牛血清中口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)方法的建立

王 旭 ，孫 雨 ，王睿男 ，肖 穎 ，蔣 菲 ，畢一鳴 ，李 碩 ，楊 林 ，董 虹，宋曉暉，王傳彬

（1.北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206；2.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600；3.重慶動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，重慶 400000）

口蹄疫（Foot and mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物發(fā)生的急性、熱性、高度接觸性動(dòng)物傳染病，目前已知該病有65個(gè)以上的亞型。牛尤其是犢牛對(duì)口蹄疫病毒最易感。本病在犢牛群中具有發(fā)病流行快、傳播廣、發(fā)病急、危害巨大等特點(diǎn)，疫區(qū)發(fā)病率可達(dá)50%以上，甚至100%，犢牛死亡率較高，其他牛死亡率則較低。病牛和潛伏期牛是最危險(xiǎn)的傳染源，患病牛的臨床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮膚等部位發(fā)生水皰性皮疹，臨床上需注意該病與牛惡性卡他熱的鑒別。病牛的水皰液、食道-咽部分泌物、乳汁、尿液、口涎、糞便和淚液等均含有口蹄疫病毒。該病主要通過(guò)消化道感染動(dòng)物，也可經(jīng)呼吸道傳染，以春秋兩季較為流行，尤其是春季發(fā)病較多。該病傳播途徑多、速度快，在世界范圍內(nèi)多次暴發(fā)流行。鑒于此，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為A類傳染病之首。目前，一半以上的OIE成員國(guó)流行FMD，無(wú)FMD國(guó)家和地區(qū)的畜產(chǎn)品貿(mào)易和家畜安全遭受巨大威脅。因此，開(kāi)展口蹄疫野毒感染抗體的血清學(xué)鑒別診斷技術(shù)研究，在預(yù)防、控制、撲滅和凈化該病方面具有重大意義［1］。

