基于NGS-SNP分型和IBS策略進(jìn)行全同胞關(guān)系鑒定

王致遠(yuǎn)，王迪佳，李燃，李海霞，汪娜娜，孫宏鈺

（1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510089；2.佛山市公安局，廣東 佛山 528000；3.深圳市公安局龍華分局，廣東 深圳 518109）

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）具有突變率低（僅為STR的十萬(wàn)分之一）、擴(kuò)增片段短、數(shù)量豐富等特點(diǎn)，被稱(chēng)為第三代遺傳標(biāo)記[1-3]。但是，由于單個(gè)SNP位點(diǎn)通常只有兩個(gè)等位基因，多態(tài)性較STR相對(duì)低，因此要檢測(cè)更多的SNP位點(diǎn)才能達(dá)到法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定的檢測(cè)需求。SANCHEZ等[4-5]基于傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）技術(shù)開(kāi)發(fā)了包含52個(gè)SNP位點(diǎn)的SNPforID檢測(cè)體系，研究結(jié)果顯示，其可以應(yīng)用于個(gè)體識(shí)別，但是仍然難以滿(mǎn)足親緣關(guān)系分析的要求。

近年來(lái)，大規(guī)模平行測(cè)序（massively parallel sequencing，MPS）技 術(shù) ，又 稱(chēng) 為 高 通 量 測(cè) 序（highthroughput sequencing，HTS）技術(shù)或下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)，發(fā)展迅速，能夠同步檢測(cè)的遺傳數(shù)目增多，檢測(cè)成本降低[6-7]。本課題組前期基于Ion TorrentTM平臺(tái)的HID-Ion AmpliSeqTMIdentity Panel分型體系，探索了90個(gè)常染色體SNP位點(diǎn)在廣東漢族群體的多態(tài)性[8]，本研究擬基于狀態(tài)一致性（identity by state，IBS）分析策略，探索這90個(gè)SNP位點(diǎn)在全同胞關(guān)系分析中的效能。

1 材料與方法

1.1 樣本收集和DNA提取

在知情同意原則下，采集中國(guó)漢族一個(gè)四代家系共35個(gè)成員的血樣，個(gè)體之間關(guān)系如圖1所示。使用AutoMateExpressTMForensic DNA Extraction System（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）提取DNA，并使用 QubitTMdsDNA HS Assay Kit（美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司）在QubitTM3.0熒光定量?jī)x（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）上進(jìn)行DNA定量。另外，根據(jù)本課題組前期研究中的無(wú)關(guān)個(gè)體SNP分型數(shù)據(jù)[8]隨機(jī)組合獲得1000對(duì)無(wú)關(guān)個(gè)體（unrelated individual，UI）。

圖1 本研究對(duì)象的四代家系系譜圖

1.2 常染色體STR分型

采用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）公司］對(duì)23個(gè)常染色體STR基因座進(jìn)行擴(kuò)增，在3500xL基因分析儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）上進(jìn)行檢測(cè)，并使用GeneMapper?ID-Xv1.5軟件（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行STR分型。

1.3 常染色體SNP分型

采用Precision ID Identity Panel（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）和Ion AmpliSeqTMLibrary Kit（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建[8]。該檢測(cè)體系可同時(shí)檢測(cè)90個(gè)常染色體身份信息SNP（identity informative SNP，iiSNP）以及34個(gè)Y-SNP位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物使用Ion ChefTMSystem（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行自動(dòng)化模板制備，應(yīng)用Ion 520TM或 Ion 530TMKit（美 國(guó) Thermo Fisher Scientific公司）在Ion S5TMXL System（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用Torrent SuiteTMv5.2.2軟件（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行分析，同時(shí)結(jié)合HID SNP Genotyper Plugin v4.3.1軟件（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行SNP分型。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對(duì)于家系中的所有父-母-子關(guān)系，根據(jù)23個(gè)常染色體STR的分型結(jié)果，計(jì)算親權(quán)指數(shù)（paternity index，PI），依照行業(yè)技術(shù)規(guī)范[9]，如果累積親權(quán)指數(shù)（combined paternity index，CPI）大于10000，則支持他們之間的親子關(guān)系。基于該家系共獲得全同胞（full sibling，F(xiàn)S）、祖孫（grandparent-grandchild，GG）、叔侄（姨甥）（uncle/aunt-nephew/niece，UN）和第一代堂表親（first cousin，F(xiàn)C）共4種親緣關(guān)系類(lèi)型。參考《生物學(xué)全同胞鑒定實(shí)施規(guī)范》[10]，分別計(jì)算各種關(guān)系類(lèi)型的IBS評(píng)分，采用R語(yǔ)言繪制各關(guān)系類(lèi)型的IBS分布圖[11]。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較全同胞與其他親緣關(guān)系類(lèi)型IBS評(píng)分分布的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。采用SPSS 20.0軟件建立各種關(guān)系的Fisher判別函數(shù)[12]。以待鑒定個(gè)體對(duì)的IBS評(píng)分作為判別因子（S），分別代入相應(yīng)的判別函數(shù)獲得判別評(píng)分L值，并將該對(duì)個(gè)體的關(guān)系類(lèi)型歸為L(zhǎng)值較大的組別。同時(shí)，基于前期研究獲得的頻率數(shù)據(jù)[8]，分別模擬10 000對(duì)4種親緣關(guān)系和無(wú)關(guān)個(gè)體樣本對(duì)。參考《生物學(xué)全同胞關(guān)系鑒定實(shí)施規(guī)范》[10]，對(duì)于待鑒定個(gè)體對(duì)，如果其IBS評(píng)分小于或等于某一閾值（下限值t1），則判定為無(wú)關(guān)個(gè)體；如果大于或等于另一閾值（上限值t2），則判定為對(duì)應(yīng)親緣關(guān)系；如果在t1和t2之間，則無(wú)法判定?；诖嗽O(shè)定探索錯(cuò)判率分別為≤0.01%、≤0.05%、≤0.1%、≤0.5%和≤1%時(shí)的判定閾值以及相應(yīng)的系統(tǒng)效能。

