大孔吸附樹(shù)脂分離純化薰衣草中迷迭香酸

熊天真， 管政兵， 廖祥儒， 蔡宇杰

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

迷迭香酸在許多種植物中均有分布，主要分布于唇形科、紫草科和傘形科植物[1]。袁干軍等采用大孔吸附樹(shù)脂的方法從迷迭香中分離得到迷迭香酸[2]，歐余航等也從九節(jié)茶浸膏中分離得到迷迭香酸[3]。迷迭香酸有預(yù)防許多疾病的發(fā)生、保護(hù)心腦血管循環(huán)系統(tǒng)[4]、抗氧化[5]、抗癌[6]、抗炎、抗過(guò)敏[7]等生理作用，在食品、化妝品、醫(yī)藥等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。目前薰衣草中含有迷迭香酸已有文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]，但是對(duì)薰衣草中迷迭香酸的提取與純化工藝還鮮有報(bào)道。因此，對(duì)薰衣草中迷迭香酸純化工藝進(jìn)行研究，能夠?yàn)樯a(chǎn)迷迭香酸帶來(lái)新途徑。

大孔吸附樹(shù)脂是一類(lèi)不含交換基團(tuán)且具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大比表面積的高分子吸附樹(shù)脂，能夠選擇性吸附水溶液中的物質(zhì)[10]。大孔吸附樹(shù)脂應(yīng)用于很多種天然產(chǎn)物的分離[11-12]。因?yàn)榭芍貜?fù)使用且價(jià)格低廉的大孔吸附樹(shù)脂能夠使天然產(chǎn)物得到高效分離，使其非常適合應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)[13-14]。為此，作者采用大孔吸附樹(shù)脂法對(duì)薰衣草中迷迭香酸分離純化工藝進(jìn)行研究，為開(kāi)發(fā)利用薰衣草資源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于春季在江蘇省無(wú)錫市采集的薰衣草樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 薰衣草中迷迭香酸的粗提取 薰衣草經(jīng)過(guò)60%乙醇溶液于70℃振蕩水浴12 h。將提取液用濾紙過(guò)濾，取濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)出乙醇，然后用蒸餾水稀釋?zhuān)藰悠啡芤河糜诖罂孜綐?shù)脂靜態(tài)吸附及解吸性能考察。

1.2.2 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理 先用5%HCl水溶液浸泡12 h，再用去離子水洗至中性。用95%乙醇浸泡12 h，用去離子水洗至無(wú)醇味為止。然后用5%NaOH浸泡12 h，用水洗至中性，備用。

1.2.3 液相檢測(cè)方法 色譜柱：LaChrom C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相 A 和 B：分別是乙腈和甲酸溶液（0.1%）；流量：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.2.4 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品25 mg置于25 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶解并定容至刻度，得到1 mg/mL的迷迭香酸對(duì)照品溶液。

1.2.5 不同類(lèi)型大孔樹(shù)脂性能的比較 準(zhǔn)確稱(chēng)取預(yù)處理后的大孔樹(shù)脂2 g，置于50 mL三角瓶中，加入20 mL迷迭香酸粗提液，于30℃、100 r/min水浴振蕩吸附24 h，取上清液進(jìn)樣測(cè)定迷迭香酸質(zhì)量濃度。將吸干表面水分的大孔吸附樹(shù)脂置于50 mL三角瓶中，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇。于30℃、100 r/min水浴振蕩24 h，用高效液相色譜法測(cè)定洗脫液中迷迭香酸質(zhì)量濃度，分別計(jì)算各種樹(shù)脂的吸附率及解析率。

1.2.6 大孔樹(shù)脂的裝柱處理 經(jīng)預(yù)處理后的大孔吸附樹(shù)脂濕法裝入Φ2.0 cm×50 cm具活塞層析柱，裝填高度17 cm，柱體積為40 mL。

1.2.7 迷迭香酸質(zhì)量濃度的測(cè)定 收集迷迭香酸提取液和純化液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至無(wú)醇味。將濃縮物冷凍成冰塊后，進(jìn)行真空冷凍干燥。稱(chēng)取適量的冷凍干燥物加水定容至50 mL，進(jìn)樣測(cè)定迷迭香酸含量。最后計(jì)算迷迭香酸純度。

