黃桷樹葉黃酮的提取純化及抗BV-2細(xì)胞炎性活化的作用研究

賴 鳳，李琪瑩，楊蕊菡，高潔瑩，肖 虹 ，賈 燕，汪 洋，白群華△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，重慶 400016；2.重慶美華友好醫(yī)院有限公司，重慶 400011；3.新疆維吾爾自治區(qū)昌吉州人民醫(yī)院 831100；4.重慶醫(yī)科大學(xué)實驗教學(xué)中心，重慶 401331)

黃桷樹又名大葉榕，為?？崎艑俑叽舐淙~喬木，普遍生長于中國南部和西南部，其根葉在這些地區(qū)民間經(jīng)驗用藥比較常見[1]。但現(xiàn)代對黃桷樹的藥用價值研究不多，對其有效成分和藥理活性，尚未見系統(tǒng)、科學(xué)的研究報道。黃酮類物質(zhì)具有較高的生物活性，在食品工業(yè)中，黃酮類作為抗氧化劑，能夠阻遏食物氧化作用引起的氧化腐敗[2-3]；在醫(yī)學(xué)上，黃酮類具有抗炎和抗氧化作用，在治療冠心病、老年性癡呆、腦血栓、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等方面有一定的效果，且不良反應(yīng)較少[4-5]。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)黃桷樹葉中含有大量黃酮類物質(zhì),其粗提物具有保護A549細(xì)胞氧化損傷的作用[6-7]。本研究進一步研究了黃桷樹葉黃酮的提取、純化方法，并利用BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)炎性活化的細(xì)胞模型，探討純化產(chǎn)物的抗炎作用。

1 材料與方法

1.1材料 黃桷樹葉采自重慶醫(yī)科大學(xué)校園內(nèi)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所；AB-8大孔吸附樹脂購自北京索萊生物科技有限公司；BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞來源于重慶醫(yī)科大學(xué)分子遺傳教研室；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；一氧化氮(nitric oxide,NO)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；小鼠白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；LPS、二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自Sigma公司；其他試劑全部為分析純，購自商業(yè)試劑公司。

1.2黃酮純化物的制備

1.2.1黃桷樹葉總黃酮的提取與黃酮含量的測定 參考文獻(xiàn)[8]，將新采集的黃桷樹葉洗凈、晾干、剪碎并冷凍干燥、打成粉后，使用不同濃度乙醇于25 ℃浸提不同時間，浸提液經(jīng)紗布過濾后，用三氯甲烷以1∶3的比例萃取2次，取上層黃色液體經(jīng)硅藻土絮凝后，3 500 r/min離心1 h的上清液為提取液。然后將提取液以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法對提取液中總黃酮進行定量[9-10]。

1.2.2AB-8大孔樹脂對黃酮提取物的純化 AB-8大孔樹脂的預(yù)處理：按5.0 g大孔樹脂加入20.0 mL 50%乙醇的比例完全浸泡，靜置24 h后備用。

AB-8大孔樹脂對提取物黃酮的吸附能力的靜態(tài)測定：稱取5.0 g濕大孔樹脂，加入黃酮濃度為C1 mg/mL的黃桷樹葉提取物溶液20.0 mL，室溫振蕩24 h后，測量溶液中剩余的黃酮濃度，記為C2 mg/mL，按下式計算AB-8大孔樹脂(g)對提取物黃酮(mg)的吸附能力A：

A=(C1-C2)×20/5

(1)

乙醇對AB-8大孔樹脂吸附的黃酮的解吸能力的測定：將上述5.0 g已吸附黃酮的大孔樹脂，用濾紙吸干表面液體后，加入一定濃度的乙醇20.0 mL，室溫振蕩24 h后，測量該乙醇溶液中黃酮濃度，記為C3 mg/mL，按下式計算該濃度乙醇的黃酮洗脫能力B：

B(%)=[C3/(C1-C2)]×100%

(2)

純化柱的準(zhǔn)備：將預(yù)處理過后的大孔樹脂進行濕法裝柱，柱長30.0 cm，直徑為3.0 cm；然后用50%乙醇200.0 mL以每秒1滴的速度進行洗柱，再以相同的速度用100.0 mL蒸餾水洗柱；洗柱完成后準(zhǔn)備上樣。

