NA培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，菌落呈乳白色，不透明，邊緣規(guī)則，表面光滑濕潤(rùn)。16S rRNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株WY6-5為伯克霍爾德菌屬，且與模式菌株[27］Burkholderia pyrrociniaCIP 105874和Burkholderia stabilisCIP 106845的親緣性最高，遺傳距離相對(duì)最近，三者聚為一個(gè)分支，將菌株 WY6-5初步鑒定為Burkholderia pyrrocinia/ stabilis（圖2）。

對(duì)菌株 WY6-5進(jìn)行生理生化分析表明，菌株WY6-5與BIOLOG MicroStation? System數(shù)據(jù)庫(kù)中的洋蔥/吡咯伯克霍爾德氏菌種（Burkholderia cepacia/pyrrocinia）具有相似生理生化特性?？衫忙?D-葡糖、D-山梨醇、D-果糖、D-天冬氨酸等 24種碳、氮源，對(duì)1%的氯化鈉具有耐受性，4%的氯化鈉不具有耐受性，耐pH 5酸性條件，對(duì)萬(wàn)古霉素、林肯霉素等多種抗生素和化學(xué)物質(zhì)具有抗性（表1）。

綜上所述，結(jié)合表型觀察、生理生化試驗(yàn)、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，菌株WY6-5與吡咯伯克霍爾德菌在分子水平和生理生化水平均具有高度同源性，故將其鑒定為吡咯伯克霍爾德菌。

圖1 菌株WY6-5對(duì)難溶性無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷的溶解效果Fig. 1 P-solubilizing activity of strain WY6-5 in the medium containing insoluble organic/inorganic phosphorus

圖2 菌株WY6-5及其近緣種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig. 2 Phylogenetic tree analysis of strain WY6-5 and other homologous strains based on 16S rRNA sequences

表1 菌株WY6-5的生化活性鑒定Table 1 Biochemical analysis of strain WY6-5

2.3 菌株 WY6-5 的溶磷效果分析

吡咯伯克霍爾德菌 WY6-5在培養(yǎng)基中具有高效的溶磷活性，為進(jìn)一步分析其在不同環(huán)境下的溶磷效果，進(jìn)行液體搖培和土壤溶磷試驗(yàn)。搖培試驗(yàn)表明，菌株WY6-5在液體環(huán)境下具有較好的溶磷活性，能顯著提高可溶性磷含量。整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，對(duì)照組中磷含量未發(fā)生明顯變化，WY6-5添加組，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性磷含量呈線性梯度增多，培養(yǎng)至第6天時(shí)，磷含量達(dá)到 181.0 mg·L-1，第 20 天達(dá)到 520.4 mg·L-1，為對(duì)照組的176倍（圖3-A）。

菌株 WY6-5在土壤中同樣具有溶磷活性（圖3-B），與對(duì)照組相比，培養(yǎng)20 d內(nèi)，WY6-5添加組的磷含量均高于對(duì)照組，尤其在培養(yǎng)3—12 d內(nèi)，有效磷含量明顯高于對(duì)照組。但由于土壤組成復(fù)雜，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤有效磷含量逐漸降低。

2.4 菌株WY6-5 對(duì)盆栽玉米的促生長(zhǎng)作用

盆栽試驗(yàn)表明，吡咯伯克霍爾德菌WY6-5在土壤中具有較好的促生長(zhǎng)活性，可以明顯促進(jìn)苗期玉米的生長(zhǎng)。培養(yǎng)27 d后觀察，菌株WY6-5添加組玉米長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于對(duì)照組（圖4），在葉長(zhǎng)、葉寬、單葉葉面積、葉片數(shù)、莖粗、株高、鮮重和地上部干重等相應(yīng)指標(biāo)顯著高于對(duì)照組，且與對(duì)照組相比，增長(zhǎng)量分別達(dá)21.7%、21.1%、47.8%、8.0%、24.6%、13.0%、23.5%和49.5%（表2），表明菌株WY6-5施用于土壤后，能改善土壤營(yíng)養(yǎng)狀況，促進(jìn)作物生長(zhǎng)。

2.5 菌株WY6-5的抑菌作用與代謝產(chǎn)物鑒定

采用雙皿對(duì)扣培養(yǎng)法，檢測(cè)WY6-5抑菌效果。結(jié)果表明，WY6-5通過(guò)產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，抑制病原真菌的生長(zhǎng)（圖5）。培養(yǎng)5 d后觀察，對(duì)照組真菌菌絲生長(zhǎng)迅速，WY6-5處理組，真菌菌絲生長(zhǎng)受抑制，抑菌率均高于70%，其中對(duì)稻瘟菌和禾谷鐮刀菌抑菌率分別達(dá)到 86.3%和 92.6%，對(duì)煙曲霉菌、黃曲霉菌、灰霉菌和黑曲霉菌的抑菌效果最顯著，抑制率達(dá)100%。菌株WY6-5產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)具有較好的抑菌效果，對(duì)多種病原真菌具有高效廣譜的抑菌作用。

