不同Bt蛋白對(duì)捕食性天敵大草蛉的生態(tài)安全性評(píng)價(jià)

趙曼，湯金榮，牛琳琳，陳琳，梁革梅

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，鄭州 450002）

0 引言

【研究意義】目前商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物中表達(dá)的多為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）蛋白，對(duì)鱗翅目（Lepidoptera）、鞘翅目（Coleoptera）或雙翅目（Diptera）等一些重要農(nóng)林害蟲(chóng)具有顯著毒殺作用[1-2］。雖然轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的種植有效地控制了靶標(biāo)害蟲(chóng)的發(fā)生危害，減少了廣譜性化學(xué)殺蟲(chóng)劑的使用，但其對(duì)非靶標(biāo)生物（尤其是捕食性天敵和寄生性天敵）的潛在影響也一直被大家所關(guān)注[3］。大草蛉（Chrysopa pallens）是我國(guó)農(nóng)田廣泛分布的一種重要捕食性天敵，主要以蚜蟲(chóng)、粉虱、鱗翅目昆蟲(chóng)卵及低齡幼蟲(chóng)等為獵物，在害蟲(chóng)生物防治方面具有非常重要的生態(tài)學(xué)價(jià)值，其幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)皆可捕食，且食性廣、食量大，加上成蟲(chóng)具有取食植物花粉和花蜜的習(xí)性，因此在轉(zhuǎn)基因作物田能通過(guò)取食植物花粉、花蜜或捕食 Bt蛋白靶標(biāo)昆蟲(chóng)而直接或間接地接觸到抗蟲(chóng)植物中表達(dá)的 Bt蛋白[4-5］。研究轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物中廣泛表達(dá)的Bt蛋白對(duì)大草蛉的生態(tài)安全性，對(duì)目前及未來(lái)新型轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物在我國(guó)的科學(xué)推廣應(yīng)用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】任何一種轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物在任何一個(gè)國(guó)家或地區(qū)商業(yè)化推廣應(yīng)用前，都需要針對(duì)當(dāng)?shù)鼐哂兄匾鷳B(tài)功能且在田間可能接觸到 Bt蛋白的非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物，建立嚴(yán)格的生態(tài)安全性評(píng)價(jià)體系來(lái)研究抗蟲(chóng)作物中表達(dá)的殺蟲(chóng)物質(zhì)對(duì)這些重要非靶標(biāo)生物的潛在影響[6-7］。之前關(guān)于Bt作物或Bt蛋白對(duì)捕食性天敵瓢蟲(chóng)或草蛉潛在影響的研究結(jié)果差異較大，有些報(bào)道認(rèn)為，Bt作物對(duì)捕食性自然天敵是安全的，另一些研究則認(rèn)為 Bt作物對(duì)天敵昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育具有不利影響，然而進(jìn)一步分析造成不利影響的原因，發(fā)現(xiàn)天敵昆蟲(chóng)通常通過(guò)取食對(duì) Bt蛋白敏感的獵物而接觸到Bt蛋白，Bt蛋白影響靶標(biāo)獵物的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量，從而進(jìn)一步影響天敵昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育[8-11］。因此，在研究Bt蛋白或轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物對(duì)非靶標(biāo)生物的生態(tài)安全性時(shí)，為了避免獵物營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量而導(dǎo)致的假陽(yáng)性評(píng)價(jià)結(jié)果，可以利用直接試驗(yàn)體系通過(guò)在天敵昆蟲(chóng)食物源中加入高劑量Bt蛋白來(lái)評(píng)價(jià)Bt蛋白對(duì)捕食性天敵生長(zhǎng)發(fā)育的直接影響，比如可以利用一些瓢蟲(chóng)或草蛉成蟲(chóng)具有取食植物花粉的習(xí)性，在植物花粉中混入 Bt蛋白，或在天敵昆蟲(chóng)人工飼料中加入Bt蛋白的方法來(lái)研究取食Bt蛋白對(duì)捕食性天敵生長(zhǎng)發(fā)育的直接影響[12-14］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管之前有一些研究報(bào)道了Bt作物或Bt蛋白對(duì)北歐草蛉（Chrysoperla carnea）和中華草蛉（Chrysoperla sinica）等草蛉類(lèi)昆蟲(chóng)的直接或間接影響，但關(guān)于Bt蛋白對(duì)我國(guó)棉田重要捕食性天敵大草蛉是否有不利影響尚未見(jiàn)系統(tǒng)的報(bào)道[15-16］。目前我國(guó)推廣應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉仍然為第一代抗蟲(chóng)棉，只表達(dá)一種Bt蛋白，即Cry1Ac蛋白。殺蟲(chóng)譜更廣、可以延緩靶標(biāo)害蟲(chóng)抗性發(fā)展的能夠同時(shí)表達(dá)兩種 Bt蛋白的二代抗蟲(chóng)棉已在美國(guó)、澳大利亞等多個(gè)國(guó)家商業(yè)化推廣種植[17］。未來(lái)能夠同時(shí)表達(dá)兩種或多種Bt蛋白的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉在我國(guó)可能也會(huì)商業(yè)化推廣種植，因此，本研究通過(guò)建立合適的生物測(cè)定體系，綜合評(píng)價(jià)目前轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉中廣泛表達(dá)的幾種 Bt蛋白對(duì)大草蛉的生態(tài)安全性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】建立Bt蛋白對(duì)大草蛉的安全性評(píng)價(jià)體系，明確目前轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉中廣泛表達(dá)的Bt蛋白對(duì)大草蛉的生態(tài)安全性，為未來(lái)在我國(guó)可能商業(yè)化推廣應(yīng)用的二代轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的生態(tài)安全性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2017年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 供試材料

