6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶在產(chǎn)油細(xì)菌渾濁紅球菌PD630脂質(zhì)積累中的作用

張冬冬， 趙利娜， 昝新藝， 唐 鑫， 宋元達(dá)

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

在過去的幾十年里，由于能源緊缺及化石能源工業(yè)對(duì)環(huán)境造成的污染，人們對(duì)能夠生產(chǎn)大量可再生能源的產(chǎn)油微生物產(chǎn)生了極大的研究興趣[1]。同時(shí)，來自微生物發(fā)酵生產(chǎn)的脂肪酸還是交通燃料和化工產(chǎn)品（表面活性劑、潤滑劑）合成的前體，因此十分有必要研究和開發(fā)一些能夠高產(chǎn)脂的微生物菌株[2]。在燃?xì)夤こ谈浇廴就寥乐邪l(fā)現(xiàn)的渾濁紅球菌 PD630（Rhodococcus opacus PD630），在以葡萄糖酸為碳源、氮源限制的條件下，可以合成高達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量76%的脂質(zhì)[3-4]。相關(guān)研究報(bào)道：以甜菜糖漿和蔗糖為混合碳源連續(xù)培養(yǎng)R.opacus PD630時(shí)，其菌體的生物量能夠達(dá)到37.4 g/L，且脂質(zhì)含量高達(dá)51.9%[5]。由此可見，產(chǎn)油細(xì)菌R.opacus PD630能夠作為生產(chǎn)生物柴油的潛在菌株[6-8]。此外，由于其全基因組序列已公布[9]和完善的遺傳操作系統(tǒng)[9-12]，R.opacus PD630已經(jīng)成為研究產(chǎn)油細(xì)菌細(xì)胞代謝與脂質(zhì)合成機(jī)制的模式菌株[13]。同時(shí)，也增加了R.opacus PD630利用廉價(jià)可再生原料（如木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物）[14-15]進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn) “高價(jià)值單細(xì)胞油脂”的可能性以及成為其它特殊應(yīng)用的潛在菌株[12，16]。

目前，產(chǎn)油微生物脂質(zhì)合成的途徑已經(jīng)基本明確：一個(gè)關(guān)鍵步驟是提供生物脂質(zhì)合成所需的必要前體乙酰輔酶A，另一個(gè)關(guān)鍵步驟是提供輔助因子還原力NADPH[17]。NADPH不僅是微生物脂質(zhì)合成的必需還原力，也是激發(fā)菌體內(nèi)大多數(shù)酶促反應(yīng)的動(dòng)力，其中包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子的合成[18-20]。在研究NADPH的產(chǎn)量與實(shí)際通過氧化磷酸戊糖路徑（oxPPP）碳流量之間的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)在許多真核及原核微生物中oxPPP是產(chǎn)生NADPH的一條主要途徑[20-23]。而且，已有很多研究基于增加oxPPP的碳流量來提高NADPH的產(chǎn)量，如直接過表達(dá)oxPPP相關(guān)的酶[23-26]；或間接增加oxPPP的碳流量，敲除磷酸葡萄糖異構(gòu)酶[27-28]或磷酸果糖激酶[29-30]等。研究表明，在R.opacus PD630中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）不僅控制著oxPPP同時(shí)還控制著 Entner-Doudoroff（ED）路徑[13，31]。 作者所在實(shí)驗(yàn)室前期的13C代謝流量分析表明：在高氮和低氮兩種不同的產(chǎn)脂培養(yǎng)條件下，R.opacus PD630對(duì)oxPPP和ED路徑的偏好性不同，在高產(chǎn)脂的培養(yǎng)條件下，通過oxPPP的碳流量是通過ED路徑碳流量的5倍左右，而6PGDH正是導(dǎo)致這兩種路徑流量產(chǎn)生變化最主要的原因，因此6PGDH很有可能是影響其脂質(zhì)積累的一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