1.2.8 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取LX-60干樹(shù)脂2 g，置于50 mL三角瓶，再加入20 mL迷迭香酸粗提液，30℃、100 r/min水浴振蕩。每隔20 min取樣測(cè)定含量，以時(shí)間和迷迭香酸的吸附量作圖繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.9 靜態(tài)吸附等溫線的測(cè)定 分別量取4、8、12、16、20 mL迷迭香酸溶液，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇分別稀釋至20 mL，配置成不同質(zhì)量濃度的迷迭香酸溶液，再分別加入2 g LX-60樹(shù)脂，于30℃、100 r/min水浴振蕩12 h，進(jìn)樣測(cè)定含量。以吸附平衡時(shí)迷迭香酸質(zhì)量濃度與吸附量作圖繪制吸附等溫線。

2 結(jié)果與分析

2.1 迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取迷迭香酸對(duì)照品溶液 （質(zhì)量濃度為1 mg/mL）0.5、1、2、4、6、8 mL 定容至 10 mL，分別配置成 0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL 的迷迭香酸溶液。樣品處理后，進(jìn)高效液相色譜測(cè)質(zhì)量濃度，考察迷迭香酸出峰面積與對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度的關(guān)系，見(jiàn)圖1?？傻镁€性回歸方程為y=0.000 000 06x+0.018 05，R2=0.999 6，迷迭香酸質(zhì)量濃度在0.05～1 mg/mL呈良好的線性關(guān)系。

圖1 迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rosmarinic acid

2.2 大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解吸性能考察

由表1可見(jiàn)，吸附率比較高的有非極性樹(shù)脂LX-60、X-5、LX-17、LSA-21， 均可達(dá)到 50%以上，這與迷迭香酸分子中的苯環(huán)能夠和吸附樹(shù)脂本身的苯環(huán)之間形成疏水作用及電子堆積力有關(guān)，還與這幾種樹(shù)脂相對(duì)較大的孔徑及比表面積有關(guān)。同時(shí)極性樹(shù)脂D3520、NKA-C也能夠達(dá)到一定的吸附效果?？赡苡捎诿缘闼釣闃O性化合物，且其分子結(jié)構(gòu)中帶有四個(gè)酚羥基（見(jiàn)圖2），形成氫鍵的能力較強(qiáng)，因此很容易被極性樹(shù)脂所吸附。樹(shù)脂對(duì)迷迭香酸的吸附是多種方面綜合作用的結(jié)果，只要有合適的孔徑與比表面積，極性或非極性的樹(shù)脂均可達(dá)到很好的分離效果[15]。

表1 不同型號(hào)的大孔吸附樹(shù)脂吸附和解吸能力測(cè)定結(jié)果Table 1 Adsorption and desorption abilities of macroporous resins

圖2 迷迭香酸分子式Fig.2 Structure of rosmarinic acid

實(shí)驗(yàn)中篩選出最佳的樹(shù)脂為L(zhǎng)X-60大孔吸附樹(shù)脂，其吸附率及解析率較為理想，是分離薰衣草中迷迭香酸的合適樹(shù)脂。雖然LX-17、NKA-C、D4020解析率較高，但是其吸附率低，無(wú)法滿足迷迭香酸的純化要求。綜合考慮，選擇LX-60作為吸附樹(shù)脂，故以下實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察LX-60大孔樹(shù)脂對(duì)薰衣草粗提液中迷迭香酸的純化條件。

2.3 LX-60靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線及吸附等溫線的繪制

LX-60大孔吸附樹(shù)脂在80 min時(shí)，幾乎能夠達(dá)到吸附平衡。80 min以后吸附量幾乎不再增加，見(jiàn)圖3。在30℃自然pH下，此種樹(shù)脂的最大吸附量可以達(dá)到4.98 mg/g。這種能夠在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到吸附平衡點(diǎn)的性質(zhì)，使其非常適合應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

從迷迭香酸吸附等溫線見(jiàn)圖4。隨著迷迭香酸質(zhì)量濃度的增加，LX-60樹(shù)脂對(duì)迷迭香酸的吸附量增加。當(dāng)迷迭香酸質(zhì)量濃度達(dá)到1.62 mg/mL時(shí)，吸附量開(kāi)始平緩。原因可能因?yàn)闃?shù)脂對(duì)迷迭香酸的吸附要達(dá)到固液相平衡，質(zhì)量濃度高有助于樹(shù)脂吸附。

圖3 LX-60靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Static absorption kinetics curve of LX-60

