樟芝提取物Fr.3抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝纖維化機(jī)制

孫 青 ， 耿 燕 *， 杜 妍 ， 許正宏 ，2

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇 無錫 214122）

樟芝（Antrodia camphorata），俗稱牛樟菇、牛樟芝、紅樟芝等，屬于擔(dān)子菌綱、非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌屬，是一種僅寄生于臺(tái)灣牛樟樹腐朽樹干內(nèi)的珍稀藥食用真菌，素有“臺(tái)灣森林之紅寶石”、“靈芝之王”之美譽(yù)[1]。在臺(tái)灣民間，樟芝被用來解酒保肝已有悠久歷史，且國內(nèi)外藥理實(shí)驗(yàn)表明，樟芝菌絲體及發(fā)酵液具有抗腫瘤[2]、抗炎[3]、保肝[4-5]等多種活性。樟芝成分復(fù)雜，含有多糖類、三萜類、酚類及琥珀酸類等物質(zhì)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，樟芝中的三萜類物質(zhì)Antcin K可顯著抑制肝癌細(xì)胞的粘附、遷移、侵襲[6]、琥珀酸衍生物Antrodin B具有抗肝纖維化活性[7-8]、Antrodin C具有抗乳腺癌活性[9]。因此，樟芝具有良好的研究價(jià)值及應(yīng)用前景，尤其是在肝病治療上。

肝臟是機(jī)體重要的器官，具有物質(zhì)代謝、生物轉(zhuǎn)化、解毒等功能，在受到各種致病因素和刺激因子的侵襲后發(fā)生肝臟損傷和炎癥反應(yīng)。肝臟在遭受持續(xù)性損傷時(shí)會(huì)反復(fù)自我修復(fù)進(jìn)而形成肝纖維化，主要特征為肝星狀細(xì)胞（HSCs）的激活以及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）異常積累，特征標(biāo)志為平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）。靜息狀態(tài)的HSCs是存儲(chǔ)脂滴和維生素A的主要場所，在活化時(shí)脂滴丟失，HSCs分泌大量的膠原（I，III，IV 型）、纖維連接蛋白（Fn）、透明質(zhì)酸等[10]。TGF-β1是刺激肝星狀細(xì)胞激活進(jìn)而發(fā)生增值和分化的重要細(xì)胞因子之一，可以上調(diào)α-SMA和ECM的表達(dá)水平[11-13]。TGF-β1可以激活多個(gè)信號(hào)通路，參與肝纖維化的發(fā)生，如Smad、PI3K、MAPK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的激活、增值、遷移以及凋亡[14-16]。我國是一個(gè)肝病高發(fā)國家，積極防治肝纖維化能有效降低肝硬化及肝癌發(fā)病率。

本課題組前期從樟芝菌體正己烷提取物中經(jīng)硅膠柱層析分離得到 5 個(gè)組分（Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4和Fr.5），并發(fā)現(xiàn)Fr.2組分能有效抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的肝纖維化[7]，課題組隨后對(duì)Fr.2組分做了進(jìn)一步分離及活性分析，發(fā)現(xiàn)其抗肝纖維化活性主要來自化合物Antrodin B[8]。作者主要對(duì)Fr.3組分抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝纖維化活性進(jìn)行了研究，同時(shí)通過檢測ECM的表達(dá)及其相關(guān)信號(hào)通路中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化來探究作用機(jī)制，為樟芝抗肝纖維化的進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

1.1.1 材料與試劑 大鼠肝星狀細(xì)胞CFSC-8B：購自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫；TGF-β1：購自美國PeproTech公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）：購自美國Gibco公司；胰酶-EDTA消化液、青霉素-鏈霉素 （100×）、10%SDS、pH 8.8 的 1.5 mol/L Tris-HCl、pH 6.8 的 1 mol/L Tris-HCl： 購自碧云天公司；MTT及SB431542[8]：購自美國Sigma公司；WST-1 細(xì)胞增殖試劑盒、Trizol、FastStart Universal SYBR Green Master、細(xì)胞裂解液：購自美國Roche公司；MAPK信號(hào)通路中抗體、p-AKT及p-Smad2抗體：購自Cell Signaling Technology公司；Collagen I抗體：購自Abcam公司；α-Actin抗體：購自Santa Cruz公司；其他試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。樟芝菌粉中物質(zhì)提取方法見文獻(xiàn)[7]。