提取物上樣液的制備：提取液于真空冷凍干燥機中，先在常溫下抽真空揮去乙醇，再于-50 ℃，20 Pa以下抽真空除去水分進行濃縮，然后測定濃縮液的黃酮濃度；再根據(jù)上述大孔樹脂對提取物黃酮的吸附能力，確定濃縮提取液的上樣量。

提取物的純化：將濃縮的提取液加入純化柱后，靜置24 h，再以100.0 mL蒸餾水洗柱，然后用最佳濃度的乙醇洗脫，待流出液顏色由無色變?yōu)橛猩珪r，開始以2.0 mL每管的體積進行收集至流出液無色。然后對收集的各留分進行黃酮濃度的測定，并對部分黃酮濃度較高的留分經(jīng)真空冷凍干燥至固體后，使用天秤稱取干燥后物質(zhì)的質(zhì)量；然后再以蒸餾水溶解干燥物，并測量其中黃酮的濃度；再以此計算各留分黃酮的純度。

1.3黃酮純化物的抗炎活性測定

1.3.1BV-2細(xì)胞LPS炎性活化模型的建立 BV-2細(xì)胞于含10% 滅活FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中于37 ℃，5% CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期時用0.125%的胰酶消化傳代。細(xì)胞接種培養(yǎng)16 h貼壁后進行相應(yīng)的藥物處理。LPS以DMSO溶解后，用DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度處理細(xì)胞；黃酮純化物用DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度處理細(xì)胞。再根據(jù)細(xì)胞活力試驗結(jié)果，選擇最佳的LPS和黃酮純化物的干預(yù)濃度。

1.3.2細(xì)胞活力的測定(CCK-8法) BV-2細(xì)胞以每孔3 000個，100.0 μL體積接種于96孔培養(yǎng)板中。藥物處理至預(yù)定時間后，每孔加入10.0 μL的CCK-8溶液，孵育2 h，待培養(yǎng)基顏色變深，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。以空白對照組為標(biāo)準(zhǔn)計算細(xì)胞存活率。計算細(xì)胞存活率公式為：

細(xì)胞存活率(%)=藥物處理組吸光度值/ 空白對照組吸光度值×100%

(3)

1.3.3細(xì)胞形態(tài)的觀察 BV-2細(xì)胞以每孔3萬個接種于24孔培養(yǎng)板細(xì)胞爬片上。藥物處理至預(yù)定時間后，用40.0 g/L多聚甲醛固定10 min，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.4細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO水平的測定 BV-2細(xì)胞以每孔30萬個接種于6孔培養(yǎng)板。藥物處理至預(yù)定時間后，收集上清液，3 000 r/min離心2 min后，以Griess試劑法測定培養(yǎng)上清液中的NO水平。

A:不同濃度乙醇對春季黃桷樹葉中黃酮的提取效率；*:P<0.05,與50%乙醇提取組比較；B:50%乙醇不同提取時間對春季黃桷樹葉中黃酮的提取效率；*:P<0.05，與20 min的乙醇提取組比較；C:春、夏、秋季黃桷樹葉中總黃酮的提取效率；*：P<0.05，與春季黃桷樹葉比較

A:不同濃度乙醇對AB-8大孔樹脂吸附的黃酮的解吸效率；*：P<0.05，與70%乙醇洗脫組比較；B:70%乙醇解吸黃酮時不同留分的黃酮的含量；*：P<0.05，與留分4比較；C:70%乙醇解吸黃酮時不同留分的黃酮純度；*：P<0.05，與留分6比較

1.3.5細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β水平的測定 BV-2細(xì)胞以每孔30萬個接種于6孔培養(yǎng)板。藥物處理至預(yù)定時間后，收集上清液，3 000 r/min離心2 min，取50.0 μL于96孔板，按酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定試劑盒說明書操作測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-1β水平。