近幾年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)口蹄疫病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白3A、3B、3AB、3C、3ABC 以及 2B、2C 等片段做了詳細(xì)的免疫學(xué)研究，建立了多種血清學(xué)檢測(cè)方法［2-4］。其中一些方法非常適用于鑒別診斷口蹄疫野毒感染和疫苗接種免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體。目前，多項(xiàng)研究表明，用重組蛋白技術(shù)表達(dá)的3AB、3B、2C和3ABC均可作為ELISA方法的包被檢測(cè)抗原，用于區(qū)分口蹄疫野毒感染和接種免疫產(chǎn)生的抗體［5-9］。目前已經(jīng)有報(bào)道關(guān)于利用FMD非結(jié)構(gòu)蛋白 2B、2C、3A、3B、3AB、3ABC 聯(lián)合 3AB 蛋白等而發(fā)展的ELISA方法［10-12］。國(guó)內(nèi)與國(guó)際上也有較多的商品化口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA方法檢測(cè)試劑盒。其中3ABC蛋白由于具有較高的免疫原性以及其抗體在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)而被廣泛應(yīng)用于免疫研究［13-14］。如何選擇結(jié)構(gòu)表位優(yōu)勢(shì)突出、抗原性強(qiáng)、抗原指數(shù)高、親水性強(qiáng)的序列片段，選擇合適的抗原表達(dá)載體和酶切位點(diǎn)，構(gòu)建可溶性表達(dá)載體并且優(yōu)化可溶性蛋白的高效表達(dá)方法，是本領(lǐng)域長(zhǎng)期以來(lái)一直研究的熱點(diǎn)課題［15-20］。時(shí)間分辨免疫熒光分析法（TRFIA）使用熒光元素標(biāo)記代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酶標(biāo)記技術(shù)，是非常具有潛力的一種發(fā)光標(biāo)記免疫分析方法。該技術(shù)通常使用銪（Eu3+）、鏑（De3+）、鋱（Te3+）、釤（Sm3+）等發(fā)光元素代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酶等發(fā)光物質(zhì)，延長(zhǎng)了熒光壽命，降低了本底因素影響，敏感性和特異性都有了顯著提高。目前，該方法在人類健康指標(biāo)以及傳染病診斷檢測(cè)方面應(yīng)用范圍較廣，但在重大動(dòng)物傳染病診斷檢測(cè)領(lǐng)域開(kāi)展的研究很少，市場(chǎng)上尚無(wú)任何注冊(cè)產(chǎn)品。本研究利用DNA重組技術(shù)與重組抗原表達(dá)技術(shù)，在大腸桿菌pET-32a載體中高效表達(dá)了口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3A-3B可溶性抗原，并以此重組抗原作為檢測(cè)包被抗原，與其他相關(guān)試劑組合后制備了口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑盒，用于牛血清中口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3A-3B抗體的檢測(cè)，并且評(píng)價(jià)了試劑盒的各項(xiàng)應(yīng)用指標(biāo)，由檢測(cè)結(jié)果判定被檢動(dòng)物是否感染口蹄疫病毒，具有較高的臨床實(shí)用價(jià)值和推廣價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)菌BL21（DE3）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET-32a融合表達(dá)載體購(gòu)自Novagen公司；所用酶和試劑：T4DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶NdeI、XhoI，2000 DNA Marker，IPTG、SDS均購(gòu)自寶生物（大連）工程有限公司；DNA Extraction Kit、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、DNA快速純化回收試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自Fermentas公司；融合蛋白目的基因的合成由華大基因生物科技有限公司完成；口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體單抗阻斷ELISA試劑盒購(gòu)自國(guó)內(nèi)市售品牌；重組大腸埃希氏菌pET-32a-（3A-3B）-BL21（DE3）株、口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白單克隆抗體細(xì)胞株均由中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心鑒定、保管和供應(yīng)；脫脂奶粉購(gòu)自美國(guó)Oxoid公司；酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)Costar公司；銪標(biāo)記元素（Eu3+）購(gòu)自廣州達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；陰性與陽(yáng)性樣本血清由中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)診斷中心）保存。Auto-DELFIA1235時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀購(gòu)自PerkinElmer股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因片段的獲得 根據(jù)NCBI網(wǎng)站口蹄疫病毒3ABC基因序列，使用化學(xué)合成的方法分別合成了口蹄疫病毒的3A-3B融合表達(dá)目的基因序列。

1.2.2目的基因擴(kuò)增與融合 根據(jù)口蹄疫病毒3A-3B基因的序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，并分別在引物的5'端添加BamHI和3'端添加X(jué)hoI酶切位點(diǎn)，用于目的片段的擴(kuò)增。

上 游 引 物 FMDV-NF：ggatccATTTCAATCCCTTCCC AGAAG；

下游引物FMDV-NR：ctcgagTTCCTTCACGACGGGGA CTTTT。

1.2.3 重組蛋白可溶性誘導(dǎo)表達(dá)條件的建立 將口蹄疫3A-3B目的基因序列連入pET-32a表達(dá)載體中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，并將上述鑒定的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)菌E.coliBL21（DE3）中，挑取陽(yáng)性克隆，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將菌液以1∶100接種于含氨芐青霉素（50 μg/mL）的液體 LB 培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.4～0.6時(shí)，取出l mL未誘導(dǎo)的菌液作為對(duì)照，其余液體中加入異丙基硫代-B-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。經(jīng)過(guò)對(duì)溫度、時(shí)間、IPTG濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定蛋白高效可溶性誘導(dǎo)表達(dá)條件為：0.75 mM的IPTG濃度，過(guò)夜誘導(dǎo)13 h大量表達(dá)后，4℃、8 000 r/min離心30 min，收集菌體。經(jīng)過(guò)高壓大規(guī)模破碎菌體后，4℃、16 000 r/min離心30 min，收集上清。