1.1.2 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph公司；中低壓柱層析：Grace公司；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀：德國 Eppendorf公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：Thermo公司；倒置顯微鏡：Nikon公司；RT-PCR儀、化學(xué)發(fā)光成像儀：Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Fr.3組分的制備方法 3 L燒杯中加入500 g樟芝菌粉與2.5 L甲醇混合，室溫浸提12 h，布氏漏斗過濾，重復(fù)浸提3次，收集澄清的濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得甲醇提取物；800 mL去離子水復(fù)溶甲醇提取物，等體積與正己烷混合萃取3次，收集正己烷相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得正己烷提取物；利用中低壓柱層析儀分離樟芝正己烷提取物，條件為：40 g硅膠柱，流速20 mL/min，檢測波長為254 nm，流動(dòng)相為正己烷、乙酸乙酯梯度洗脫，在乙酸乙酯洗脫比例為13%時(shí)收集餾分并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得組分Fraction 3（Fr.3）。

1.2.2 CFSC-8B細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基+含10%胎牛血清 （FBS）+1%抗生素（100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素）。

培養(yǎng)條件：置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代：細(xì)胞貼壁生長，長至80%～90%時(shí)胰酶消化，加培養(yǎng)基終止消化后懸浮細(xì)胞，接種傳代，選取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT法檢測Fr.3組分作用CFSC-8B后細(xì)胞活力的影響 胰酶消化對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞后加培養(yǎng)基懸浮，以5×103個(gè)/孔的細(xì)胞密度鋪于96孔板，每孔100 μL，24 h后換含有不同質(zhì)量濃度Fr.3組分（0、5、10、20 μg/mL）的培養(yǎng)基作用細(xì)胞 24 h，每組6個(gè)平行，棄去培養(yǎng)液，隨后每孔加入含0.5 mg/mL MTT 的培養(yǎng)基 100 μL，孵育 4 h，棄去廢液，每孔再加150 μL DMSO，用酶標(biāo)儀在570 nm處測OD值[8]。

1.2.4 WST-1法檢測Fr.3組分對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFSC-8B細(xì)胞增值 將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度鋪于96孔板中培養(yǎng)24 h，用含有體積分?jǐn)?shù)0.5%FBS的培養(yǎng)基同步化細(xì)胞24 h，加含不同質(zhì)量濃度的 Fr.3 組分（0、5、10、20 μg/mL）及SB431542（2 μmol/L）預(yù)作用細(xì)胞 1 h，換含有不同質(zhì)量濃度的Fr.3組分，SB431542及TGF-β1培養(yǎng)基共同孵育24 h，每孔加入10 μL WST-1培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測OD值。

1.2.5 細(xì)胞小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測Fr.3組分對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFSC-8細(xì)胞遷移 取2×105個(gè)/mL的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞懸液100 μL，加入8 μm孔徑的聚碳酸酯微孔濾膜Transwell小室（Millipore公司），小室放入預(yù)先加有500 μL含10%FBS細(xì)胞培養(yǎng)基的24孔板中。孵育4～5 h后，加入不同質(zhì)量濃度的Fr.3及 SB431542（2 μmol/L）預(yù)作用 1 h，換含有不同質(zhì)量濃度的Fr.3組分、SB431542及TGF-β1培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出濾膜，用棉簽擦去上室內(nèi)表面細(xì)胞，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定遷移至濾膜外表面的細(xì)胞30 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的結(jié)晶紫染色，顯微鏡拍照，用體積分?jǐn)?shù)33%的醋酸脫色10 min，洗脫液在酶標(biāo)儀上于570 nm處測定OD值，間接反映細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測Fr.3組分對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肝纖維化ECM相關(guān)基因的表達(dá)采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，用2-△△t法定量分析ECM相關(guān)基因的表達(dá)水平。相關(guān)基因?yàn)椋害?SMA、Collagen I （Col1）、Collagen III（Col3）、Fibronectin（Fn）[7]。

