洛陽地區(qū)9種嗜尸性麗蠅28S rRNA和COⅠ基因序列分析

趙琳琳，翟仙敦，鄭哲，呂宙，李永林，莫耀南

（1.河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471003；2.西南政法大學(xué)刑事偵查學(xué)院，重慶 400031）

采用法醫(yī)昆蟲學(xué)（forensic entomology）的方法進行死亡時間（postmortem interval，PMI）推斷有重要意義[1]。機體死后不同階段，到達尸體上的嗜尸性昆蟲種類不同，呈現(xiàn)較強的演替規(guī)律。麗蠅往往是第一批到達尸體并產(chǎn)卵的嗜尸性昆蟲，但麗蠅種類繁多，需要積累更多的基因資源來進行鑒定研究。本研究通過細胞核28S核糖體核糖核酸（ribosomalribonucleic acid，rRNA）和線粒體細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunitⅠ，COⅠ）基因?qū)β尻柕貐^(qū)常見嗜尸性麗蠅進行分子鑒定，以期作為形態(tài)學(xué)鑒定的重要方法補充，并完善嗜尸性麗蠅的鑒定系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 蠅類樣本采集

于2016年6月—2017年5月，誘捕采集放置于河南科技大學(xué)（洛陽）室外樹蔭下大鼠尸體上的嗜尸性麗蠅。共捕捉到3只絲光綠蠅Lucilia sericata（Meigen，1826）、3 只大頭金蠅Chrysomya megacephala（Fabricius，1794）、2 只銅綠蠅Lucilia cuprina（Wiedemann，1830）、2 只叉麗蠅Triceratopyga calliphoroides（Rohdendorf，1931）、3 只 反 吐 麗 蠅Calliphora vomitoria（Linnaeus，1758）、3只巨尾阿麗蠅Aldrichina grahami（Aldrich，1930）、1只叉葉綠蠅Lucilia caesar（Linnaeus，1758）、3只亮綠蠅Lucilia illustris（Meigen，1826）、3只紫綠蠅Lucilia porphyrina（Walker，1856）。微量離心管分類單獨密封包裝后置于-20℃冰箱中保存。依據(jù)《中國常見蠅類檢索表》進行形態(tài)學(xué)種類鑒定，并經(jīng)專家再次確認。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

每個樣本取腿4條，清洗、搗碎，用MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（日本TaKaRa公司）提取腿部DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆?。剩余樣本組織裝回原微量離心管，冷凍保存。

1.2.2 PCR擴增

采 用Premix TaqTM（TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye）試劑盒（日本TaKaRa公司）對28S rRNA基因中的目的片段和COⅠ基因經(jīng)典DNA條形碼引物（LCO1490/HCO2198）進行擴增。28S rRNA基因的擴增引物為：上游引物5′-GACTACCCCCTGAATTT AAGCAT-3′，下游引物 5′-GACTCCTTGGTCCGTGT TTCAAG-3′。

擴增總體系為 50 μL，內(nèi)含 2×Premix Taq溶液（含DNA聚合酶、緩沖液、dNTP混合液）25μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，DNA模板6 μL，ddH2O補足。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性1 min；94℃ 1 min，45℃ 1.5 min，72℃ 1.5 min，5個循環(huán)；94℃ 1 min，50℃ 1.5 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃延伸8min。擴增產(chǎn)物于4℃保存。

1.2.3 電泳檢測及測序分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（120V，30min），溴化乙錠染色，置于凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

測序引物為PCR擴增引物，擴增產(chǎn)物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序，正反向雙向測序以保證序列的準確性。應(yīng)用MEGA 7.0軟件將所測23個樣本的基因序列進行整理，在BLAST搜索（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列比對。經(jīng)MEGA 7.0軟件比對，剪切為相同長度，然后按鄰近法（neighbor-joining，NJ）對序列進行堿基組成、進化分歧率和系統(tǒng)發(fā)育樹分析（以家蠅為外群），Bootstrap值為1000。

2 結(jié) 果

本研究共獲得5屬9種23個麗蠅樣本的DNA，擴增產(chǎn)物使用分析軟件剪去引物和雜帶后，余下序列長度分別為715bp和637bp。

2.1 BLAST比對結(jié)果

28S rRNA和COⅠ基因序列的BLAST比對結(jié)果（表1～2）顯示，所得樣本DNA與GenBank中已知序列相似度較高（≥99%），與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相符，但28S rRNA序列比對結(jié)果中沒有一致的叉麗蠅、巨尾阿麗蠅和紫綠蠅的基因序列，檢索GenBank后亦未發(fā)現(xiàn)。