1.2.4 重組蛋白3A-3B的表達(dá)與純化

1.2.4 .1 樹(shù)脂的預(yù)處理 吸取1 mL NiSepharoseTM 6 Fast Flow樹(shù)脂，用10倍樹(shù)脂體積的純水洗樹(shù)脂3次，用10倍樹(shù)脂體積的10 mmol/L咪唑緩沖液洗樹(shù)脂2次。讓樹(shù)脂自然沉降，棄廢液。

1.2.4 .2 掛柱 將1.2.4.1中制備上清穿過(guò)樹(shù)脂柱，重復(fù)5～7次。

1.2.4 .3 重組蛋白的洗雜和洗脫 依次用濃度為10、20、40、60、80、100、200 及 500 mmol/L 咪唑緩沖液對(duì)重組蛋白進(jìn)行洗雜和洗脫。

1.2.4 .4蛋白的收獲 收集洗脫液濃度為100、200和500 mmol/L洗脫產(chǎn)生的濾液，將500 mmol/L洗脫產(chǎn)生的濾液通過(guò)GE公司生產(chǎn)的Superdex200凝膠柱分子篩進(jìn)行進(jìn)一步精細(xì)純化，最后將純化后的蛋白吸出，加到透析袋中（8 KD），浸泡在2 L的透析液中過(guò)夜透析，置于-70℃以下的冰箱保存。

1.2.5 純化后蛋白的抗原性分析（Dot-ElISA）檢測(cè) 使用DAB染色法，將表達(dá)與純化后的3A-3B抗原分別與?？谔阋卟《?ABC抗體陽(yáng)性血清進(jìn)行孵育，觀察血清孵育的NC膜在抗原相應(yīng)分子量區(qū)域沒(méi)有明顯的斑點(diǎn)。

1.2.6 銪標(biāo)記抗體結(jié)合物的制備

1.2.6 .1兔抗牛二抗的預(yù)處理 將一定量的兔抗牛二抗加至50 KD截留分子量的超濾管中，9 000 r/min離心5 min，棄濾液。加入200 μL標(biāo)記緩沖液，9 000 r/min離心5 min，棄濾液，再加入200 μL標(biāo)記緩沖液，按上述方法離心（9 000 r/min離心5 min），此步驟重復(fù)6次，最后一次離心完畢后，控制終體積在150～200 μL之間，把超濾管取出，棄掉濾液，翻轉(zhuǎn)濾管于新的收集管中，8 000 r/min離心2 min，收集所得濾液。

1.2.6 .2兔抗牛二抗的標(biāo)記 按照標(biāo)記1 mg二抗需要0.2 mg DTTA-銪NA標(biāo)記試劑，按質(zhì)量比為5∶1，將待標(biāo)記抗體和標(biāo)記試劑充分混勻，置于搖床上25℃孵育過(guò)夜。

1.2.6 .3銪標(biāo)記兔抗牛二抗的純化 用SephadexTM G-50柱凝膠層析柱純化，具體步驟如下：①將Sephadex TM G-50填料，與水混勻裝柱。用純化柱平衡緩沖液對(duì)柱子進(jìn)行處理，流速控制在1 mL/min，洗5個(gè)柱體積，使其pH值達(dá)到7.8，即可準(zhǔn)備上樣。②柱子平衡好后，取下柱子上端閥口，待柱中液面降至凝膠柱平面時(shí)，吸取樣品緩慢加入到柱子內(nèi)，注意不要破壞柱平面，等液面稍沉降后，加入1 mL純化柱洗脫液，重新裝好柱子。③用洗脫液洗脫，流速控制在1 mL/min左右，待抗體檢測(cè)已顯示出現(xiàn)蛋白峰（OD280）時(shí)，開(kāi)始收集樣品，每管1 mL。④標(biāo)記物收集后，每管取5 μL加入96孔酶標(biāo)板中，再加入200 μL增強(qiáng)液，在振蕩器上振蕩5 min后測(cè)熒光值，收集熒光值較高的幾管。