2 結(jié) 果

2.1黃桷樹葉總黃酮的提取 25.0 g春季黃桷樹葉粉末分別經(jīng)30%、50%、70%、90%乙醇溶液在25 ℃下提取3 h，再經(jīng)萃取、絮凝、離心后，對得到的提取液進行黃酮濃度的測定，并計算總黃酮的提取效率。結(jié)果顯示(圖1A)，50%乙醇具有最高的總黃酮提取效率。

使用50%乙醇按上述方法，對春季黃桷樹葉進行了15 min，20 min，30 min，1 h，1.5 h，2 h，2.5 h，3 h，6 h，12 h共10個時間的提取，結(jié)果(圖1B)顯示，使用50%乙醇提取20 min，對黃桷樹葉中總黃酮具有最高提取率，可以達(dá)到(8.29±0.12)%。

將春、夏、秋3個季節(jié)采摘的黃桷樹葉于50%乙醇進行了30 min浸提，結(jié)果(圖1C)顯示，其提取效率分別為(7.98±0.16)%、(5.50±0.15)%、(3.47±0.17)%，故后續(xù)實驗選用黃酮提取效率最高的春季黃桷樹葉為提取純化對象。

2.2黃桷樹葉黃酮成分的純化 本研究利用AB-8大孔樹脂吸附和乙醇解吸進行黃酮提取效率最高的黃桷樹葉黃酮提取液中黃酮成分的純化。

2.2.1確定AB-8大孔樹脂純化時的最佳上樣量 首先測定了樹脂對提取物中黃酮的靜態(tài)吸附能力。結(jié)果測得AB-8大孔樹脂對提取物中黃酮的吸附能力為(1.26±0.14)mg/g。

2.2.2確定AB-8大孔樹脂純化時的最佳乙醇解吸濃度 本研究用30%、50%、70%、90%的乙醇分別對吸附黃酮的大孔樹脂進行洗脫，研究結(jié)果顯示(圖2A)，70%乙醇的解吸率為(79.1±1.7)%，與90%乙醇解吸率[(82.3±1.5)%]比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。且由于90%乙醇洗脫時有較多氣泡產(chǎn)生，干擾洗脫，故選用70%乙醇作為解吸劑。

2.2.3測定70%乙醇對大孔樹脂吸附黃酮的洗脫效果 本研究將7.35 mL濃縮提取液(含黃酮367.5 mg)上樣于處理好的AB-8大孔樹脂柱后，以70%乙醇進行洗脫，每2.0毫升為一留分收集洗脫液，并測量每留分的黃酮含量(圖2B)。結(jié)果顯示，洗脫時出峰較快，留分3、4、5、6、7均具有較高的黃酮含量，每留分為20～50 mg，其中留分4含量最高，為(52.6±0.62)mg。

2.2.4測定大孔樹脂對黃桷樹葉總黃酮的純化效果 將按以上方法得到的留分4、留分6、留分8分別測定計算了各留分的黃酮純度。實驗結(jié)果(圖2C)顯示，AB-8大孔樹脂對黃桷樹葉總黃酮具有較好的純化效果，留分4～8的黃酮純度可達(dá)到61%～88%，其中留分6具有最高的黃酮純度，為(88.45±1.55)%，且黃酮的濃度也較高，故將留分6用于后續(xù)的分析測試。

A：LPS對BV-2細(xì)胞活力的影響；CON:空白對照組；DMSO:DMSO對照組；L1～L100:LPS 1.0～100.0 mg/L處理24 h。B：黃酮純化物對BV-2細(xì)胞活力的影響；H20～H640:20.0～640.0 mg/L黃酮純化物處理24 h；*：P<0.05，與CON組比較

2.3黃酮純化物對BV-2細(xì)胞LPS炎性活化的影響

2.3.1黃酮純化物與LPS對BV-2細(xì)胞活力的影響 為了建立有效的實驗?zāi)Ｐ?，首先分析LPS和黃酮純化物在實驗條件下對細(xì)胞活力的直接影響，以排除藥物的細(xì)胞毒性對模型的干擾。結(jié)果顯示，不同濃度LPS(1.0～100.0 mg/L)作用于BV-2細(xì)胞24 h，與DMSO組和CON組相比，LPS(1.0～10.0 mg/L)對細(xì)胞活力無明顯影響(圖3A)；不同濃度黃酮純化物(20.0～640.0 mg/L)作用BV-2細(xì)胞24 h，與CON組相比，濃度在20.0～320.0 mg/L范圍對細(xì)胞活力無明顯影響(圖3B)，此藥物濃度以內(nèi)可用于后續(xù)實驗研究。