1.2.7 蛋白免疫印跡（Western Blotting）法檢測Fr.3組分對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響 細(xì)胞加藥作用后，預(yù)冷的PBS潤洗細(xì)胞，每皿加入100 μL蛋白裂解液（含蛋白酶及磷酸酶抑制劑），在冰上裂解30 min，將細(xì)胞刮下收集于1.5 mL離心管中，12 000 g，4℃離心 10 min，取蛋白質(zhì)上清液，BCA試劑盒測樣品的蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)10%的SDSPAGE電泳濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后，分別孵育一抗和二抗，ECL試劑盒（Thermo）顯色拍照，用Image J軟件分析蛋白質(zhì)條帶灰度值，定量檢測 α-SMA、Col1 以及 Smad、MAPK、PI3K 信號(hào)通路相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 用One-Way ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每組數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。p＜0.05，與空白對(duì)照組相比；極顯著水平表示為***p＜0.001；與模型組相比，極顯著水平表示為###p＜ 0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fr.3組分體外抗肝纖維化活性評(píng)價(jià)

2.1.1 Fr.3組分的制備 樟芝菌粉（500 g）與2.5 L甲醇室溫浸提12 h，過濾，重復(fù)浸提3次，收集濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到甲醇提取物，以水復(fù)溶至800 mL，與正己烷等體積萃取得正己烷提取物44.36 g。通過硅膠柱層析法分離樟芝正己烷相，在乙酸乙酯洗脫比例為13%時(shí)收集餾分得組分Fraction 3（Fr.3）共2.2 g，在樟芝菌粉中的得率為0.64%，F(xiàn)r.3組分為黃色油狀物，溶于甲醇。

2.1.2 Fr.3組分對(duì)CFSC-8B細(xì)胞活力的影響 將不同質(zhì)量濃度的 Fr.3 組分（3、6、10、15、20、30、60 μg/mL）與CFSC-8B細(xì)胞共孵育24 h，利用MTT方法檢測細(xì)胞存活率。如圖1所示，F(xiàn)r.3組分在低于20 μg/mL時(shí)對(duì)CFSC-8B細(xì)胞無明顯毒性，細(xì)胞存活率均在80%以上，但在高質(zhì)量濃度60 μg/mL的Fr.3作用下，CFSC-8B細(xì)胞存活率顯著被抑制，抑制率達(dá)到72.75%，有明顯的毒副作用，F(xiàn)r.3組分的IC50值為54.56 μg/mL。因此，選擇Fr.3組分作用質(zhì)量濃度在0～20 μg/mL時(shí)與CFSC-8B細(xì)胞孵育 24 h進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 Fr.3對(duì)CFSC-8B細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of Fr.3 on cell viability in CFSC-8B cells

2.1.3 Fr.3組分對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFSC-8B細(xì)胞遷移及細(xì)胞增值的影響 Geng等通過實(shí)時(shí)熒光定量和蛋白免疫印跡法確定TGF-β1活化CFSC-8B細(xì)胞的最佳作用質(zhì)量濃度和時(shí)間分別為10 ng/mL和24 h[8]。在此基礎(chǔ)上通過WST-1法檢測Fr.3組分（0、5、10、20 μg/mL）作用于 TGF-β1 誘導(dǎo)的 CFSC-8B細(xì)胞后，其細(xì)胞增值活性的變化見圖2。TGF-β1顯著誘導(dǎo)細(xì)胞增值，F(xiàn)r.3作用后可以顯著抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的增值作用（###p＜0.001）。