供試大草蛉采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院河北廊坊基地，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)以蠶豆蚜（Aphis craccivora）作為獵物進(jìn)行繼代飼養(yǎng)，蠶豆蚜以室內(nèi)培養(yǎng)的鮮嫩蠶豆苗作為寄主植物；棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）敏感品系（96S）是在室內(nèi)用人工飼料飼養(yǎng)多代的敏感昆蟲(chóng)，未接觸任何殺蟲(chóng)劑，飼養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[18］。飼養(yǎng)環(huán)境條件為溫度（27±1）℃，相對(duì)濕度（75±5）%，光周期14 h∶10 h（L∶D）。

陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)砷酸二氫鉀 PA（KH2AsO4）購(gòu)自Sigma-Aldrich，使用前儲(chǔ)存于-20℃冰箱；供試 Bt蛋白Cry1Ac和Cry1F購(gòu)自Envirologix，Cry2Ab蛋白來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物技術(shù)組，使用前均保存在-80℃超低溫冰箱備用。

1.2 供試Bt蛋白對(duì)大草蛉的生物學(xué)影響

PA對(duì)多種草蛉生長(zhǎng)發(fā)育均具有胃毒作用，因此常被用作測(cè)定有毒物質(zhì)對(duì)草蛉生長(zhǎng)發(fā)育潛在影響的陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)[13］。本研究以添加PA的大草蛉人工飼料[19］作為陽(yáng)性對(duì)照處理，通過(guò)在大草蛉人工飼料中添加不同Bt蛋白來(lái)研究供試3種Bt蛋白單獨(dú)作用或混合作用下對(duì)大草蛉生命表參數(shù)的影響。具體步驟：在準(zhǔn)備的新鮮大草蛉人工飼料中添加一定量單獨(dú)或混合的Bt蛋白，使蛋白在飼料中的最終濃度為500 μg·g-1FW（每克飼料鮮重），充分混勻后，參照王英麗等[20］所述方法將飼料加工成飼料囊，提供給初孵大草蛉幼蟲(chóng)。試驗(yàn)設(shè)置處理包括：（1）大草蛉純?nèi)斯わ暳希瞻讓?duì)照）；（2）Cry1Ac處理（飼料中 Cry1Ac濃度 500 μg·g-1FW）；（3）Cry1F 處理（飼料中 Cry1F 濃度 500 μg·g-1FW）；（4）Cry2Ab 處理（飼料中Cry2Ab濃度500μg·g-1FW）；（5）Cry1Ac和 Cry1F 蛋白混合處理（飼料中 Cry1Ac和 Cry1F 濃度均為 500 μg·g-1FW）；（6）Cry1Ac和Cry2Ab蛋白混合處理（飼料中Cry1Ac和Cry2Ab濃度均為500 μg·g-1FW）；（7）PA處理（飼料中PA濃度為30 μg·g-1FW）。