A：LPS處理24 h對BV-2細(xì)胞培養(yǎng)液中NO水平的影響；CON:空白對照組；L0.1～L10:0.1～10.0 mg/L LPS處理組。B：黃酮純化物處理24 h組對BV-2細(xì)胞培養(yǎng)液中NO水平的影響;CON:空白對照組；L：1.0 mg/L LPS處理組；H20、H50:20.0、50.0 mg/L黃酮純化物處理組。#：P<0.05，與CON組比較；*：P<0.05，與L組比較

A:空白對照組;B:20.0 mg/L黃酮純化物處理組;C:50.0 mg/L黃酮純化物處理組;D:1.0 mg/L LPS處理組;E:1.0 mg/L LPS與20.0 mg/L黃酮純化物處理組;F:1.0 mg/L LPS與50.0 mg/L黃酮純化物處理組

圖5 黃酮純化物與LPS處理24 h對BV-2細(xì)胞形態(tài)的影響

2.3.2BV-2細(xì)胞LPS炎性活化模型的建立及純化物對模型炎性活化時NO生成的影響 為了建立有效的BV-2細(xì)胞LPS炎性活化模型，將0.1、1.0、10.0 mg/L 3個不同濃度的LPS分別作用于BV-2細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示(圖4A)，LPS濃度為1.0、10.0 mg/L時可明顯升高細(xì)胞培養(yǎng)液中NO水平(P<0.01)，其中1.0 mg/L的LPS，使培養(yǎng)液中的NO水平由CON組的(0.11±0.01)μg/mL增加至(1.24±0.03)μg/mL。因此，運用1 mg/L的LPS可建立有效BV-2細(xì)胞的炎性活化模型。

將黃酮純化物和LPS(1.0 mg/L)單獨或同時作用于BV-2細(xì)胞24 h后，結(jié)果顯示(圖4 B)，1.0 mg/L的LPS加用20.0 mg/L和50.0 mg/L黃酮純化物即能顯著抑制LPS單獨作用時導(dǎo)致的胞外NO的產(chǎn)生，使培養(yǎng)液中的NO水平由LPS單獨作用時的(1.15±0.27)μg/mL降低至加用20.0 mg/L黃酮純化物的(0.77±0.14)μg/mL(P<0.05)和加用50.0 mg/L黃酮純化物時的(0.34±0.07)μg/mL(P<0.05)。

2.3.3黃酮純化物對LPS活化BV-2細(xì)胞形態(tài)的影響 使用黃酮純化物(20.0、50.0 mg/L)及1.0 mg/L LPS單獨或同時處理BV-2細(xì)胞24 h，對其形態(tài)的影響見圖5。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，黃酮純化物單獨作用時，20.0、50.0 mg/L的濃度對BV-2細(xì)胞形態(tài)無明顯影響(圖5B、C)；1.0 mg/L LPS單獨作用時明顯導(dǎo)致了細(xì)胞胞體增大，有較多突起(圖5D)。當(dāng)1.0 mg/L LPS 加用黃酮純化物處理細(xì)胞時，則黃酮純化物20.0、50.0 mg/L的濃度均明顯使伸長的細(xì)胞突起回縮變短且胞體變圓。

2.3.4黃酮純化物對LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞IL-1β產(chǎn)生的影響 本研究測定了黃酮純化物(20.0、50.0 mg/L)及1 mg/L LPS單獨或同時處理BV-2 24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β的水平(圖6)。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，20.0 mg/L與50.0 mg/L黃酮純化物單獨處理時IL-1β水平無明顯變化，而1.0 mg/L LPS單獨處理時IL-1β水平則由空白對照組的(34.32±4.24)pg/mL增加至(184.41±19.33)pg/mL(P<0.05)；而LPS加用20.0 mg/L與50.0 mg/L黃酮純化物處理后，IL-1β水平則分別降至(116.64±9.69)pg/mL(P<0.05)和(70.13±8.17)pg/mL(P<0.05)。