2 結(jié) 果

2.1 SNP測(cè)序概況

對(duì)于該家系的35個(gè)樣本共進(jìn)行了3批測(cè)序，裝載（chip loading）比例分別為62%、70%、73%，富集率（enrichment）分別為93%、95%、95%，單克隆（monoclonal）比例分別為64%、67%、67%，總計(jì)獲得超過(guò)1 400萬(wàn)條序列（reads）。35個(gè)樣本在90個(gè)SNP位點(diǎn)均獲得完整分型，分型率為100%。

2.2 家系成員關(guān)系確認(rèn)

根據(jù)23個(gè)常染色體STR分型結(jié)果對(duì)本研究四代家系中所有的父-母-子關(guān)系進(jìn)行了確認(rèn)，基于該家系樣本可獲得的親緣關(guān)系類(lèi)型及數(shù)量如表1所示。

表1 本研究四代家系樣本的關(guān)系類(lèi)型及數(shù)量

2.3 各類(lèi)親緣關(guān)系的IBS評(píng)分分布

基于該90個(gè)SNP分型結(jié)果，在256對(duì)親緣關(guān)系中，全同胞的平均IBS評(píng)分最高（IBS=148），第一代堂表親的平均IBS評(píng)分最低（IBS=124）。祖孫、叔侄（姨甥）的平均IBS分值分別為130、132。相比之下，無(wú)關(guān)個(gè)體的IBS評(píng)分最低，平均僅為120。各種關(guān)系類(lèi)型的IBS分布情況如圖2所示。

經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，除了祖孫與叔侄（姨甥）的IBS評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.719）外，其余關(guān)系類(lèi)型之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 5種關(guān)系類(lèi)型基于90個(gè)SNP分型的IBS分布

2.4 Fisher判別函數(shù)法進(jìn)行親緣關(guān)系判定

通過(guò)Fisher判別函數(shù)進(jìn)行4種親緣關(guān)系的判定，結(jié)果見(jiàn)表2。其中，全同胞關(guān)系全部被正確評(píng)判為相應(yīng)的親緣關(guān)系，對(duì)于更遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，錯(cuò)判率顯著升高。綜合考慮無(wú)關(guān)個(gè)體的判定結(jié)果，判別函數(shù)法對(duì)全同胞關(guān)系判定的準(zhǔn)確率最高（98.7%），對(duì)第一代堂表親判定的準(zhǔn)確率最低（61.3%）。

表2 基于90個(gè)SNP分型建立的4種關(guān)系判別函數(shù)及分析結(jié)果

2.5 IBS閾值法進(jìn)行親緣關(guān)系判定

基于前期研究，本研究模擬了10000對(duì)4種親緣關(guān)系和無(wú)關(guān)個(gè)體樣本，全同胞的IBS分布情況見(jiàn)圖3。

參考《生物學(xué)全同胞關(guān)系鑒定實(shí)施規(guī)范》[10]，本研究計(jì)算了在不同錯(cuò)判率下各類(lèi)親緣關(guān)系IBS評(píng)分的判定閾值及相應(yīng)的系統(tǒng)效能，結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可以看出，在相同錯(cuò)判率下，全同胞關(guān)系鑒定的系統(tǒng)效能最高，第一代堂表親關(guān)系鑒定效能最低。

圖3 基于90個(gè)SNP分型的全同胞IBS分布

表3 基于90個(gè)SNP分型建立的各種親緣關(guān)系IBS判定閾值及系統(tǒng)效能

另外，可根據(jù)此表靈活選擇判定閾值。以全同胞關(guān)系為例，當(dāng)設(shè)定錯(cuò)判率≤0.05%時(shí)，如果某對(duì)樣本IBS評(píng)分≤128，則判定為無(wú)關(guān)個(gè)體，如果≥141，則判定為全同胞，相應(yīng)的系統(tǒng)效能為0.8814，即88.14%的案例可以獲得明確的鑒定意見(jiàn)。