將初孵大草蛉幼蟲(chóng)（＜12 h）單頭放置于大小為9.0 cm×1.5 cm的塑料培養(yǎng)皿中，第1天提供給大草蛉的食物為各處理人工飼料，第2天提供給大草蛉的食物為各處理人工飼料加蠶豆蚜（培養(yǎng)皿中同時(shí)提供飼料囊和剪成2 cm覆滿(mǎn)蠶豆蚜的蠶豆苗），之后照此方法重復(fù)交替提供給測(cè)試大草蛉。此外，培養(yǎng)皿中還放置一個(gè)濕潤(rùn)的脫脂棉球作為大草蛉水源。每個(gè)處理重復(fù) 4次，每個(gè)重復(fù)包含 25頭大草蛉幼蟲(chóng)，提供給大草蛉的各處理人工飼料囊每2 d更換一次。每日定時(shí)調(diào)查大草蛉幼蟲(chóng)存活及蛻皮情況，并稱(chēng)量4齡幼蟲(chóng)和蛹的體重。待成蟲(chóng)從蛹中羽化后，對(duì)大草蛉成蟲(chóng)進(jìn)行性別鑒定并稱(chēng)量雌、雄蟲(chóng)體重。之后將同一處理的雌、雄蟲(chóng)隨機(jī)配對(duì)，每對(duì)單獨(dú)飼養(yǎng)，人工飼料和蠶豆蚜的供給方法與幼蟲(chóng)期相同。飼養(yǎng)成蟲(chóng)的塑料培養(yǎng)皿中每日放入一段疊加的濾紙條（1 cm×5 cm）作為雌蟲(chóng)產(chǎn)卵介質(zhì)，每天除調(diào)查雌、雄蟲(chóng)存活情況外，還要記錄雌蟲(chóng)產(chǎn)卵情況，成蟲(chóng)期試驗(yàn)持續(xù)20 d（因大草蛉成蟲(chóng)壽命長(zhǎng)且產(chǎn)卵期較為分散，因此該生物學(xué)試驗(yàn)在成蟲(chóng)期僅記錄含產(chǎn)卵高峰在內(nèi)的前20 d）。

1.3 大草蛉體內(nèi)Bt蛋白含量檢測(cè)

將另外一組大草蛉幼蟲(chóng)，按照1.2所述人工飼料和蠶豆蚜混合交替飼養(yǎng)的方法，飼養(yǎng)在處理（1）至處理（6）的人工飼料上。飼養(yǎng)過(guò)程中，人工飼料和蠶豆蚜供給大草蛉的方式同1.2。在大草蛉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，收集不同處理中不同時(shí)期的大草蛉（4齡幼蟲(chóng)、蛹和羽化4 d后成蟲(chóng)）的樣品，用于測(cè)定大草蛉體內(nèi)不同Bt蛋白的含量。每個(gè)處理每個(gè)時(shí)期的大草蛉收集3個(gè)樣品，每個(gè)樣品包含5頭大草蛉。不同樣品中大草蛉體內(nèi)Bt蛋白濃度檢測(cè)方法為雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（double-antibody sandwich enzyme-link immunosorbent assay，DAS-ELISA），具體測(cè)定方法參照各Cry蛋白定量測(cè)定試劑盒（Envirologix）說(shuō)明書(shū)。

