影響瀕危東北巖高蘭種子萌發(fā)因素分析

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，呼和浩特 010019)

東北巖高蘭(Empetrumnigrumvar.japoncum)為巖高蘭科(Empetraceae)巖高蘭屬常綠匍匐小灌木，全科3屬9種，我國(guó)有1屬1變種，主要分布在我國(guó)東北大興安嶺地區(qū)海拔775～1 650 m的山頂[1-3]，為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物。東北巖高蘭是中生喜酸植物[4]，具有耐寒、耐旱、耐貧瘠、喜光及抗風(fēng)等特性[5]。單性花或兩性花，雌雄異株或同株，花期6—7月[6]。漿果狀核果，具6～8核，果期7—8月[7]。東北巖高蘭的研究以化學(xué)成分、藥用價(jià)值、指示作用為主。全株可入藥，具補(bǔ)脾、健胃、助消化、抗疲勞、提高免疫力功效[8]，果滋陰、養(yǎng)肝、明目、利尿，抗維生素C缺乏病[9]，是亞高山矮曲林帶的特小灌木之一，具有指示作用[10]。由于東北巖高蘭具有很高的藥用價(jià)值，民間采集比較常見(jiàn)，但不規(guī)范采集方式導(dǎo)致東北巖高蘭資源急劇減少，也是其被列入國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物的主要原因。自然條件下東北巖高蘭以克隆繁殖為主，但由于枝條很細(xì)，人工用1年生帶踵插穗扦插成活率僅為39.1%～40.9%，移栽成活率僅為25.0%～30.4%[10]。滿歸林業(yè)局天然東北巖高蘭群落的結(jié)實(shí)量較多，采用種子繁殖擴(kuò)大其種群數(shù)量，不僅對(duì)保護(hù)現(xiàn)有資源具有重要作用，也是一種相對(duì)可行的有效途徑，但對(duì)其種子發(fā)芽能力的研究?jī)H見(jiàn)種子催芽方法專利[11]，對(duì)種子發(fā)芽困難的原因還需進(jìn)一步研討，如種皮、胚根生長(zhǎng)等因素對(duì)發(fā)芽的影響。本文以東北巖高蘭種子為試材，研究種子發(fā)芽需要的溫度、光照條件，水浸、濃硫酸、激素、低溫層積等多種方法催芽后對(duì)萌發(fā)的影響，未發(fā)芽種子種皮和胚的解剖結(jié)構(gòu)特征等，分析導(dǎo)致種子深休眠的原因，種子適宜的萌發(fā)條件和幼苗的生長(zhǎng)特性，從而為東北巖高蘭有性繁殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

種子采自內(nèi)蒙古自治區(qū)大興安嶺北部滿歸林業(yè)局孟庫(kù)林場(chǎng)和高地林場(chǎng)的東北巖高蘭天然群落，具體為分布在落葉松(Larixgmalinii)、樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)、偃松(Pinuspumila)疏林及林緣[12]的東北巖高蘭。對(duì)采集的果實(shí)用水選法進(jìn)行調(diào)制，果實(shí)出種率54.51%；單個(gè)果實(shí)出種4～15個(gè)，一般6～9個(gè)，并以7個(gè)最多；種子凈度92.25%，千粒重0.963 g，含水量3.70%。

1.2 研究方法

1.2.1發(fā)芽條件選定方法

以濃硫酸處理10 min和1 000 mg/L GA3處理12 h種子為試材，按照1)～3)選擇適宜發(fā)芽條件：

1) 在光照/黑暗(12 h/12 h)的培養(yǎng)箱內(nèi)，將溫度設(shè)置為5，10，15，20，25，30，35 ℃ 7個(gè)梯度，選擇適宜恒溫發(fā)芽溫度。

2) 在最適恒溫條件下，光照時(shí)間分為0，6，8，10，12，14 h 6個(gè)梯度，選擇適宜光照時(shí)間。

3) 在最適光照條件下，將每日溫度設(shè)定為高溫+低溫各12 h，分別為10 ℃+5 ℃、15 ℃+5 ℃、20 ℃+10 ℃、25 ℃+15 ℃、30 ℃+20 ℃、35 ℃+25 ℃，選擇適宜變溫發(fā)芽條件。

4) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)1)～3)選擇溫度(25±1)℃、光照/黑暗(12 h/12 h)的適宜發(fā)芽條件，在培養(yǎng)箱內(nèi)對(duì)實(shí)驗(yàn)1.2.2中的催芽種子進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。

1.2.2種子催芽處理方法

1) 用20，40，60，70 ℃的水，并與種子按3∶1體積比例，浸種6 h使種子充分吸水后[13]，進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。

2) 將蛭石加水至田間持水量的60%，并與種子按3∶1體積比例混合，放在4 ℃左右的冰箱冷藏室內(nèi)，低溫層積催芽30，50，70，90 d后，進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。