1.2.6 .4 銪標(biāo)稀釋液的配制 Tris-base 30.3 g，NaCl 45 g，NaN35 g，Tween-20 0.5 mL，脫脂奶粉 25 g，酪蛋白 16 g，調(diào)節(jié)pH值至7.8，充分混勻，定容到500 mL，0.22 μm過(guò)濾。4℃保存。

1.2.6 .5銪標(biāo)結(jié)合物的配制 將銪元素標(biāo)記的兔抗牛二抗用銪標(biāo)稀釋液稀釋至1 μg/mL。按不同規(guī)格要求無(wú)菌定量分裝，貼加標(biāo)簽。

1.2.6 .6 標(biāo)記物的保存 合并收集的標(biāo)記物后，利用BCA法檢測(cè)標(biāo)記抗體的濃度，然后加入10%BSA至終濃度為0.1%，混勻，測(cè)定濃度。注明標(biāo)記物名稱、標(biāo)記日期等信息后置于-20℃保存。同樣工藝連續(xù)標(biāo)記3批，批號(hào)分別為18-01、18-02和18-03。

1.2.7 3A-3B抗原的包被和封閉 包被：將純化的口蹄疫病毒3A-3B抗原用pH值9.6碳酸鹽包被液從8 μg/mL梯度稀釋至 0.5 μg/mL，每孔 100 μL加入 Costar的ELISA 酶標(biāo)板中，2～8℃放置 12～16 h；封閉：取出包被板，用PBST洗滌3次，用5%脫脂奶封閉，每孔350 μL，37℃放置2 h，封閉后洗滌同上。用制備好的各濃度反應(yīng)板分別檢測(cè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，加入梯度稀釋的銪標(biāo)記兔抗牛二抗反應(yīng)，比較熒光檢測(cè)值以及陰性對(duì)照熒光值/陽(yáng)性對(duì)照熒光值結(jié)果，選取比值最大的包被濃度，作為抗原最佳包被濃度。

1.2.8 銪標(biāo)記兔抗牛二抗最適工作濃度的確定 在口蹄疫病毒3A-3B抗原包被板中加入陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，用銪標(biāo)稀釋液將銪標(biāo)抗體結(jié)合物從1∶2 000稀釋至1∶32 000 μg/mL，分別加入反應(yīng)板中，其他步驟按常規(guī)操作，比較熒光檢測(cè)值及陰性對(duì)照熒光值/陽(yáng)性對(duì)照熒光值結(jié)果，選取標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)值50 000左右、且P/N值最大的銪標(biāo)記結(jié)合物工作濃度，作為銪標(biāo)記抗原的最適工作濃度。

1.2.9 樣品稀釋度的確定 在制備好的反應(yīng)板中分別加入倍比稀釋的陰性和陽(yáng)性牛口蹄疫病毒3ABC抗體血清樣品，在其他條件相同的情況下，進(jìn)行時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)，選擇陽(yáng)性值最高且P/N值最大的稀釋度。

1.2.1 0抗原最佳反應(yīng)時(shí)間選擇 在制備好的反應(yīng)板中加入4組陰陽(yáng)性血清對(duì)照，按已經(jīng)確定的程序操作，在室溫條件下分別振蕩反應(yīng) 30min、60min、90min、120min，在其他條件相同的情況下，進(jìn)行時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)，取P/N值最高且用時(shí)最短的作用時(shí)間確定為最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.1 1陰陽(yáng)性臨界值的確定 采用建立的時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)方法對(duì)400份牛陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定熒光檢測(cè)值、400份陰性血清平均值x與標(biāo)準(zhǔn)差SD值，并計(jì)算陰陽(yáng)性臨界值x+3SD的熒光值。按照S/N公式：S/N=（臨界熒光值-陰性質(zhì)控血清熒光值）（/陽(yáng)性質(zhì)控血清熒光值-陰性質(zhì)控血清熒光值），計(jì)算檢測(cè)方法判定陰陽(yáng)性臨界值的S/N值。