1.4 Bt蛋白穩(wěn)定性和生物活性檢測(cè)

為了明確不同處理飼料中混入 Bt蛋白的穩(wěn)定性和生物活性，分別取新鮮準(zhǔn)備的和在試驗(yàn)環(huán)境條件下暴露2 d的不同Cry蛋白處理飼料，每種處理飼料包含3次重復(fù)，其穩(wěn)定性利用ELISA法來(lái)測(cè)定，具體方法同1.3；生物活性測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[21］，用敏感棉鈴蟲(chóng)品系（96S）進(jìn)行測(cè)定。

1.5 取食Bt蛋白對(duì)大草蛉消化酶、解毒酶和保護(hù)酶活性的影響

大草蛉取食3種不同Bt蛋白處理飼料后，測(cè)定其體內(nèi)主要代謝酶系（消化酶、解毒酶和保護(hù)酶）的活性水平。測(cè)定的消化酶包括總蛋白酶（T-pro）、類(lèi)胰蛋白酶（TPS）、類(lèi)凝乳蛋白酶（CTP）和氨肽酶（AP）；解毒酶包括α-乙酸萘酯酯酶（α-NAE）、羧酸酯酶（CES）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、乙酰膽堿酯酶（AChE）、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）；測(cè)定的保護(hù)酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）。大草蛉樣品收集方法同1.3，除收集取食空白對(duì)照飼料和Bt處理飼料的大草蛉樣品，還需收集取食PA處理飼料的大草蛉各時(shí)期樣品。具體測(cè)定方法參照酶活測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)（北京路遠(yuǎn)生物科技公司和南京建成生物研究所）。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件完成，不同處理間大草蛉的幼蟲(chóng)發(fā)育歷期、蛹重和成蟲(chóng)體重等生命表參數(shù)以及酶活性在SPSS軟件中進(jìn)行單因素方差分析后，再利用Dunnett's test進(jìn)行不同處理間的差異性比較，其中化蛹率和羽化率需轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；大草蛉人工飼料中Bt蛋白的穩(wěn)定性和生物活性采用Student's test進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 取食Bt蛋白對(duì)大草蛉生長(zhǎng)發(fā)育的影響

與對(duì)照純?nèi)斯わ暳舷啾龋∈矪t蛋白處理飼料對(duì)大草蛉4齡幼蟲(chóng)體重、幼蟲(chóng)發(fā)育歷期、化蛹率、蛹重、蛹發(fā)育歷期、羽化率、成蟲(chóng)體重和單雌總產(chǎn)卵量無(wú)顯著性影響（P＞0.05）；但取食PA處理飼料卻能夠使大草蛉幼蟲(chóng)和蛹發(fā)育歷期極顯著延長(zhǎng)，其他各測(cè)定生長(zhǎng)發(fā)育參數(shù)則極顯著降低（P＜0.01）（表1）。

2.2 大草蛉體內(nèi)Bt蛋白含量檢測(cè)

在取食對(duì)照純?nèi)斯わ暳系拇蟛蒡润w內(nèi)（幼蟲(chóng)、蛹及成蟲(chóng)）未檢測(cè)到Bt蛋白；在取食不同Bt蛋白處理飼料的大草蛉幼蟲(chóng)及成蟲(chóng)體內(nèi)均檢測(cè)到了一定量的Bt蛋白，蛹內(nèi)也檢測(cè)到了少量的Bt蛋白，說(shuō)明本研究生測(cè)體系所用的大草蛉人工飼料能夠?qū)⒒烊腼暳现械倪@3種Bt蛋白有效地傳遞給大草蛉（表2）。

2.3 大草蛉人工飼料中 Bt蛋白穩(wěn)定性和生物活性檢測(cè)