為了研究6PGDH在產(chǎn)油細(xì)菌R.opacus PD630脂質(zhì)積累中的作用，作者將編碼6PGDH的基因gnd在R.opacus PD630中過表達(dá)，并分析過表達(dá)重組菌株脂質(zhì)含量的變化，以期進(jìn)一步獲得產(chǎn)油細(xì)菌R.opacus PD630脂質(zhì)積累的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)條件及質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒見表1。大腸桿菌Top10（Escherichia coli Top10）于37℃搖床200 r/min在Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。R.opacus PD630（DSMZ44193）[3]于 28 ℃、200 r/min，在 LB 培養(yǎng)基或含有微量元素SL6[32]的MSM[33]培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。 葡萄糖（10 g/L）作為碳源，NH4Cl（1 g/L）用作氮源，細(xì)胞在250 mL搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，其中含有50 mL MSM培養(yǎng)基。調(diào)節(jié)活化菌株的濃度使得所有發(fā)酵培養(yǎng)接種的初始菌體濃度相同。培養(yǎng)48、72、96 h后離心收集菌體，用NaCl（0.9 g/dL）洗滌菌體細(xì)胞兩次，之后冷凍干燥至恒質(zhì)量或直接于-80℃儲(chǔ)藏用于下一步的實(shí)驗(yàn)分析。對(duì)于E.coli Top10和R.opacus PD630選擇培養(yǎng)所用的抗體終質(zhì)量濃度均為50 μg/mL的卡那霉素（Km），發(fā)酵培養(yǎng)基中所用的誘導(dǎo)劑為乙酰胺終質(zhì)量濃度為0.5 g/dL[11]。固體培養(yǎng)基通過加入1.5 g/dL的瓊脂來制備。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

通過NCBI網(wǎng)站查找出，R.opacus PD630中有5種同源基因gnd編碼6PGDH。由于基因gnd是同源過表達(dá)，提取R.opacus PD630的基因組為模板，利用相對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增從其基因組中分離得到目的基因片段，上下游引物分別含有BamHI和XbaI酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收，同時(shí)質(zhì)粒pJAM2分別加入BamHI和XbaI進(jìn)行雙酶切，酶切后的DNA片段和PCR產(chǎn)物分別按一定比例混合，利用T4連接酶進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pJAM2/gnd1、pJAM2/gnd2、pJAM2/gnd3、pJAM2/gnd4 和 pJAM2/gnd5。 重組質(zhì)粒中目的基因片段位于乙酰胺酶（ace）啟動(dòng)子下游，將以上構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒用化學(xué)法轉(zhuǎn)化到E.coli Top10的感受態(tài)細(xì)胞中，在添加有50 μg/mL Km的LB固體平板上于37℃培養(yǎng)12～16 h，隨機(jī)選取每一種重組菌株的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的陽性轉(zhuǎn)化子送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證。之后將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至R.opacus PD630，得到過表達(dá)gnd的重組菌株。本實(shí)驗(yàn)所有的菌株及質(zhì)粒見表1，所有的引物見表2。

表1 本研究所有的菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.3 R.opacus PD630的電擊轉(zhuǎn)化

R.opacus PD630的電擊轉(zhuǎn)化所用感受態(tài)細(xì)胞的制作方法：從劃線平板上挑取單菌落于含有0.85 g/dL甘氨酸和1 g/dL蔗糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)其OD值達(dá)到0.6時(shí)，在4℃條件下離心收集菌體，冰浴10 min，離心后用預(yù)冷的無菌水洗滌一次，再用10 g/dL預(yù)冷甘油重懸菌體后分裝至1.5 mL的無菌EP管中，于-80℃保存。電擊轉(zhuǎn)化方法在Kalscheuer等[12]報(bào)道的基礎(chǔ)上做一些優(yōu)化。具體方法為：100 μL感受態(tài)細(xì)胞與 5 μL DNA混合后，40℃水浴5 min，冰上放置10 min后立即轉(zhuǎn)移至電極間隙尺寸為2 mm的預(yù)冷電擊杯中進(jìn)行脈沖電擊（電擊條件：25 μF，2.4 kV/cm，600 Ω）。 電擊之后的混合液轉(zhuǎn)接至1mLLB培養(yǎng)基中，在28℃下培養(yǎng)4h，之后取少量菌液均勻涂布到含50 μg/mL Km的LB固體選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5 d得到陽性轉(zhuǎn)化子，用對(duì)應(yīng)的引物MF/MR（擴(kuò)增目的基因）和aceF/aceR（擴(kuò)增乙酰胺酶啟動(dòng)子基因）進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證。

1.4 脂質(zhì)分析

離心收集48、72、96 h的菌體并用0.9 g/dL的NaCl溶液清洗兩次，置于-80℃預(yù)冷，之后進(jìn)行冷凍濃縮干燥。準(zhǔn)確稱取冷凍干燥之后的菌粉8～10 mg于4 mol/L的鹽酸中水解，之后用氯仿/甲醇（體積比2∶1）進(jìn)行萃取，為定量分析加入正十三烷酸（C13∶0）作為內(nèi)標(biāo)，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 10%的鹽酸/甲醇對(duì)其進(jìn)行甲酯化處理。甲酯化之后的樣品取10 μL進(jìn)行氣相分析，氣相程序設(shè)置為：起始溫度為60℃，以10℃/min的速度升溫到120℃，停留3 min，再以5℃/min的速度升溫到190℃，之后以4℃/min的速度升溫至220℃，停留20 min，N2作為載氣，流量為3 mL/min。