圖4 LX-60靜態(tài)吸附等溫線Fig.4 Static absorption isotherm of LX-60

2.4 LX-60樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附曲線

用LX-60樹(shù)脂濕法裝柱，將迷迭香酸質(zhì)量濃度為0.42 mg/mL的料液上樣進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，以40 mL為一個(gè)柱體積，以1 mL/min的流速上柱，直到樹(shù)脂吸附飽和為止。以一個(gè)柱體積為單位收集流出液，進(jìn)樣測(cè)定流出液中迷迭香酸的質(zhì)量濃度，見(jiàn)圖5。

從圖5可以看出，該樹(shù)脂可處理17倍柱體積的迷迭香酸溶液。樹(shù)脂床共吸附迷迭香酸283.9 mg，濕態(tài)樹(shù)脂對(duì)迷迭香酸的吸附量為7.09 mg/mL。

2.5 進(jìn)樣液pH對(duì)吸附率的影響

在不同的pH下進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6。迷迭香酸提取液pH 1～2時(shí)，LX-60樹(shù)脂對(duì)迷迭香酸的吸附量差別不大；當(dāng)pH 2～5時(shí)，樹(shù)脂對(duì)迷迭香酸的吸附量逐漸減少。因此，選擇進(jìn)樣液的pH為2較合適。原因可能是由于迷迭香酸作為多羥基的酚酸類(lèi)物質(zhì)，為酸性，在酸性的條件下容易被吸附。在酸性條件下，迷迭香酸能夠以分子的形式存在，疏水性增強(qiáng)，樹(shù)脂對(duì)其吸附也會(huì)相應(yīng)的增強(qiáng)。在堿性條件下，迷迭香酸以離子的形式存在，不易被吸附。

圖6 進(jìn)樣液pH對(duì)吸附率的影響Fig.6 Relation between pH and adsorption rate

2.6 進(jìn)樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響

將不同質(zhì)量濃度的迷迭香酸溶液進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖7。可以看出，當(dāng)迷迭香酸質(zhì)量濃度小于2.12 mg/mL時(shí)。隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，迷迭香酸的吸附率基本保持不變。當(dāng)迷迭香酸的質(zhì)量濃度大于2.12 mg/mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增加，迷迭香酸的吸附率下降，但是其下降的幅度不會(huì)很大。當(dāng)上樣質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，吸附率會(huì)下降很多，可能是由于提取液粘度過(guò)大，對(duì)樹(shù)脂的粘附性過(guò)強(qiáng)，不容易被洗脫下來(lái)。這樣會(huì)影響分離。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，上樣液的質(zhì)量濃度為2.12 mg/mL左右為宜。

圖7 進(jìn)樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響Fig.7 Effect of concentration on adsorption rate

2.7 吸附流速對(duì)吸附效果的影響

將迷迭香酸溶液分別以 1、2、3、4、5、6 mL/min的吸附流速上柱。由圖8可以看出，隨著吸附流速的加快，迷迭香酸泄漏率增大。如果流速過(guò)慢，吸附時(shí)間會(huì)相應(yīng)增加，延長(zhǎng)了生產(chǎn)周期，提高了成本。如果流速過(guò)快，樹(shù)脂吸附量下降嚴(yán)重。吸附流速影響溶質(zhì)向樹(shù)脂表面擴(kuò)散的能力，從而決定了吸附效果。流速太快，溶質(zhì)不能夠很好的擴(kuò)散到樹(shù)脂內(nèi)表面，從而不會(huì)被吸附，就會(huì)發(fā)生泄漏，造成迷迭香酸的流失。流速為1～2 mL/min時(shí)泄漏率差別不大。綜合考慮，吸附流速為2 mL/min為宜。

圖8 吸附流速對(duì)吸附率的影響Fig.8 Effect of adsorption flow rate on adsorption rate

2.8 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫效果的影響

LX-60樹(shù)脂是一種非極性大孔吸附樹(shù)脂，依次用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液進(jìn)行洗脫。將一定體積分?jǐn)?shù)的迷迭香酸溶液上柱，達(dá)到吸附飽和后，用2 BV的去離子水洗去原液。在流速2 mL/min下，分別用體積分?jǐn)?shù)10%、20%、40%、60%、80%、95%乙醇洗脫， 洗脫結(jié)果見(jiàn)圖9。

由圖9可以看出，40%乙醇洗脫效果最好，其洗脫峰集中，對(duì)稱(chēng)性良好。80%乙醇洗脫拖尾嚴(yán)重；而20%乙醇洗脫不太集中；10%乙醇幾乎不能洗脫迷迭香酸。因此，40%乙醇為最佳洗脫溶劑。