3) 用500，700，1 000，1 500 mg/L GA3浸泡種子12 h，使之充分吸收GA3溶液后，進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。

4) 采用濃硫酸浸泡種子1，5，10，15，20，30 min，清洗氧化種皮和殘留硫酸后，進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。

5) 選擇濃硫酸處理的陰干種子，用500，700，1 000，1 500 mg/L GA3浸泡12 h后，進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。

1.2.3種子發(fā)芽指標(biāo)計(jì)算

各發(fā)芽實(shí)驗(yàn)每100粒種子為1組，重復(fù)4次。置床后第2天開(kāi)始，每天20：00時(shí)觀察種子發(fā)芽數(shù)，根長(zhǎng)≥種子縱徑長(zhǎng)度為正常發(fā)芽，連續(xù)7 d發(fā)芽粒數(shù)不足供試種子總數(shù)1%時(shí)發(fā)芽實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

發(fā)芽率(%)=(n/N)×100%(式中，n為測(cè)定時(shí)間內(nèi)正常發(fā)芽種子粒數(shù)，N為置床時(shí)的種子數(shù))[14]；

絕對(duì)發(fā)芽率(%)=n/(N-No)×100%(式中，n為測(cè)定時(shí)間內(nèi)正常發(fā)芽種子粒數(shù)，N為置床時(shí)的種子數(shù)，No為發(fā)芽結(jié)束時(shí)未發(fā)芽種子空粒數(shù))；

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt(式中，Gt為在時(shí)間t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為相對(duì)的發(fā)芽天數(shù))[15]；

發(fā)芽啟動(dòng)速度=t(式中，t為置床后到第1粒種子萌發(fā)所需的天數(shù))。

1.2.4種子解剖方法

為判斷種皮和胚對(duì)種子萌發(fā)的影響，在體視顯微鏡下，對(duì)未發(fā)芽的種子，測(cè)量其縱徑、橫徑、厚度；再將種子縱向切開(kāi)，觀測(cè)種皮的質(zhì)地、不同部位的厚度、種臍處種皮的厚度，胚和胚乳發(fā)育情況，胚根生長(zhǎng)情況等。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度和光照對(duì)種子萌發(fā)的影響

光照/黑暗(12 h/12 h)的不同恒溫發(fā)芽實(shí)驗(yàn)表明，種子萌發(fā)的溫度在15～35 ℃之間，以25 ℃的發(fā)芽率最高，為19.75%；恒溫25 ℃的不同光照時(shí)間發(fā)芽實(shí)驗(yàn)表明，以光照/黑暗(12 h/12 h)的發(fā)芽率最高，為19.75%；光照/黑暗(12 h/12 h)的不同變溫發(fā)芽實(shí)驗(yàn)表明，以35 ℃+25 ℃的發(fā)芽率最高，為10.50%。綜合上述3個(gè)實(shí)驗(yàn)，發(fā)芽率為恒溫>變溫、有光照>無(wú)光照，有光照(見(jiàn)圖1)比無(wú)光照(見(jiàn)圖2)幼苗生長(zhǎng)健壯，但無(wú)光照幼苗高生長(zhǎng)量為有光照幼苗的3～4倍。

2.2 水浸、低溫層積、GA3處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

采用不同溫度的水浸種，或不同天數(shù)低溫層積催芽，或GA3濃度為500，700，1 000，1 500 mg/L處理種子，置床后2個(gè)月均未見(jiàn)種子萌發(fā)。水浸主要是軟化種皮，增加透水透氣性；低溫層積催芽是近自然的催芽方法，一般具備催芽的各種作用；GA3處理則是人工補(bǔ)充外援激素，以改善生長(zhǎng)抑制劑和生長(zhǎng)促進(jìn)劑之間的平衡，調(diào)節(jié)種子的生理代謝。東北巖高蘭種子在水浸、低溫層積、GA3處理未發(fā)，可能與種子的種皮、胚等特征有關(guān)。

圖1 光照條件下種子萌發(fā)圖

圖2 無(wú)光照條件下種子萌發(fā)圖

2.3 未萌發(fā)種子解剖特征

由圖3可看出，未萌發(fā)種子的縱徑、橫徑、厚度分別為1.61，1.05，0.82 mm；種皮骨質(zhì)，厚薄不均，厚度在0.15～0.49 mm之間，種臍處皮厚0.21 mm，較薄處在種子上部；種仁縱徑、橫徑、厚度分別為1.00，0.26，0.22 mm；胚和胚乳發(fā)育完整，且種子吸水良好，根尖越過(guò)種臍，在種仁外側(cè)和種皮內(nèi)側(cè)生長(zhǎng)，未從種臍長(zhǎng)出的根長(zhǎng)度70.09 mm，為種子縱徑長(zhǎng)度的43.53%，為種仁縱徑長(zhǎng)度的70.09%；種子吸水良好，種胚發(fā)育飽滿，未見(jiàn)空癟粒，置床2個(gè)月也未見(jiàn)腐爛種子。從種子解剖結(jié)構(gòu)分析，種子能夠正常吸水，胚能生長(zhǎng)，不存在胚發(fā)育不全的現(xiàn)象，種皮機(jī)械阻力可能是胚不能萌發(fā)的主要原因之一。