表2 本研究用到的引物名稱及序列Table 2 Oligonucleotides used as PCR primers in this study

1.5 相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平及酶活力的分析

對(duì)于過表達(dá)重組菌株gnd基因轉(zhuǎn)錄水平的分析，收集48、72、96 h的菌體，4℃條件下離心收集發(fā)酵培養(yǎng)的菌體，收集的菌體立即于-80℃保存用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄水平分析。RNA的提取和cDNA的分析所用的方法基于Hoynes等[35]建立方法的基礎(chǔ)上做一些改進(jìn)。為了定量分析，用能夠在相近菌種Rhodococcus jostii RHA1中穩(wěn)定表達(dá)的DNA聚合酶IV作為內(nèi)參[36]。轉(zhuǎn)錄水平倍數(shù)的計(jì)算根據(jù)Schmittgen和Livak[37]建立的公式計(jì)算得出。

6PGDH酶活力的分析測(cè)定所用的細(xì)胞粗提取物用Tang等[38]改進(jìn)過的標(biāo)準(zhǔn)方法。離心收集菌體用去離子水清洗兩遍，在液氮下進(jìn)行研磨之后用BufferA （100 mmol/L KH2PO4/KOH，pH 7.5 含有 20 g/dL甘油，1 mmol/L鹽酸苯甲脒和1 mmol/L DTT）懸浮。提取懸浮液于4℃、10 000 g離心30 min，上清液用作酶活力的測(cè)定。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度用Bradford[39]法確定。

2 結(jié)果與討論

2.1 gnd過表達(dá)重組菌株的構(gòu)建

由NCBI公布的R.opacus PD630的全基因組序列，可以查找到編碼6PGDH的同源基因有5個(gè)，將它們分別命名為 gnd1（894 bp）、gnd2（1 455 bp）、gnd3（1 452 bp）、gnd4（912 bp）和 gnd5（882 bp）。圖1是質(zhì)粒pJAM2，含有乙酰胺酶啟動(dòng)子，其下游有BamHI和XbaI兩個(gè)酶切位點(diǎn)供插入目的基因，并且?guī)в锌勺鳛檫x擇性標(biāo)記的Km抗性基因。以R.opacus PD630的基因組為模板，利用對(duì)應(yīng)的引物體外擴(kuò)增出目的基因片段，克隆到質(zhì)粒pJAM2上，獲得過表達(dá)6PGDH的重組質(zhì)粒pJAM2/gnd1、pJAM2/gnd2、pJAM2/gnd3、pJAM2/gnd4 和 pJAM2/gnd5。然后，通過電擊轉(zhuǎn)化的方法將這些重組質(zhì)粒及空質(zhì)粒pJAM2分別轉(zhuǎn)化到R.opacus PD630中，再將這些轉(zhuǎn)化子在含Km的選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以獲得所需的過表達(dá)重組菌株和對(duì)照菌株。

圖1 用于攜帶目的基因的質(zhì)粒pJAM2的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of plasmid pJAM2-gene for target geneoverexpressing in R.opacus PD630

為了驗(yàn)證目的基因是否成功轉(zhuǎn)入R.opacus PD630中，以MF/MR和aceF/aceR為引物，重組菌株和對(duì)照菌株的基因組為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，其PCR擴(kuò)增片段結(jié)果見圖2。由圖2可知，目的基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入R.opacus PD630中。選取每個(gè)過表達(dá)基因的3個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每個(gè)過表達(dá)重組菌株中產(chǎn)脂量最高的一株 （命名為PD-pJAM2/gnd1、PD-pJAM2/gnd2、PD-pJAM2/gnd3、PD-pJAM2/gnd4、PD-pJAM2/gnd5 和對(duì)照菌株 PD-pJAM2）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR confirmation of transformants

2.2 gnd過表達(dá)重組菌株脂質(zhì)積累的分析

為了分析gnd過表達(dá)重組菌株脂質(zhì)積累的情況，將篩選出的過表達(dá)重組菌株分別在MSM培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，收集48、72、96 h的菌體用于提取脂質(zhì)。過表達(dá)重組菌株和對(duì)照菌株的總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)見圖3。從圖3可以看出，各個(gè)過表達(dá)重組菌株的總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對(duì)照菌株相比均有顯著的提高。脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加最多的菌株是PD-pJAM2/gnd3，其總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在48 h時(shí)高達(dá)31.98%，比對(duì)照菌株提高了27.8%。而且，過表達(dá)重組菌株的總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸降低，重組菌株的生物量在48 h（對(duì)數(shù)生長期的后期）時(shí)，其總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高，與之前Hernández等[10]的研究結(jié)果相符。