2.2 堿基組成分析

對所得23個樣本的28S rRNA基因進行堿基組成分析，結(jié)果顯示：保守位點678個，可變位點36個，其中簡約性信息位點36個，自裔位點0個。堿基平均組成：A=34.1%，G=18.4%，C=13.2%，T=34.2%，A+T=68.3%，具有明顯的A+T傾向性。

對所得23個樣本的COⅠ基因進行堿基組成分析，結(jié)果顯示：保守位點523個，可變位點114個，其中簡約性信息位點112個，自裔位點2個。堿基平均組成：A=30.6%，G=15.7%，C=15.8%，T=37.8%，A+T=68.4%，具有明顯的A+T傾向性。

表1 麗蠅科23個樣本28S rRNA基因序列在線BLAST比對結(jié)果

表2 麗蠅科23個樣本COⅠ基因序列在線BLAST比對結(jié)果

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以家蠅（28SrRNA的GenBank登錄號為KC177822.1，COⅠ的GenBank登錄號為KF562113.1）為外群，GenBank中叉葉綠蠅的28S rRNA和COⅠ序列各兩條納入一并分析，運用MEGA 7.0軟件對25個樣本的基因序列進行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果按照不同屬、種分別聚類，分子鑒定結(jié)果和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致（圖1），效果較好。

28S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示：按照不同屬種分別聚類，共5屬9種，自上而下3只亮綠蠅、3只叉葉綠蠅、3只紫綠蠅、2只銅綠蠅、3只絲光綠蠅、2只叉麗蠅、3只巨尾阿麗蠅、3只反吐麗蠅、3只大頭金蠅分別聚類，Bootstrap檢驗可信度分別為64%、93%、85%、97%、99%、64%、65%、64%和99%，綠蠅屬的Bootstrap檢驗可信度為93%。

COⅠ基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示：按照不同屬種分別聚類，共5屬9種，自上而下3只叉葉綠蠅、3只亮綠蠅、3只紫綠蠅、2只銅綠蠅、3只絲光綠蠅、3只巨尾阿麗蠅、2只叉麗蠅、3只反吐麗蠅、3只大頭金蠅分別聚類，Bootstrap檢驗可信度分別為100%、98%、100%、85%、95%、100%、100%、100%和100%，綠蠅屬的Bootstrap檢驗可信度為82%。

2.4 種內(nèi)及種間進化分歧

經(jīng)計算本研究中麗蠅科5屬9種蠅類28S rRNA和COⅠ基因的遺傳距離發(fā)現(xiàn)：不同蠅種28S rRNA基因序列種內(nèi)差異為0，叉麗蠅、反吐麗蠅和巨尾阿麗蠅，叉葉綠蠅和亮綠蠅的種間差異均為0.001，叉麗蠅和反吐麗蠅，叉葉綠蠅和紫綠蠅的種間差異均為0.003，亮綠蠅和紫綠蠅的種間差異為0.004，絲光綠蠅和銅綠蠅的種間差異為0.008，其余種間差異為0.014～0.033；COⅠ基因序列種內(nèi)差異為0～0.008，絲光綠蠅和銅綠蠅的種間差異為0.006～0.009，叉葉綠蠅和亮綠蠅的種間差異為0.011/0.013，其余種間差異為0.037～0.101。詳見表3～4。

圖1 基于25個樣本28S rRNA和COⅠ基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 25個樣本28S rRNA基因序列的種間差異和種內(nèi)差異

表4 25個樣本COⅠ基因序列的種間差異和種內(nèi)差異

3 討 論

法醫(yī)昆蟲學(xué)中與PMI關(guān)系最為密切的是雙翅目蠅類，主要包括以麗蠅科為代表的17科，有數(shù)百種嗜尸性蠅類[3]，而利用嗜尸性蠅類推斷PMI的首要任務(wù)就是鑒定其種類。作為尸體上發(fā)育最早的昆蟲，麗蠅科蠅種為實際案例應(yīng)用中涉及最多的昆蟲種類，常為推斷PMI提供依據(jù)，是法醫(yī)昆蟲學(xué)中最有意義的種類。河南省地處中原，位于暖溫帶與亞熱帶，有記錄的嗜尸性麗蠅多達14種之多[4]。鑒于案發(fā)現(xiàn)場提取的蠅類樣本的多樣性和復(fù)雜性，對于非昆蟲專業(yè)人員很難從形態(tài)學(xué)鑒定其種屬，尤其對蒼蠅幼蟲、蛹、卵生長發(fā)育規(guī)律的把握和形態(tài)學(xué)的鑒定，更是難上加難。自SPERLING等[5-6]將以DNA為基礎(chǔ)的方法用于嗜尸性昆蟲種類鑒定后，作為形態(tài)學(xué)鑒定方法的補充手段，DNA分子鑒定被越來越多的法醫(yī)昆蟲學(xué)研究者所接受。