2.4 切磨種皮對(duì)種子萌發(fā)的影響

種子用溫水浸泡后，采用刀切或砂紙磨的方法破壞種皮，能使種子在置床的第7天開(kāi)始萌發(fā)，發(fā)芽率和絕對(duì)發(fā)芽率均為17.00%，芽的顏色為暗紅色。但隨著萌發(fā)“芽”的生長(zhǎng)出現(xiàn)2種情況，有13個(gè)百分點(diǎn)的“芽”的顏色一直為暗紅色，有4個(gè)百分點(diǎn)的“芽”先端變?yōu)榇渚G色。

由圖4可看出，在體視鏡下觀察種子2種不同的“芽”，是切磨種皮的部位不同，使種子從切磨口處萌發(fā)的“芽”也不一樣。當(dāng)切磨掉種臍部位的種皮時(shí)，種子萌發(fā)暗紅色的根芽，15 d左右根芽還會(huì)長(zhǎng)出多條側(cè)根，在只補(bǔ)充水的情況下，培養(yǎng)40 d依然正常生長(zhǎng)，移栽可成活，具較強(qiáng)的耐瘠薄特性；當(dāng)切磨掉頂部的種皮時(shí)，種子萌發(fā)暗紅色的莖芽，4～5 d莖芽頂端長(zhǎng)出翠綠色的子葉，但生長(zhǎng)10 d左右出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象。

圖3 未發(fā)芽種子縱切面

圖4 不同切磨部位萌發(fā)圖

2.5 濃硫酸處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

表1表明，不同處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)種子萌發(fā)影響不同，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)。發(fā)芽率由0.00%逐漸升高到處理10 mim的16.00%，之后隨著處理時(shí)間增加逐漸降低到0.00%；絕對(duì)發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)變化趨勢(shì)與發(fā)芽率的類似；而萌發(fā)啟動(dòng)速變化趨勢(shì)與此相反。濃硫酸處理時(shí)間短，對(duì)種皮氧化程度低，不能消除種皮對(duì)胚萌發(fā)的機(jī)械阻力；相反，處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則氧化作用透過(guò)或完全破壞種皮作用到胚乳和胚，降低了胚的活性，且這種負(fù)面影響超過(guò)減輕種皮機(jī)械阻礙的作用，降低了種子的發(fā)芽能力。比較而言，用濃硫酸處理10 mim的種子發(fā)芽率最高。

2.6 濃硫酸與GA3組合處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

表2表明，用濃硫酸處理陰干后再用不同濃度GA3處理東北巖高蘭種子，隨GA3濃度增加種子發(fā)芽率依次為9%、12%、19.75%、9%。GA3濃度≤1 000 mg/L時(shí)，種子的發(fā)芽率隨濃度提高而增加；但達(dá)到1 500 mg/L時(shí)則降低。發(fā)芽指數(shù)的變化趨勢(shì)與發(fā)芽率相同，萌發(fā)啟動(dòng)速度則隨著GA3濃度的增加而增加。胚深度休眠是因?yàn)轶w內(nèi)的生長(zhǎng)抑制劑ABA濃度過(guò)高，GA3、CTK、IAA等激素濃度相對(duì)變低[16]。濃硫酸處理降低了東北巖高蘭種皮造成生理休眠的程度，增加GA3則提高了促進(jìn)種子萌發(fā)激素的濃度，逐漸達(dá)到了種子體內(nèi)生長(zhǎng)抑制劑與萌發(fā)激素的平衡，使種子發(fā)芽率逐漸提高；當(dāng)GA3濃度提高到1 500 mg/L則出現(xiàn)萌發(fā)激素過(guò)剩導(dǎo)致的不平衡，種子發(fā)芽率降低。

表1 濃硫酸處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

處理編號(hào)H2SO4濃度(%)H2SO4處理時(shí)間(min)發(fā)芽率(%)絕對(duì)發(fā)芽率(%)發(fā)芽指數(shù)萌發(fā)啟動(dòng)速度(d)19810.00bcde0.00bcde0.00bcde0bcde29854.00acdf4.00acdf1.48acdef36acdef3981016.00abdef16.00abdef3.03abdef28abdef4981510.00abcef10.00abcef2.23abcef31abcef598203.00acdef3.00acdef1.27abcdf33abcdf698300.00bcde0.00bcde0.00bcde0bcde