在新鮮和暴露2 d的大草蛉對(duì)照飼料中，未檢測(cè)到Bt蛋白；而B(niǎo)t蛋白處理的飼料，在試驗(yàn)環(huán)境條件下暴露 2 d后，飼料中的 Cry1Ac濃度顯著降低（P=0.04），Cry1F和 Cry2Ab濃度降低不顯著（Cry1F：P=0.19；Cry2Ab：P=0.20）（圖 1-A）。敏感昆蟲(chóng)生測(cè)結(jié)果表明（圖1-B），新鮮和在試驗(yàn)環(huán)境條件下暴露2 d的Bt蛋白處理大草蛉人工飼料的提取液加入棉鈴蟲(chóng)飼料后飼喂敏感棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)，兩者死亡率差異不顯著（P＞0.05），但均極顯著高于無(wú)添加的棉鈴蟲(chóng)人工飼料飼養(yǎng)的敏感棉鈴蟲(chóng)的死亡率（P＜0.01）。

2.4 大草蛉取食Bt蛋白后體內(nèi)主要消化酶、解毒酶和保護(hù)酶活性

由圖2可知，空白對(duì)照組和Bt蛋白處理組間的大草蛉幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)體內(nèi) 4種消化酶活性無(wú)顯著差異（P＞0.05），但陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)（PA）處理組的大草蛉氨肽酶活性極顯著低于空白對(duì)照組，其他3種消化酶的活性則顯著或極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）。取食純?nèi)斯わ暳虾腿∈?Bt蛋白處理飼料的大草蛉各解毒酶和保護(hù)酶活性差異也不顯著（P＞0.05），但取食 PA處理飼料的大草蛉體內(nèi)主要解毒酶和保護(hù)酶活性顯著或極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）（圖3—圖5）。

表1 大草蛉取食純?nèi)斯わ暳?、含有Bt蛋白或PA的人工飼料的生命表參數(shù)Table 1 Life-table parameters of C. pallens fed on pure artificial diet or artificial diet containing different Bt proteins or PA

表2 大草蛉體內(nèi)Bt蛋白濃度Table 2 Bt protein concentration in C. pallens

圖1 新鮮飼料和暴露2 d的飼料中Bt蛋白濃度和生物活性Fig. 1 Concentration and bioactivity of Bt proteins in the artificial diets that were freshly prepared or had been exposed to C.pallens for 2 d

圖2 取食不同飼料的大草蛉體內(nèi)消化酶活性Fig. 2 Digestive enzyme activity of C. pallens fed on different diets

圖3 取食不同飼料的大草蛉4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)解毒酶活性Fig. 3 Detoxifying enzyme activity of C. pallens 4th instar larvae fed on different diets

3 討論

草蛉作為我國(guó)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中常見(jiàn)的雜食性捕食天敵，其幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)均能捕食害蟲(chóng)，且食性廣、食量大，是一種具有重要生態(tài)功能的天敵昆蟲(chóng)。草蛉成蟲(chóng)具有補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)的習(xí)性，在作物開(kāi)花期或捕食獵物對(duì)象種群數(shù)量不足的情況下，還可取食農(nóng)田作物花粉，因此在轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物田，可以通過(guò)捕食Bt蛋白靶標(biāo)害蟲(chóng)或取食轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物的花粉而直接或間接地暴露于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物表達(dá)的Bt蛋白[22］。因此，常把草蛉這類(lèi)捕食性自然天敵作為轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物環(huán)境安全性評(píng)價(jià)中對(duì)其非靶標(biāo)生物生態(tài)安全性評(píng)價(jià)的重要指示性物種[7,13］。

圖4 取食不同飼料的大草蛉成蟲(chóng)體內(nèi)解毒酶活性Fig. 4 Detoxifying enzyme activity of C. pallens adults fed on different diets

在轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物對(duì)其非靶標(biāo)生物的安全性評(píng)價(jià)中，一般采用從實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（lower-tier）到半田間試驗(yàn)（middle-tier），再到田間試驗(yàn)（higher-tier）的分層次評(píng)價(jià)系統(tǒng)，根據(jù)前一評(píng)價(jià)階段的評(píng)價(jià)結(jié)果來(lái)決定是否終止評(píng)價(jià)或進(jìn)入下一評(píng)價(jià)階段。實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)作為轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物對(duì)其非靶標(biāo)生物生態(tài)安全性評(píng)價(jià)的第一步，一般是在實(shí)驗(yàn)室理想可控環(huán)境條件下，通過(guò)將選擇的非靶標(biāo)生物暴露于高濃度殺蟲(chóng)化合物下，來(lái)研究受試物種對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物中表達(dá)殺蟲(chóng)蛋白的敏感性。試驗(yàn)中所用殺蟲(chóng)蛋白的濃度至少為其在田間環(huán)境中可能接觸量的10倍，甚至100倍以上。在實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)中，一般利用人工飼料試驗(yàn)（Tier-1），通過(guò)將高劑量殺蟲(chóng)蛋白混入到評(píng)價(jià)生物的合適人工飼料中，來(lái)研究殺蟲(chóng)蛋白對(duì)供試生物的直接毒性[19,23］。但 Tier-1生測(cè)體系的建立需要滿(mǎn)足3個(gè)條件：（1）合適的殺蟲(chóng)蛋白載體，一般指待測(cè)生物的人工飼料，該飼料既能夠滿(mǎn)足供試生物正常的生長(zhǎng)發(fā)育，又能將殺蟲(chóng)化合物傳遞給供試生物（待評(píng)價(jià)昆蟲(chóng)在該人工飼料上的幼蟲(chóng)存活率≥80%）；（2）選擇一種與待評(píng)價(jià)殺蟲(chóng)物質(zhì)作用方式相同的殺蟲(chóng)化合物，作為轉(zhuǎn)基因植物對(duì)非靶標(biāo)生物生態(tài)安全性評(píng)價(jià)生測(cè)體系中的陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)，用于驗(yàn)證所建立的Tier-1生測(cè)體系是否能夠檢測(cè)到殺蟲(chóng)化合物對(duì)受試非靶標(biāo)生物的不利影響；（3）尋找一種能夠有效檢測(cè)殺蟲(chóng)物質(zhì)在生測(cè)試驗(yàn)過(guò)程中穩(wěn)定性和生物活性的方法，以便于評(píng)估供試生物暴露于殺蟲(chóng)化合物的實(shí)際程度[24］。

圖5 取食不同飼料的大草蛉體內(nèi)保護(hù)酶活性Fig. 5 Antioxidant enzyme activity of C. pallens fed on different diets

單純的人工飼料飼喂難以使大草蛉幼蟲(chóng)存活率達(dá)到80%[25］，因此本試驗(yàn)采用人工飼料和蠶豆蚜交替混合飼喂的方式來(lái)飼養(yǎng)大草蛉，結(jié)果表明大草蛉在該飼養(yǎng)體系上能夠完成正常的生長(zhǎng)發(fā)育，且幼蟲(chóng)存活率＞80%，滿(mǎn)足Tier-1生測(cè)體系建立的基本要求。LI等[13］研究表明，砷酸二氫鉀（PA）對(duì)多種草蛉均具有胃毒作用，因此常被用作測(cè)定Bt蛋白對(duì)草蛉潛在毒性生測(cè)試驗(yàn)體系中的陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)。本研究也利用 PA作為評(píng)價(jià)供試 Bt蛋白對(duì)大草蛉生長(zhǎng)發(fā)育直接影響的陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)，結(jié)果顯示飼料中添加 PA能夠顯著抑制大草蛉生長(zhǎng)發(fā)育，說(shuō)明試驗(yàn)所用Tier-1生測(cè)體系能夠檢測(cè)到對(duì)照殺蟲(chóng)物質(zhì)對(duì)大草蛉的負(fù)面影響，而該體系的評(píng)價(jià)結(jié)果表明供試的3種Bt蛋白單獨(dú)或混合作用對(duì)大草蛉生長(zhǎng)發(fā)育均無(wú)顯著性直接不利影響，這與之前其他 Bt蛋白對(duì)草蛉類(lèi)昆蟲(chóng)的生態(tài)安全性評(píng)價(jià)結(jié)果相一致[26］。

