多指標(biāo)評(píng)價(jià)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抑菌性能

章銀良 李 鑫 蔡亞玲

1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院 河南鄭州 450001 2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心 河南鄭州 450001

隨著食品行業(yè)迅猛發(fā)展，一些食品安全問題浮出水面，怎樣有效防止食品腐敗變質(zhì)成為食品企業(yè)首要解決的問題[1]。

在現(xiàn)代食品工業(yè)中最常使用的食品保鮮技術(shù)有低溫保鮮、氣調(diào)保鮮，涂膜保鮮和化學(xué)保鮮。其中化學(xué)保鮮是使用化學(xué)藥劑對(duì)食品進(jìn)行處理來達(dá)到防止食品腐敗變質(zhì)的目的，這些用于食品保鮮作用的化學(xué)制劑皆可稱之為防腐劑，食品防腐劑一般按照原料來源的不同可劃分為化學(xué)合成防腐劑和天然防腐劑兩種[2，3]。

為防止或減少食品腐敗、變色和風(fēng)味惡化，在食品中常使用人工合成防腐劑(如山梨酸鉀、苯甲酸鈉等)，其使用有一定的限量，并且化學(xué)合成抗菌防腐劑均有一定的毒副作用[4]，因此對(duì)合成防腐劑的擔(dān)憂使得人們?nèi)ふ夷馨l(fā)揮同樣作用的替代品。美拉德反應(yīng)在食品加工和儲(chǔ)藏過程中是自然發(fā)生的一類非酶褐變反應(yīng)[5]，由于其MRPs中含有大量的具有抑菌活性的物質(zhì)[6]，所以將其應(yīng)用在食品中替代一些合成防腐劑成為日后研究工作的重點(diǎn)。

隨著人們安全意識(shí)不斷提高，天然防腐劑受到國(guó)內(nèi)外的關(guān)注，Einarsson[7](1983)等人曾發(fā)現(xiàn)美拉德產(chǎn)物的抑菌效果與微生物的種類有關(guān)。因此，本文通過對(duì)L-賴氨酸和D-果糖MRPs、L-精氨酸和D-葡萄糖MRPs進(jìn)行抑菌試驗(yàn)來探索其對(duì)多種菌生長(zhǎng)狀況的影響，研究其是否能夠抑制不同種菌的生長(zhǎng)，為開發(fā)營(yíng)養(yǎng)健康并具有獨(dú)特MRPs風(fēng)味的食品提供了一定的理論依據(jù)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以期為延長(zhǎng)食品的貨架期提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-賴氨酸、D-果糖、L-精氨酸、D-葡萄糖：Solarbio試劑公司。

生化試劑，蛋白胨、氯化鈉、酵母粉、瓊脂:北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

無(wú)水乙醇，分析純，國(guó)藥集團(tuán)有限公司。

去離子水。

1.1.1 指示菌

枯草芽孢桿菌(BNCC188080 Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Trans·T1、Top10、BL21)、酵母菌(MQ3-23、MQ3-11、MQ1-23、MQ3-21、MQ3-18、MQ2-6)、釀酒酵母(ACCC20032 Saccharomyces carlsbergensis)，11種受試菌株來自于本實(shí)驗(yàn)室保藏。

菌懸液：細(xì)菌在37℃下?lián)u床培養(yǎng)約2h和真菌在28℃下?lián)u床培養(yǎng)約4.5h得到的濃度為(1.0～5.0)106CFU/mL菌液[8]。

1.1.2 指示菌培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨2%，酵母粉1%，葡萄糖2%，瓊脂2%。

LB培養(yǎng)基：Nacl 1%，蛋白胨1%，酵母粉0.5%，瓊脂1.5%～2%。

1.2 儀器與設(shè)備

牛津杯(內(nèi)徑6.0mm，外徑8.0mm，高10.0mm)；檢測(cè)專用培養(yǎng)皿(內(nèi)徑90mm，高15mm)；美國(guó)Rainin瑞寧Pipet-Lite XLS移液槍：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；YZJ-SCT121超凈工作臺(tái)：東莞市華旗凈化工程有限公司；SQP電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；DNP-9162BS電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；HJ-3恒溫磁力加熱攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：廣州越特科學(xué)儀器有限公司；pH計(jì)：瑞士梅特勒-托利多公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-1智能型數(shù)顯恒溫油浴槽：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；101-2電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；DNP-9162BS恒溫震蕩培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 抑菌效果最佳的MRPs制備