1.2.1 2 特異性試驗(yàn) 用樣品稀釋液按照1∶50分別對(duì)牛傳染性鼻氣管炎抗體陽(yáng)性血清、牛病毒性腹瀉抗體陽(yáng)性血清、大腸桿菌陽(yáng)性牛血清、牛布魯氏菌病抗體陽(yáng)性血清進(jìn)行稀釋。

1.2.1 3敏感性試驗(yàn) 將?？谔阋卟《?ABC抗體陽(yáng)性血清用樣品稀釋液按照 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800 和 1∶25 600 進(jìn)行倍比稀釋，采用建立的時(shí)間分辨免疫熒光分析法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用Procheck的3ABC抗體檢測(cè)試劑盒作為比較，得出陽(yáng)性臨界值時(shí)的最大稀釋度。

1.2.1 4重復(fù)性試驗(yàn) 采用建立的快速定量檢測(cè)方法對(duì)10份牛血清在同批次板和不同批次板上分別進(jìn)行檢測(cè)，平行測(cè)定5次，計(jì)算批內(nèi)、批間變異系數(shù)（CV）。

1.2.1 5符合性試驗(yàn) 采用建立的時(shí)間分辨檢測(cè)方法與Procheck公司生產(chǎn)的3ABC抗體診斷試劑盒對(duì)送檢的300份血清進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE分析結(jié)果

分別取處理后的試驗(yàn)組樣品、對(duì)照組樣品及蛋白分子量Marker進(jìn)行SDS-PAGE電泳試驗(yàn)，結(jié)果表明，重組大腸埃希氏菌 pET-32a-（3A-3B）-BL21（DE3）能誘導(dǎo)產(chǎn)生3A-3B蛋白，且誘導(dǎo)后產(chǎn)生的蛋白大部分為可溶性蛋白，結(jié)果詳見(jiàn)圖1。

圖 1 pET-32a-（3A-3B）-BL21（DE3）株菌種誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

2.2 純化后蛋白的抗原性分析（Dot-ElISA）檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)DAB顯色后，重組大腸埃希氏菌pET-32a-（3A-3B）-BL21（DE3）株菌種蛋白與陽(yáng)性血清孵育的NC膜在抗原相應(yīng)分子量區(qū)域分別出現(xiàn)一個(gè)明顯的斑點(diǎn)，而在其他區(qū)沒(méi)有斑點(diǎn)；陰性血清孵育的NC膜在抗原相應(yīng)分子量區(qū)域沒(méi)有明顯的斑點(diǎn)，詳見(jiàn)圖2。

圖2 3A-3B重組蛋白的抗原性分析（Dot-ELISA）檢測(cè)結(jié)果

2.3 3A-3B抗原最佳包被濃度與銪標(biāo)二抗最佳稀釋濃度的選擇

當(dāng)3A-3B抗原包被濃度為2 μg/mL、銪標(biāo)二抗稀釋度為1∶8 000時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)對(duì)照的P/N值最高。因此，確定3A-3B抗原的最佳包被濃度為2 μg/mL，銪標(biāo)二抗 稀釋度為1∶8 000，見(jiàn)表1。

表1 3A-3B抗原包被濃度及銪標(biāo)二抗工作濃度選擇

2.4 樣品稀釋度

對(duì)3種樣品不同稀釋度結(jié)果進(jìn)行比較，最終確定牛血清樣品50倍稀釋檢測(cè)陽(yáng)性值最高，且陰陽(yáng)差異（P/N值）最大，見(jiàn)表2。

表2樣品稀釋度的確定

2.5 待檢抗體反應(yīng)時(shí)間選擇

對(duì)待檢抗體不同反應(yīng)時(shí)間結(jié)果進(jìn)行比較，最終確定P/N接近最大而反應(yīng)時(shí)間相對(duì)較短的室溫振蕩60 min為最佳反應(yīng)時(shí)間，見(jiàn)表3。

表3待檢抗體的最佳作用時(shí)間

2.6 銪標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間選擇

對(duì)銪標(biāo)抗原不同反應(yīng)時(shí)間結(jié)果進(jìn)行比較，最終確定P/N最大且反應(yīng)時(shí)間較短的室溫振蕩30 min為最佳反應(yīng)時(shí)間，見(jiàn)表4。