在Tier-1直接試驗(yàn)中，雖然殺蟲(chóng)化合物以高于田間實(shí)際表達(dá)量至少 10倍的劑量混入到待評(píng)價(jià)生物人工飼料中，但并不代表選擇的非靶標(biāo)生物實(shí)際暴露于這么高的濃度，因?yàn)榇u(píng)價(jià)的殺蟲(chóng)物質(zhì)在試驗(yàn)過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生降解，從而失去毒性。因此，需要選擇一種合適的方法來(lái)監(jiān)測(cè)受試生物人工飼料中混入 Bt蛋白的濃度和生物活性，如利用蛋白免疫印跡法（Western blot）或ELISA法來(lái)檢測(cè)Bt蛋白在試驗(yàn)過(guò)程中的濃度變化[27-28］，后者與前者相比，其操作更簡(jiǎn)便、測(cè)定更精確；試驗(yàn)過(guò)程中Bt蛋白的生物活性變化則利用對(duì)Bt毒素敏感的昆蟲(chóng)來(lái)檢測(cè)[14］。本研究中大草蛉人工飼料每2 d更換一次，Bt蛋白穩(wěn)定性和生物活性測(cè)定結(jié)果顯示，Bt蛋白處理大草蛉飼料在試驗(yàn)環(huán)境條件下暴露2 d后，雖然其中的Bt蛋白濃度有一定程度降低，但其生物活性無(wú)顯著變化；大草蛉取食 Bt蛋白處理飼料后，在其幼蟲(chóng)及成蟲(chóng)體內(nèi)均檢測(cè)到了較高濃度的Bt蛋白，蛹內(nèi)也檢測(cè)到了少量Bt蛋白，說(shuō)明該試驗(yàn)體系能將混入的殺蟲(chóng)蛋白傳遞給大草蛉，大草蛉在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中接觸到的均為高濃度的、具有生物活性的Bt蛋白，但對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育并無(wú)顯著性不利影響。

在本研究建立的安全性評(píng)價(jià)體系中，Cry1Ac、Cry1F和Cry2Ab這3種Bt蛋白以單獨(dú)或組合的方式高劑量混入大草蛉人工飼料，對(duì)大草蛉生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)顯著性不利影響。進(jìn)一步測(cè)定了在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用的主要代謝酶系的活性，發(fā)現(xiàn)直接取食含有高濃度Bt蛋白的大草蛉人工飼料，對(duì)大草蛉體內(nèi)主要消化酶、解毒酶和保護(hù)酶的活性均無(wú)顯著性影響，但取食 PA處理的飼料卻能顯著影響大草蛉體內(nèi)所測(cè)酶的酶活性。王英麗等研究表明，捕食性天敵取食轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物后，其體內(nèi)某些酶活性會(huì)發(fā)生變化，如蛋白酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、過(guò)氧化物酶及超氧化物歧化酶等[20,29-30］。有報(bào)道認(rèn)為一些捕食性天敵取食轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物后，其體內(nèi)某些酶活性發(fā)生變化可能是由于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物中次生物質(zhì)或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)引起的，而非Bt蛋白所導(dǎo)致。綜合上述生物學(xué)及生理生化方面的評(píng)價(jià)結(jié)果，說(shuō)明Cry1Ac、Cry1F和Cry2Ab對(duì)大草蛉是安全的。

4 結(jié)論

本研究所建立的直接試驗(yàn)評(píng)價(jià)體系可用于評(píng)價(jià)新型殺蟲(chóng)蛋白或轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物對(duì)大草蛉的生態(tài)安全性，大草蛉取食高濃度活性Bt蛋白，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育及體內(nèi)主要代謝酶活性均無(wú)顯著不利影響，因此，目前轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉中廣泛表達(dá)的Cry1Ac、Cry1F和Cry2Ab對(duì)大草蛉是安全的。