圖9 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)迷迭香酸洗脫效果的影響Fig.9 Elution effect on rosmarinic acid with different concentration ethanol

2.9 洗脫流速對(duì)洗脫效果的影響

將一定質(zhì)量濃度的迷迭香酸溶液吸附在樹(shù)脂柱上，在 1、2、3、4、5、6 mL/min 不同流速下，用 40%乙醇洗脫，收集4個(gè)柱床體積的40%乙醇洗脫液，結(jié)果見(jiàn)圖10。

由圖10可以看出，洗脫流速對(duì)洗脫效果有一定的影響。當(dāng)洗脫流速在1～2 mL/min時(shí)，迷迭香酸的質(zhì)量濃度幾乎不變；當(dāng)洗脫流速大于3 mL/min時(shí)，迷迭香酸質(zhì)量濃度大幅度下降。結(jié)果表明：洗脫流速越慢，洗脫效果越好，但太慢又會(huì)使工作周期延長(zhǎng)。綜合考慮，洗脫流速2 mL/min為最佳。

圖10 洗脫流速對(duì)迷迭香酸洗脫效果的影響Fig.10 Effect of elution flow rate on desorption rate

2.1 0 LX-60樹(shù)脂再生能力的考察

準(zhǔn)確稱(chēng)取LX-60樹(shù)脂2 g，預(yù)處理后重復(fù)多次靜態(tài)吸附、洗脫實(shí)驗(yàn)，對(duì)樹(shù)脂的再生能力進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)圖11。

由圖11可以看出，隨著使用次數(shù)的增加，樹(shù)脂的分離效果逐漸變差。綜合分析生產(chǎn)成本與分離效果，確定最佳再生周期為4次。

圖11 LX-60樹(shù)脂的再生周期Fig.11 Regeneration cycle of LX-60 macroreticular resin

2.1 1 最佳工藝條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將制備的迷迭香酸提取液配成質(zhì)量濃度為2.15 mg/mL左右的迷迭香酸水溶液，調(diào)節(jié)其pH為2，在2 mL/min流速下，加入到LX-60樹(shù)脂層析柱中。用水洗去未被吸附的原液，再用40%乙醇以2 mL/min的速度洗脫，收集4個(gè)柱體積洗脫液，減壓濃縮除去溶劑，冷凍干燥得到迷迭香酸產(chǎn)品。測(cè)定得，迷迭香酸純度為15.6%，其純度提高了42倍，產(chǎn)品得率為86.79%。

圖12為迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖。由圖可知，迷迭香酸的出峰時(shí)間為12 min左右。圖13為大孔吸附樹(shù)脂純化前的樣品液相色譜圖，可見(jiàn)12 min之前的雜質(zhì)較多。圖14為純化后的色譜圖，可見(jiàn)除雜效果明顯。LX-60樹(shù)脂具有工業(yè)化應(yīng)用的潛力。

圖12 迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.12 HPLC chromatogram of standard rosemarinic acid

圖13 處理前樣品高效液相色譜圖Fig.13 HPLC of non-purified sample

圖14 處理后樣品高效液相色譜圖Fig.14 HPLC of purified sample

3 結(jié)語(yǔ)

大孔吸附樹(shù)脂具有吸附容量大、選擇性好、解吸條件溫和、容易再生處理、較長(zhǎng)使用周期、節(jié)約費(fèi)用等眾多優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已大量用于環(huán)保、化工、醫(yī)藥和食品工業(yè)[16]。

通過(guò)研究大孔吸附樹(shù)脂對(duì)薰衣草中迷迭香酸的吸附和解吸性能，確定了LX-60樹(shù)脂作為最佳樹(shù)脂。其吸附率為71.48%，解吸率為94.92%。其吸附率大且容易解吸，能夠滿足實(shí)驗(yàn)的要求，較適合于薰衣草中迷迭香酸的純化。

經(jīng)過(guò)純化后，迷迭香酸純度達(dá)到15.6%，仍然存在純度不高的問(wèn)題，分析可能是由于提取物中的酚酸類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、衍生物較多。因此，可以考慮在利用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行純化之前，選用合適的溶劑進(jìn)行萃取或使用絮凝劑對(duì)多聚物進(jìn)行絮凝來(lái)除去一部分雜質(zhì)，提高薰衣草提取液中迷迭香酸的純度[17]。