表4銪標(biāo)二抗工作時(shí)間的確定

2.7 時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)方法陰陽(yáng)性臨界值確定

采用建立的時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)方法對(duì)400份牛陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定熒光檢測(cè)值、400份陰性血清平均值x與標(biāo)準(zhǔn)差SD值，并計(jì)算陰陽(yáng)性臨界值x+3SD的熒光值。按照S/N公式：S/N=（臨界熒光值-陰性質(zhì)控血清熒光值）（/陽(yáng)性質(zhì)控血清熒光值-陰性質(zhì)控血清熒光值），計(jì)算陰陽(yáng)性臨界值的S/N值為0.2。即當(dāng)樣品S/N值≥0.2時(shí)，判定樣品為陽(yáng)性；當(dāng)S/N值<0.2時(shí)，判定樣品為陰性。

2.8 特異性試驗(yàn)

時(shí)間分辨熒光免疫分析方法對(duì)牛傳染性鼻氣管炎抗體陽(yáng)性血清、牛病毒性腹瀉抗體陽(yáng)性血清、大腸桿菌陽(yáng)性牛血清、牛布魯氏菌病抗體陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該方法對(duì)各血清的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，詳見(jiàn)表5。

表5時(shí)間分辨熒光免疫分析方法對(duì)特異性血清的檢測(cè)結(jié)果

2.9 敏感性試驗(yàn)

用所建立的時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)方法分別對(duì)不同稀釋度的口蹄疫病毒強(qiáng)陽(yáng)性血清、陽(yáng)性血清和弱陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，3批試劑盒對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性血清的最低檢出限均為1∶1 600，對(duì)陽(yáng)性血清的最低檢出限均為1∶800，對(duì)弱陽(yáng)性血清的最低檢出限均為 1∶400，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.1 0重復(fù)性試驗(yàn)

以不同效價(jià)血清稀釋50倍后做平行重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果顯示，批內(nèi)與批間重復(fù)變異系數(shù)均小于10%（表7）。結(jié)果表明，建立的時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性。

2.1 1符合性試驗(yàn)

分別用自制的和市售的試劑盒對(duì)300份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，口蹄疫3ABC抗體時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)方法共檢出陽(yáng)性樣品154份，陰性樣品146份；市售試劑盒共檢出陽(yáng)性樣品150份，陰性樣品150份，兩種試劑盒陽(yáng)性樣品的符合率96%，陰性樣品的符合率93.3%，總符合率95.7%，符合率統(tǒng)計(jì)結(jié)果詳見(jiàn)表8。

表6時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)方法對(duì)陽(yáng)性血清的檢測(cè)結(jié)果

表7時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)方法重復(fù)性試驗(yàn)

表8兩種試劑盒對(duì)FMDV抗體檢測(cè)符合率統(tǒng)計(jì)

3 討論

?？谔阋吲c水泡性口炎、牛惡性卡他熱的癥狀相似，臨床不易區(qū)分，故應(yīng)做實(shí)驗(yàn)室診斷鑒別。其方法是采集典型發(fā)病牛的水泡皮或者呼吸道-咽部分泌物，以pH 值 7.2～7.6 的磷酸鹽緩沖液制成比例為 1∶5～1∶10 的研磨懸液，離心沉淀后取上清液接種牛、豬、羊等偶蹄動(dòng)物以及馬、乳鼠等動(dòng)物，如果僅馬不發(fā)病，其他動(dòng)物都臨床發(fā)病，出現(xiàn)典型臨床癥狀，即可判定為?？谔阋?。取牛呼吸道-咽部分泌物或者乳房、舌部和蹄部的新鮮水泡皮，加40%～60%的甘油生理鹽水裝入滅菌瓶?jī)?nèi)，送有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展病毒分離試驗(yàn)，是目前最為經(jīng)典的確診方法，但該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且鑒定周期較長(zhǎng)，較為繁瑣。目前診斷牛口蹄疫病使用最為普遍的是基于FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白（3ABC）的ELISA鑒別診斷技術(shù)。

FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)顯而易見(jiàn)，首先檢測(cè)血清中的非結(jié)構(gòu)蛋白抗體可以用來(lái)區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物與野毒感染動(dòng)物；其次非結(jié)構(gòu)蛋白不分血清型，65個(gè)以上的亞型均可使用此方法進(jìn)行診斷，因此，基于非結(jié)構(gòu)蛋白的ELISA檢測(cè)方法可以對(duì)口蹄疫的大部分血清型進(jìn)行檢測(cè)。本研究通過(guò)大量的試驗(yàn)篩選，選擇了口蹄疫3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白序列中可以高效可溶性表達(dá)的3A-3B優(yōu)勢(shì)抗原序列片段作為目的診斷抗原。其中3A片段為非結(jié)構(gòu)抗原3ABC中的截短片段，3B1（VPg1）與3B2（Vpg2）序列為3B位抗原序列中的兩個(gè)亞基，這3個(gè)片段的融合表達(dá)不僅可溶性表達(dá)比例高，而且與口蹄疫3ABC全抗原相比，檢測(cè)的敏感性相當(dāng)，但3A-3B特異性更好，所以本研究選擇3A-3B優(yōu)勢(shì)抗原序列片段作為目的診斷抗原。通過(guò)比對(duì)Pet28a、Pet30a、Pet32a、Pgex4-1載體對(duì)抗原的表達(dá)效果，Pet32a載體表達(dá)抗原量最高，融合抗原的可溶性表達(dá)比例也最高，最終選擇Pet32a載體作為融合抗原表達(dá)載體。在酶切位點(diǎn)的選擇方面，通過(guò)比較BamHI、XhoI、NdeI、XhoI、EcoRI、XhoI等酶切位點(diǎn)組合，選擇BamHI、XhoI酶切位點(diǎn)組合可溶性融合抗原的表達(dá)量最高，最終選擇Pet32a載體的BamHI、XhoI酶切位點(diǎn)組合進(jìn)行抗原的表達(dá)。

與傳統(tǒng)的FMDV的病毒分離、血清中和試驗(yàn)、ELISA等檢測(cè)方法相比，時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，判斷結(jié)果敏感、特異、客觀，并且可應(yīng)用于全自動(dòng)檢測(cè)。同時(shí)，目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的用于檢測(cè)FMDV抗體的ELISA試劑盒主要依賴國(guó)外進(jìn)口，價(jià)格十分昂貴，給基層獸醫(yī)口蹄疫檢測(cè)和監(jiān)測(cè)工作的開(kāi)展帶來(lái)巨大困難。時(shí)間分辨熒光免疫分析法是一種新興的熒光免疫分析方法，它利用了熒光的波長(zhǎng)與其激發(fā)波長(zhǎng)的差異，克服了普通紫外-可見(jiàn)分光分析法中非特異檢測(cè)的影響，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性與特異性。為克服銪標(biāo)記的抗原熒光強(qiáng)度弱的問(wèn)題，一般在試驗(yàn)反應(yīng)體系中加入增強(qiáng)劑，可使銪元素從復(fù)合物上解離出來(lái)，解離的銪元素同增強(qiáng)劑螯合結(jié)合形成膠態(tài)分子團(tuán)，膠態(tài)結(jié)合分子團(tuán)能在紫外光的激發(fā)下發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，信號(hào)強(qiáng)度獲得了極大的放大。時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)方法相比較于傳統(tǒng)酶免ELISA方法檢測(cè)敏感性更高、特異性更強(qiáng)、信噪比更高、本底值更低、成本更低、操作簡(jiǎn)單易行、儀器小型化便于攜帶，適用于基層田間大量樣品的快速定量檢測(cè)，更適合于基層和田間對(duì)動(dòng)物疫病的診斷。