圖2 Fr.3組分對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFSC-8B細(xì)胞增值的影響Fig.2 Effects of Fr.3 on TGF-β1 induced cell proliferation in CFSC-8B cells

2.1.4 Fr.3組分對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFSC-8B細(xì)胞遷移影響 通過小室遷移法檢測細(xì)胞增值，考察Fr.3 組分（0、5、10、20 μg/mL）抗肝纖維化活性，見圖3。與空白組相比，TGF-β1誘導(dǎo)后細(xì)胞遷移率顯著增加（**p＜0.01），F(xiàn)r.3 組分作用活化的細(xì)胞后，顯著抑制細(xì)胞遷移（##p＜0.01），且具有明顯的劑量依賴關(guān)系，20 μg/mL Fr.3組分抑制率與陽性藥物SB431542抑制率相當(dāng)。

2.2 Fr.3組分改善TGF-β1誘導(dǎo)的肝纖維化作用機(jī)制初步探討

2.2.1 Fr.3組分下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的肝纖維化細(xì)胞ECM中相關(guān)基因的表達(dá)水平 TGF-β1誘導(dǎo)的肝纖維化細(xì)胞活化后，ECM異常積累，在基因水平上，α-SMA、Col1、Col3、Fn 轉(zhuǎn)錄水平升高。 采用 qRT-PCR技術(shù)進(jìn)一步檢測 Fr.3組分對(duì) TGF-β1誘導(dǎo)的CFSC-8B相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，結(jié)果見圖4。TGF-β1作用于CFSC-8B細(xì)胞后可顯著上調(diào)α-SMA、Col1、Col3、Fn 基因的表達(dá)水平（***p＜0.001）。Fr.3組分作用后顯著降低基因的表達(dá) （###p＜0.001），且具有劑量相關(guān)性。

圖3 Fr.3組分對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFSC-8B細(xì)胞遷移的影響（標(biāo)尺:100 μm）Fig.3 Effects of Fr.3 on TGF-β1 induced cell migration in CFSC-8B cells（Scale bar，100 μm）

圖 4 Fr.3組分對(duì) TGF-β1誘導(dǎo)的 α-SMA、Col1、Col3及Fn mRNA的相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of Fr.3 on the expression of α-SMA，Col1，Col3 and Fn mRNA induced by TGF-β1

2.2.2 Fr.3組分降低TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA、Col1的表達(dá)并下調(diào)Smad、PI3K、MAPK通路中相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化表達(dá)水平 通過Western blotting法檢測在TGF-β1的誘導(dǎo)下，不同質(zhì)量濃度的Fr.3組分作用于CFSC-8B后，ECM中α-SMA、Col1蛋白質(zhì)表達(dá)情況，見圖 5（a）。 TGF-β1作用于 CFSC-8B 細(xì)胞后可顯著誘導(dǎo)α-SMA、Col1的蛋白質(zhì)表達(dá) （###p＜0.001），而Fr.3組分作用后降低其表達(dá)水平（***p＜0.001）。因此，F(xiàn)r.3組分可以降低TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞ECM的積累。

TGF-β1可以介導(dǎo)Smads的信號(hào)通路從而影響肝纖維化的發(fā)展[17]，如圖 5（b）所示，F(xiàn)r.3組分可以顯著抑制TGF-β1介導(dǎo)的Smad信號(hào)通路中Smad2的磷酸化表達(dá)水平（##p＜0.01）；磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶（PI-3K/AKT）信號(hào)通路可通過激活A(yù)KT進(jìn)入肝星狀細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平[18]，如圖5（c），F(xiàn)r.3組分還可以顯著抑制 TGF-β1介導(dǎo)的PI3K信號(hào)通路中AKT的磷酸化表達(dá)水平 （##p＜0.01）；絲裂原活化蛋白激酶 （MAPK）信號(hào)通路由Ras/ERK、JNK/SAPK 和 P38三條途徑組成[19]，也是肝纖維化進(jìn)程中的主要通路之一，如圖 5（d）-（e）所示，在MAPK信號(hào)通路中，TGF-β1可以顯著誘導(dǎo)p-ERK及p-P38蛋白質(zhì)的表達(dá) （***p＜0.001），F(xiàn)r.3組分作用后磷酸化表達(dá)水平降低 （###p＜0.001），但p-JNK無影響。因此，F(xiàn)r.3組分通過調(diào)控多個(gè)TGF-β1誘導(dǎo)的信號(hào)通路中的蛋白表達(dá)水平抑制肝纖維化。