注：表中不同小寫字母表示在0.05水平上的顯著相關(guān)。下同。

表2 濃硫酸與GA3組合處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

處理編號(hào)H2SO4濃度(%)H2SO4處理時(shí)間(min)GA3濃度(mg/L)GA3處理時(shí)間(h)發(fā)芽率*(%)絕對(duì)發(fā)芽率*(%)發(fā)芽指數(shù)*萌發(fā)啟動(dòng)速度*(d)19810500129.00bc9.00bc1.54cd15cd298107001211.00acd11.00acd1.77cd15cd3981010001219.75abd19.75abd3.69abd17abd498101500129.00bc9.00bc2.05abc19abc

采用濃硫酸處理10 min和1 000 mg/L GA3處理12 h的種子發(fā)芽率比濃硫酸處理10 min的種子發(fā)芽率高3.75個(gè)百分點(diǎn)，是本實(shí)驗(yàn)最好的催芽方法。

3 討論與結(jié)論

種子的休眠是植物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化和演變獲得一種對(duì)不利環(huán)境及季節(jié)變化的生物學(xué)適應(yīng)性[17]，溫度、水分、通氣和光照是種子萌發(fā)充分的必須條件，光照是部分種子萌發(fā)的必要條件。東北巖高蘭需要較高萌芽初始溫度和適宜的光照才正常萌發(fā)和生長(zhǎng)，溫度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響種子萌發(fā)，表現(xiàn)為萌發(fā)緩慢甚至不發(fā)芽，前者可能與較低溫度導(dǎo)致種子體內(nèi)酶活性降低和新陳代謝減弱有關(guān)，后者可能與高溫導(dǎo)致種子體內(nèi)酶死亡有關(guān)[18]；光照則是種子中的光敏色素通過(guò)光的作用發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)，激發(fā)種子萌發(fā)，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)[19-20]。

赤霉素是一類植物常用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的總稱，用GA3處理種子可增加生長(zhǎng)素的含量，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，加快儲(chǔ)藏物的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)種子萌發(fā)[21]。通常適量GA3處理種子可使新陳代謝強(qiáng)度改變[22]和加速萌發(fā)[23-24]，但高濃度的GA3溶液浸種也可抑制種子萌發(fā)，用GA3溶液浸種云南松[25-26]、沙冬青[27]、藍(lán)靛果忍冬[18]、櫻桃[28]、秀雅杜鵑[29]、歐洲百里香[30]種子，均有這種促進(jìn)或抑制萌發(fā)的現(xiàn)象。東北巖高蘭與上述種子不盡相同，在未進(jìn)行種皮處理前，只用GA3處理種子并沒(méi)有起到催芽的作用，這可能與東北巖高蘭生長(zhǎng)在高寒貧瘠、高太陽(yáng)輻射的惡劣生境下，逐漸與環(huán)境協(xié)同進(jìn)化出現(xiàn)了與這種環(huán)境相適應(yīng)的比較復(fù)雜的生理休眠特性有關(guān)，需要不同催芽方法組合進(jìn)行處理，才能達(dá)到催芽效果，當(dāng)濃硫酸氧化種皮后骨質(zhì)厚實(shí)的種皮變薄，機(jī)械阻力變小，GA3處理種子才起到了一定的催芽效果。這與杜鵑花種子需要GA3分別與超聲波、高溫層積、機(jī)械磨擦等雙重方法對(duì)種子進(jìn)行處理才能更有效地打破休眠促進(jìn)萌發(fā)[16]的結(jié)果類似，這種種子形態(tài)和萌發(fā)特性是植物長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境的表現(xiàn)[31]。GA3是控制種子萌發(fā)的主要激素，可促進(jìn)種子完成生理后熟，打破休眠[32]，但對(duì)于東北巖高蘭種子并未起到明顯促進(jìn)萌發(fā)的作用。

東北巖高蘭種子休眠屬于生理休眠，種皮骨質(zhì)厚實(shí)、種胚較小且萌發(fā)后推動(dòng)力不足，種臍相對(duì)密閉影響胚根伸出，均是種子休眠的主要原因。在種皮不做處理的情況下，單一的20～70 ℃水浸、低溫層積30～90 d、500～1 500 mg/L GA3處理均不能萌發(fā)，切磨種皮或適當(dāng)時(shí)間的濃硫酸浸泡能夠促進(jìn)種子萌發(fā)，且濃硫酸和1 000 mg/L GA3分別浸泡10 min和12 h的種子萌發(fā)率最大；正常萌發(fā)的幼苗具有較強(qiáng)的耐瘠薄性，僅維持水分供應(yīng)可長(zhǎng)出多條側(cè)根，并能移栽成活；種子在氣溫15～35 ℃之間萌發(fā)，25 ℃、12 h光照是最適的萌發(fā)溫光條件。