3 討 論

目前，國(guó)內(nèi)司法系統(tǒng)使用的《生物學(xué)全同胞關(guān)系鑒定實(shí)施規(guī)范》基于STR分型結(jié)果，采用IBS評(píng)分法提出判斷全同胞、無(wú)法判斷、無(wú)關(guān)個(gè)體的標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)效能[10]。相對(duì)于似然比（likelihood ratio）法，IBS評(píng)分法無(wú)需考慮等位基因頻率，只需要根據(jù)等位基因共享情況即可進(jìn)行親緣關(guān)系判定，具有分析直觀、簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)勢(shì)[11，13-15]。另一方面，對(duì)于特殊案例，如高度腐敗或者降解檢材，常常無(wú)法獲得完整STR分型，而SNP由于擴(kuò)增片段短可以獲得完整分型。并且隨著NGSSNP分型體系的日益成熟，將越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親緣鑒定[16]，因此本研究采用Precision ID Identity Panel分型體系對(duì)90個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型，結(jié)合IBS策略探索了該檢測(cè)體系在全同胞關(guān)系鑒定中的應(yīng)用價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，全同胞、祖孫、叔侄（姨甥）和第一代堂表親4種親緣關(guān)系中，除了祖孫與叔侄（姨甥）關(guān)系外，其余關(guān)系類(lèi)型的IBS評(píng)分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且均高于無(wú)關(guān)個(gè)體。祖孫與叔侄（姨甥）的IBS評(píng)分無(wú)顯著差異，可解釋為這兩類(lèi)親緣關(guān)系同屬于二級(jí)親緣關(guān)系，理論上他們之間均共有四分之一的親代遺傳物質(zhì)。另外，隨著親緣關(guān)系的疏遠(yuǎn)，IBS分值逐漸降低。親緣關(guān)系中的第一代堂表親與無(wú)關(guān)個(gè)體的IBS差異最小。

本研究根據(jù)90個(gè)SNP分型數(shù)據(jù)建立了4種親緣關(guān)系的Fisher判別函數(shù)，綜合無(wú)關(guān)個(gè)體的判定結(jié)果后對(duì)全同胞關(guān)系的錯(cuò)判率為1.3%，低于趙書(shū)民等[12]研究中的2.98%。分析原因?yàn)楸狙芯堪?0個(gè)SNP位點(diǎn)相當(dāng)于22個(gè)STR基因座的多態(tài)性[17]，多于趙書(shū)民等研究中采用的Identifiler系統(tǒng)STR數(shù)目（15個(gè)STR）。但是，對(duì)于其他較遠(yuǎn)親緣關(guān)系的錯(cuò)判率較高，尚不能滿(mǎn)足實(shí)踐需求。

此外，由于判別函數(shù)法具有“是”或者“否”的二分類(lèi)特征，不存在無(wú)法判定的“灰色區(qū)域”，系統(tǒng)效能高，但是錯(cuò)判率相對(duì)也較高。本研究采用判別函數(shù)法進(jìn)行全同胞關(guān)系的錯(cuò)判率為1.3%，顯著高于根據(jù)《生物學(xué)全同胞關(guān)系鑒定實(shí)施規(guī)范》及趙書(shū)民等[12-13]研究采用19個(gè)STR和IBS閾值法（t1=13，t2=22）的錯(cuò)判率（≤0.05%）。本研究基于前期獲得的頻率數(shù)據(jù)，模擬了10000對(duì)各種親緣關(guān)系和無(wú)關(guān)個(gè)體，獲得了相應(yīng)的IBS判定閾值。結(jié)果表明，當(dāng)錯(cuò)判率低至0.05%時(shí)，進(jìn)行全同胞鑒定的系統(tǒng)效能為0.881 4，高于采用19個(gè)STR時(shí)的效能（0.75）[10]，提示這90個(gè)SNP可以應(yīng)用于全同胞關(guān)系鑒定。因此，當(dāng)采用這90個(gè)SNP進(jìn)行鑒定時(shí)，推薦使用對(duì)應(yīng)的閾值t1=128、t2=141作為全同胞的判定標(biāo)準(zhǔn)。如果允許的錯(cuò)判率提高，相應(yīng)的系統(tǒng)效能更大。實(shí)際工作中可以根據(jù)需要，選擇不同的標(biāo)準(zhǔn)和閾值進(jìn)行判定，這也顯示了IBS閾值法的靈活性。

值得一提的是，檢測(cè)體系包含的SNP位點(diǎn)數(shù)目越多，對(duì)于各類(lèi)親緣關(guān)系鑒定的鑒別能力以及準(zhǔn)確率越高。KLING等[18-19]應(yīng)用高密度SNP芯片技術(shù)檢測(cè)了超過(guò)90萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)，以共有等位基因數(shù)目作為判定參數(shù)，發(fā)現(xiàn)可以區(qū)分至第二代堂兄弟（姐妹）的關(guān)系。這也顯示了SNP遺傳標(biāo)記和IBS策略在親緣關(guān)系鑒定中的應(yīng)用潛力，本研究下一步擬基于更大數(shù)量的實(shí)驗(yàn)樣本和實(shí)際案例進(jìn)行驗(yàn)證。