CON:空白對照組；L：1.0 mg/L LPS處理組；H20、H50:20.0 mg/L與50.0 mg/L黃酮純化物處理組。#：P<0.05，與CON組比較，*：P<0.05，與L組比較

3 討 論

在黃桷樹葉總黃酮的提取中，乙醇浸提法是常用的方法，提取的乙醇濃度和提取時間是影響提取效率的重要因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用50%乙醇提取20 min具有最高的提取效率，隨著乙醇濃度增加和提取時間延長，提取效率反而下降。這可能是由于隨著乙醇濃度增加和提取時間延長，增加了其他雜質(zhì)的溶出，而雜質(zhì)妨礙了黃酮的溶出并影響了黃酮結(jié)構(gòu)的完整性。而在此條件下，總黃酮的最高提取效率可達(dá)到8.29%，說明黃桷樹葉總黃酮含量非常豐富，具有較高的開發(fā)利用價值。在民間，常采摘春季嫩葉作為食用和藥用；而本研究對不同季節(jié)樹葉的黃酮提取率進行測定，春、夏、秋分別為7.98%、5.5%、3.47%，說明季節(jié)對其黃酮含量的影響很大，春季樹葉具有最高的含量，最具有開發(fā)價值。在對黃桷樹葉黃酮成分的純化中，AB-8大孔樹脂吸附和乙醇解吸是常用的方法。本研究表明，AB-8大孔樹脂對提取物中黃酮的吸附能力可以達(dá)到(1.26±0.14)mg/g，具有較高的吸附能力。而乙醇洗脫方面，隨著乙醇的濃度增加，洗脫能力增加，但70%乙醇的解吸效果為79.1%，與90%乙醇解吸率(82.3%)相當(dāng)，說明AB-8大孔樹脂吸附易被乙醇解吸。而用AB-8大孔樹脂柱對提取的黃酮進行純化時，發(fā)現(xiàn)70%乙醇洗脫時，黃酮出峰很快，但黃酮含量最高的留分其雜質(zhì)含量也高，如黃酮含量最高的留分4(含黃酮52.6 mg)及其后收集的留分6(含黃酮28.7 mg)的黃酮純度分別為61.05%、88.95%。文獻(xiàn)[11]顯示，用AB-8大孔樹脂進行分離純化時，上樣液的pH值、上樣流速、洗脫液體積分?jǐn)?shù)等也可對純化效率有一定的影響，故需進一步優(yōu)化AB-8大孔樹脂的純化條件，提高黃酮的純化效率。

黃桷樹為榕屬植物，雖然至今已從本屬植物中分離到降血糖、降血壓、抗腫瘤、抗菌、抗瘧的單體成分[12]，證實具有治療腹瀉、關(guān)節(jié)炎、抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)記憶、焦慮、癲癇的作用[1]，但黃桷樹葉的藥效成分還未見報道。因抗炎活性是黃酮類的重要藥用功效，本研究利用BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞LPS炎性活化的細(xì)胞模型，初步研究了其黃酮純化物的抗炎活性。小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的巨噬細(xì)胞來源的免疫細(xì)胞，當(dāng)其發(fā)生炎性活化時，可通過產(chǎn)生大量的毒性因子包括NO和促炎細(xì)胞因子(如IL-1β、腫瘤壞死因子-α)等,促進神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[13-14]。

研究結(jié)果表明，所得到的黃酮純化物能夠明顯抑制LPS導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的活化和炎性相關(guān)因子NO、IL-1β的分泌，提示黃桷樹葉黃酮可能具有良好的抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎性活化的作用，可能在防治帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病中具有良好的應(yīng)用前景。但本研究所用的黃酮純化物仍然含有一定量的雜質(zhì)，且黃酮的種類很多，需要進一步結(jié)合多種分離純化方法，得到高純度的成分，并結(jié)合使用質(zhì)譜、多種光譜技術(shù)，鑒定其確切的成分，再進行進一步的藥理活性研究，以明確其確切的抗炎藥效成分，并進行進一步的藥效與機制的研究，為進一步研究開發(fā)打下基礎(chǔ)。