圖3 菌株 WY 6-5 對(duì)培養(yǎng)液和土壤中的溶磷效果分析Fig. 3 P-solubilizing activity of the strain WY 6-5 in water and soil

表2 菌株WY6-5對(duì)苗期玉米生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of strain WY6-5 on the growth of maize seedling

2.6 揮發(fā)性代謝物質(zhì)鑒定

運(yùn)用GC-MS/MS檢測(cè)菌株WY6-5產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體，結(jié)果顯示，菌株WY6-5產(chǎn)生一種高豐度的揮發(fā)性物質(zhì)，保留時(shí)間為2.7 min，與色譜峰總面積相比，相對(duì)豐度達(dá)99%以上。經(jīng)NIST譜庫(kù)檢索比對(duì)，將該物質(zhì)鑒定為二甲基二硫（dimethyl disulfide, DMDS）（圖6）。

3 討論

在我國(guó)，土壤中有效磷含量相對(duì)不足，礦質(zhì)化嚴(yán)重，難以滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求[28］。溶磷菌在土壤中分布廣泛，能通過(guò)酸化、螯合以及交換等反應(yīng)機(jī)制，將無(wú)效磷轉(zhuǎn)化為植物可利用的有效磷[29］，提升磷肥利用率，是目前解決磷肥短缺問(wèn)題的重要手段之一。本研究從茶樹(shù)根際土壤中篩選到一株具有高效溶磷作用的微生物菌株WY6-5，通過(guò)菌體表型特征、生理生化檢測(cè)和16S rRNA序列比對(duì)分析，將菌株 WY6-5 鑒定為吡咯伯克霍爾德菌（B. pyrrocinia）。該菌株不僅可以溶解難溶性的磷酸鈣，還可溶解有機(jī)態(tài)的卵磷脂，培養(yǎng)皿培養(yǎng)中，呈現(xiàn)面積大、邊緣整齊、透明度高的溶磷圈，具有高效的溶磷活性。

溶磷微生物不僅在固體培養(yǎng)基中具有溶磷作用，在液體培養(yǎng)條件下，也具有較好的溶磷活性，如張?jiān)葡嫉萚30］報(bào)道的枯草芽孢桿菌JT-1，液體搖培條件下，解磷量最高達(dá)到386.3 mg·L-1，余賢美等[31］篩選到一株洋蔥伯克霍爾德菌PSB3，液體培養(yǎng)后，上清液中含磷量最高達(dá) 218.6 μg·mL-1，戴沈艷等[32］獲得的解磷菌，培養(yǎng)后溶磷量可達(dá) 240.1 mg·L-1。與上述溶磷菌株相比，本研究篩選的菌株WY6-5，在液體環(huán)境中具有更好的溶磷效果，培養(yǎng)20 d內(nèi)，磷含量呈直線增長(zhǎng)，最高達(dá)520.4 mg·L-1，達(dá)對(duì)照組的176倍，溶磷活性顯著高于現(xiàn)階段報(bào)道的其他菌株。除此之外，菌株WY6-5在土壤中也具有較好的溶磷活性，整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，WY6-5添加組可溶性磷含量均高于對(duì)照組；但隨時(shí)間的延長(zhǎng)，溶磷菌添加組和對(duì)照組中可溶性磷含量均呈降低趨勢(shì)，該變化趨勢(shì)與張愛(ài)民[33］和王琰[34］等報(bào)道的研究結(jié)果相似，主要原因?yàn)橥寥澜M成成分復(fù)雜，受金屬離子、生物酶、微生物等因素影響，溶解后的可溶性磷再次被固定，導(dǎo)致含量降低；同時(shí)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，有害物質(zhì)積累，WY6-5活性減弱，是可能導(dǎo)致磷含量降低的另一誘因。土壤中微生物的高效溶磷活性，是多種因素共同作用的結(jié)果，揭示各因素間的相互關(guān)系，是后期研究的重點(diǎn)。

圖4 菌株WY6-5對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的影響Fig. 4 Effect of strain WY6-5 on the growth of maize seedlings

圖5 菌株WY6-5對(duì)各種病原真菌的抑制作用Fig. 5 Inhibitory effect of strain WY6-5 against the growth of different fungal pathogens