圖 5 Fr.3對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFSC-8B細(xì)胞中α-SMA、Col1、p-Smad2、p-AKT、p-ERK及p-P38及蛋白質(zhì)表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Fr.3 on expression of α-SMA，Col1，p-Smad2，p-AKT，p-ERK and p-p38 in CFSC-8B cells stimulated by TGF-β1

3 結(jié) 語

Lu等研究表明，樟芝菌粉對(duì)乙醇誘導(dǎo)的肝損傷有保護(hù)作用[20]，Song等通過建立四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝損傷模型，證明樟芝發(fā)酵液有保肝活性[21]，并且Geng等從樟芝菌粉正己烷提取物中分離出具有抗肝纖維化活性的化合物Antrodin B[8]。有研究表明，肝纖維化是可逆的過程[22]，合理治療可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)程，從而達(dá)到緩減甚至治愈肝纖維化的目的。抑制HSC的活化，使其從活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殪o息狀態(tài)，是研究抗肝纖維化藥物的重要方向之一。

作者以樟芝菌粉中分離得到Fr.3組分為研究對(duì)象，在已建立的TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞肝纖維化模型上，進(jìn)行了Fr.3組分體外抗肝纖維化活性及作用機(jī)制的研究。研究表明，F(xiàn)r.3組分可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CFSC-8B細(xì)胞增值及細(xì)胞遷移，質(zhì)量濃度為 20 μg/mL Fr.3組分與陽性藥物 SB431542（2 μg/mL）相比，抑制細(xì)胞增值及細(xì)胞遷移效果相當(dāng)；Fr.3組分能有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CFSC-8B細(xì)胞 ECM 中 α-SMA、Col1、Col3、Fn 的基因轉(zhuǎn)錄及α-SMA和Col1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

為研究Fr.3組分抗肝纖維化活性機(jī)制，考察了Fr.3組分作用后，對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的Smad、MAPK以及PI3K/AKT信號(hào)通路中相關(guān)磷酸化蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的影響。研究表明：Fr.3組分可以顯著下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的 Smad2、AKT、ERK 及 p38磷酸化蛋白質(zhì)表達(dá)水平，而Smad、PI3K、MAPK信號(hào)通路，與肝星狀細(xì)胞的激活、增值、遷移等有關(guān)[14-16]。綜上所述，F(xiàn)r.3組分通過調(diào)控 Smad、PI3K、MAPK信號(hào)通路，抑制細(xì)胞增值、遷移及ECM的積累，進(jìn)而抑制肝纖維化。王靜等在建立的PDGF-BB誘導(dǎo)的肝纖維化模型基礎(chǔ)上，研究了樟芝提取物Fr.2組分通過調(diào)控MAPK信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制肝纖維化[7]，因此樟芝不同提取物Fr.2、Fr.3組分都能有效抑制肝纖維化細(xì)胞的增值、遷移，F(xiàn)r.2、Fr.3組分可能是通過調(diào)控多種信號(hào)通路綜合作用抑制肝纖維化。

后期需要對(duì)樟芝提取物Fr.3組分進(jìn)一步分離純化，分析鑒定Fr.3組分中主要活性化合物，并且建立四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，評(píng)價(jià)其體內(nèi)抗肝纖維化活性，同時(shí)結(jié)合體外細(xì)胞模型，研究其抗肝纖維化作用機(jī)制，為治療肝纖維化的研究提供理論依據(jù)。