線粒體COⅠ基因在動物學(xué)領(lǐng)域被作為種屬遺傳標記建立方法[7]后，因其具有拷貝數(shù)高、易分離、高保守性結(jié)構(gòu)等特點，已被應(yīng)用于法醫(yī)昆蟲學(xué)領(lǐng)域。而其中的DNA條形碼區(qū)域序列測定被證實有益于各地雙翅目的種屬分子鑒定[8-12]。核基因28S rRNA具有重要的生物學(xué)功能，是真核生物染色體上編碼核糖體大亞基的基因，在進化上比較保守，是研究生物系統(tǒng)發(fā)育較好的分子標記[13]。有學(xué)者提出，為提高種屬鑒定的準確性，開發(fā)更多的遺傳標記是一種可以選擇的策略[12，14]。相較于線粒體COⅠ基因，嗜尸性蠅類28S rRNA基因研究較少。

本研究中9種23只麗蠅，基于28S rRNA和COⅠ基因序列的分子鑒定結(jié)果均與形態(tài)學(xué)鑒定分類結(jié)果一致。COⅠ序列種內(nèi)差異為0～0.008，絲光綠蠅和銅綠蠅的種間差異為0.006～0.009，叉葉綠蠅和亮綠蠅的種間差異為0.011/0.013，其余種間差異為0.037～0.101。WELLS等[15]對麗蠅科mtDNA進行了測序及系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)COⅠ+COⅡ種間差異≥3%，而種內(nèi)差異＜1%，由此根據(jù)COⅠ+COⅡ基因序列差異來判斷麗蠅個體是否同種。按照此理論分析，本研究中COⅠ基因序列不能有效區(qū)分絲光綠蠅和銅綠蠅，叉葉綠蠅和亮綠蠅，而在其他蠅種之間均可有效區(qū)分。28S rRNA基因序列分析發(fā)現(xiàn)，叉麗蠅、反吐麗蠅和巨尾阿麗蠅，叉葉綠蠅和亮綠蠅的種間差異均為0.001，叉麗蠅和反吐麗蠅，叉葉綠蠅和紫綠蠅的種間差異均為0.003，亮綠蠅和紫綠蠅的種間差異為0.004，絲光綠蠅和銅綠蠅的種間差異為0.008，其余種間差異為0.014～0.033，其中只有大頭金蠅和絲光綠蠅、銅綠蠅，絲光綠蠅和反吐麗蠅、巨尾阿麗蠅的種間差異≥3%，同理只可有效區(qū)分這些蠅種。

與COⅠ基因序列相比，28S rRNA基因序列種內(nèi)、種間差異均較小，提示此現(xiàn)象與該基因序列本身關(guān)系較為密切。根據(jù)FRéZAL等[16]的理論，用來界定物種種內(nèi)、種間差異的值并非是一個定值，而應(yīng)該根據(jù)實際情況加以修正。本研究中采用的28S rRNA基因序列種內(nèi)、種間差異值的確定需要進一步研究和驗證。值得注意的是，在COⅠ基因序列種間差異整體明顯大于28S rRNA基因序列的情況下，絲光綠蠅和銅綠蠅的種間差異卻與28S rRNA基因序列非常接近，因此推測對于區(qū)分近緣關(guān)系的絲光綠蠅和銅綠蠅，28S rRNA基因序列鑒定效力可能優(yōu)于COⅠ基因序列，這有待于更多樣本的驗證。BLAST在線比對過程中沒有發(fā)現(xiàn)一致的叉麗蠅、巨尾阿麗蠅和紫綠蠅的28S rRNA基因序列，說明該蠅種的相關(guān)研究較少，而本研究可以為此提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

WELLS等[15]認為，分子鑒定即使不能夠準確確定某一特定嗜尸性蠅種，至少可以把未知蠅種定位于某一特定的進化分支上。本研究中部分蠅種即使不能根據(jù)種內(nèi)、種間差異來確定和區(qū)分，但所有樣本均位于某一特定的分支上，Bootstrap檢驗可信度較高，并且兩種分子標記系統(tǒng)發(fā)育分類一致，起到了很好的驗證和補充作用。

綜上所述，聯(lián)合28S rRNA和COⅠ基因序列片段可以較好地區(qū)分本研究中的9種嗜尸性麗蠅，但對于近緣種絲光綠蠅和銅綠蠅，叉葉綠蠅和亮綠蠅的判定需要更多遺傳標記的開發(fā)和聯(lián)合應(yīng)用。