圖6 菌株WY6-5產(chǎn)揮發(fā)性氣體物質(zhì)的GC-MS/MS檢測(cè)Fig. 6 Identification of volatiles from strain WY6-5 through GC-MS/MS

伯克霍爾德菌是一種重要的微生物資源，在土壤中分布廣泛，對(duì)小麥、玉米、甘蔗、草莓等多種植物的生長(zhǎng)有重要作用[35-38］。該菌株不僅可以通過(guò)固氮、溶磷和分泌植物激素等作用促進(jìn)植物生長(zhǎng)[39］，同時(shí)還可產(chǎn)生硝吡咯菌素、吩嗪、cepaciamide A、cepabactin、cepacidine A等多種抑菌產(chǎn)物，抑制土傳病害的侵染[40］，部分物質(zhì)已開(kāi)發(fā)為生物農(nóng)藥，用于防治小麥紋枯病、番茄根結(jié)線蟲(chóng)病等多種田間病害[41-43］。但上述物質(zhì)分子量大，分散速度慢，使用過(guò)程中，接觸病原菌后方可發(fā)揮抑制作用，在一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用。與其相比，小分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易揮發(fā)，分散迅速，可遠(yuǎn)距離發(fā)揮作用，且不易產(chǎn)生殘留，對(duì)不同分布條件下的病原菌均可抑制，不僅可以防治土壤病害，對(duì)于儲(chǔ)藏期病害同樣有效[26］。本研究首次證明，溶磷吡咯伯克霍爾德菌 WY6-5，可產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌物質(zhì)二甲基二硫，具有廣譜抑菌作用，能高效抑制灰霉屬、炭疽菌屬、鐮刀菌屬、曲霉菌屬等 8種病原真菌的生長(zhǎng)，為潛在的高效抑菌生物制劑。且該物質(zhì)生物安全性較好，在多種生物中均有發(fā)現(xiàn)，如芽孢桿菌、假單胞菌、沙雷氏菌等[44-46］微生物，以及白芥和韭蔥[47-48］等植物中。該物質(zhì)易于分散，具有較好的抑菌活性，可抑制根結(jié)線蟲(chóng)、立枯似核菌、大麗輪枝菌、尖孢鐮刀菌等多種土傳病害[49］。同時(shí)，該物質(zhì)還具有誘導(dǎo)寄主植物抗性，促進(jìn)植物生長(zhǎng)等重要作用[44,50］，為潛在的高活性多功能生物菌劑。

伯克霍爾德菌具有較好的生物活性，以其為原料制成的生物農(nóng)藥，在部分國(guó)家中已得到應(yīng)用。但與此同時(shí)，該菌被認(rèn)定為條件性致病菌，可引起人類和植物病害，一定程度上制約了其廣泛應(yīng)用。因此，筆者建議，在針對(duì)WY6-5及其同屬菌的應(yīng)用時(shí)，應(yīng)特別謹(jǐn)慎，首先做到（1）生物安全性分析，分析其對(duì)不同生物的影響，嚴(yán)格采用對(duì)人類無(wú)毒菌株進(jìn)行應(yīng)用研究；（2）環(huán)境安全性評(píng)價(jià)，分析菌株不同劑量施用后對(duì)環(huán)境微生物群落、非靶標(biāo)生物及生態(tài)的影響，確定其環(huán)境安全作用；（3）作用機(jī)制分析，鑒定功能活性物質(zhì)，在無(wú)法確定菌株（1）與（2）中的安全性時(shí)，可嘗試代謝物質(zhì)應(yīng)用研究，以及功能基因的克隆和轉(zhuǎn)化工程菌株，利用的拮抗物質(zhì)進(jìn)行植物病害生防是國(guó)際上認(rèn)同的觀點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究創(chuàng)新性指出，吡咯伯克霍爾德菌WY6-5，可高效降解難溶性無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷，并提升液體和土壤中可溶性磷含量，促進(jìn)植物生長(zhǎng)；與此同時(shí)，該菌株可產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)二甲基二硫，具有高效廣譜的抑菌作用，以及潛在的促進(jìn)植物生長(zhǎng)活性，為抑菌性生物肥料的制備，提供潛在的生物活性材料。

致謝：感謝信陽(yáng)師范學(xué)院“南湖學(xué)者獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃”青年項(xiàng)目，農(nóng)業(yè)部華中作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)作物重大病蟲(chóng)草害防控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金課題（2018ZTSJJ2），信陽(yáng)師范學(xué)院分析測(cè)試中心對(duì)本項(xiàng)目的資助。