圖3 在24、48、72 h不同時(shí)間點(diǎn)過表達(dá)菌株和對(duì)照菌株的總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.3 Totalamountoffattyacidscontentin the overexpressing strains and controlstrain at 24，48，72 h

由此可見，過表達(dá)gnd能夠促進(jìn)R.opacus PD630的脂質(zhì)積累。之前已有很多研究發(fā)現(xiàn)，oxPPP是脂質(zhì)生物合成所需還原力NADPH的主要來源，在產(chǎn)油真菌高山被孢霉[10]和卷枝毛霉[24]中過表達(dá)oxPPP相關(guān)酶的重組菌株脂質(zhì)含量均提高了20%以上；也有很多在原核生物中研究oxPPP相關(guān)酶對(duì)NADPH的影響[40-42]。有研究表明，在大腸桿菌中過表達(dá)G6PDH比過表達(dá)6PGDH能夠更有效地產(chǎn)生NADPH[20]。然而在R.opacus PD630中以葡糖糖為碳源的培養(yǎng)條件下通過G6PDH的碳流量高達(dá)90%以上[13]，因此過表達(dá)G6PDH達(dá)到增加NADPH產(chǎn)量的空間不大。作者通過過表達(dá)6PGDH來增加脂質(zhì)合成所需的還原力NADPH，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明過表達(dá)6PGDH能夠促進(jìn)了R.opacus PD630的脂質(zhì)積累量，這為我們進(jìn)一步研究R.opacus PD630脂質(zhì)合成機(jī)制提供了可靠的依據(jù)。

2.3 gnd過表達(dá)重組菌株6PGDH酶活力及gnd轉(zhuǎn)錄水平的分析

為了分析過表達(dá)重組菌株6PGDH酶活性的情況，分別收集了 48、72、96 h的菌體對(duì)其進(jìn)行6PGDH酶活力的測(cè)定，結(jié)果見圖4。由圖4可知，過表達(dá)重組菌株的6PGDH酶活力顯著高于對(duì)照菌株，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長其酶活力不斷增加。

圖4 在 24、48、72 h不同時(shí)間點(diǎn)過表達(dá)菌株和對(duì)照菌株6PGDH的酶活性Fig.4 Activities of 6PGDH in the overexpressing strains and control strain at 24，48，72 h

為了分析研究gnd過表達(dá)重組菌株gnd的轉(zhuǎn)錄水平，提取重組菌株和對(duì)照菌株的RNA進(jìn)行RT-qPCR分析，結(jié)果見圖5。由圖5可知，重組菌株的gnd轉(zhuǎn)錄水平均較對(duì)照菌株提高了4～10倍。通過對(duì)過表達(dá)重組菌株脂質(zhì)脂質(zhì)積累量、酶活和轉(zhuǎn)錄水平的綜合分析，目的基因gnd在過表達(dá)重組菌株中能夠正常地轉(zhuǎn)錄與翻譯，并且過表達(dá)重組菌株通過提高6PGDH酶活力以產(chǎn)生更多的還原力NADPH，從而促進(jìn)其脂肪酸的合成。

圖5 在24、48、72 h不同時(shí)間點(diǎn)過表達(dá)菌株和對(duì)照菌株gnd1，gnd2，gnd3，gnd4 和 gnd5 的表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of gnd1，gnd2，gnd3，gnd4 and gnd5 genes in the overexpressing strains and control strain at 24，48，72 h

3 結(jié)語

本研究R.opacus PD630過表達(dá)重組菌株中6PGDH酶活力及編碼基因gnd的轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組均有所提高，且脂質(zhì)積累量較對(duì)照組也提高了20%～30%。這些結(jié)果都表明在R.opacus PD630中，由6PGDH產(chǎn)生的NADPH能夠促進(jìn)其脂肪酸的生物合成，從而使R.opacus PD630能夠積累更多的脂肪酸，也為更好地了解其脂質(zhì)生物合成的機(jī)制提供了依據(jù)。我們還需要進(jìn)一步研究在R.opacus PD630中其它能夠產(chǎn)生還原力NADPH的酶對(duì)脂質(zhì)積累的作用，從而增大其成為第二代生物柴油生產(chǎn)菌株的可能性。