依據(jù)前期均勻試驗(yàn)中優(yōu)化得出的制備MRPs的最佳反應(yīng)條件。準(zhǔn)確稱取D-葡萄糖3.6032g和L-精氨酸10.4520g(摩爾比1∶3)，溶解于90mL的去離子水中，置于恒溫磁力攪拌器上攪拌至溶液清澈，再用3mol/L的HCl和3mol/L的NaOH調(diào)整溶液pH值至12.0，最后用事先調(diào)好的pH值為12.0的溶液定容到100mL，混合均勻后，取10mL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到25mL具塞試管中，密封嚴(yán)實(shí)后，置于120℃恒溫油浴鍋中反應(yīng)210min。反應(yīng)結(jié)束后置于冰水中冷卻。再準(zhǔn)確稱取D-果糖10.8096g和L-賴氨酸2.9238g(摩爾比3∶1)溶解于90mL的去離子水中，制備條件為加熱時(shí)間90min、反應(yīng)初始pH值調(diào)至10.0、溫度120℃，余下制備步驟同上。

1.3.2 MRPs抑菌效果的研究

1.3.2.1 牛津杯法測(cè)定抑菌活性

按照Huang TH(2012)[9]、李冬梅[10](2006)等的方法稍作改動(dòng)，在無(wú)菌條件下，將經(jīng)過高壓蒸汽滅菌的固體培養(yǎng)基(酵母用YPD培養(yǎng)基，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌用LB培養(yǎng)基)冷卻溫度至40～45℃之間，倒平板。取200μL濃度為(1.0～5.0)×106CFU/mL的菌液轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基平板表面并涂布均勻，將涂布棒灼燒殺菌然后冷卻，用于均勻涂布菌液。用經(jīng)滅菌的鑷子夾取已滅菌的牛津杯擺放于中央，用移液槍吸取200μLMRPs加入牛津杯內(nèi)(細(xì)菌加入果糖和賴氨酸MRPs，酵母菌加入葡萄糖和精氨酸MRPs)，同時(shí)做試劑空白和陽(yáng)性對(duì)照。酵母陽(yáng)性對(duì)照試劑用乳酸，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌用氯霉素，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。測(cè)量抑菌圈直徑，并計(jì)算3次平行試驗(yàn)的平均值。

1.3.2.2 菌落總數(shù)的測(cè)定

參考GB4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行。用100μL微量移液槍分別吸取培養(yǎng)好的菌液100μL，沿管壁緩慢注于盛有900μL稀釋液的無(wú)菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管使其混合均勻,制成1∶10的樣品菌液。然后按照以上步驟制備10倍系列稀釋菌液。每種菌液分別得到以下七個(gè)濃度梯度：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。之后通過預(yù)試驗(yàn)選擇適宜稀釋度(酵母菌稀釋10-4、細(xì)菌稀釋10-5)的菌液，分別吸取40μL菌液和200μLMRPs(細(xì)菌加入果糖和賴氨酸MRPs，酵母菌加入葡萄糖和精氨酸MRPs)混合后加入兩個(gè)培養(yǎng)基，用涂布棒涂布均勻。同時(shí)取40μL菌液分別加入另兩個(gè)培養(yǎng)基，涂布均勻作陰性對(duì)照。再分別取200μLMRPs加入兩個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)基作空白對(duì)照。涂布結(jié)束后，將平板翻轉(zhuǎn)，細(xì)菌移至37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，酵母菌移至28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)36h。培養(yǎng)完成后，觀察菌的生長(zhǎng)情況，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.2.3 抑菌率的測(cè)定

參照黃國(guó)文[11](2017)、雷歡[12](2017)等的方法。取100mL液體培養(yǎng)基和100mL混合液體培養(yǎng)基(10mL MRPs+90mL液體培養(yǎng)基)分別作為A1、A2的空白對(duì)照組。然后用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)試其吸光度(酵母菌培養(yǎng)液在560nm處測(cè)量，細(xì)菌培養(yǎng)液在600nm處測(cè)量)，并記錄。取22支試管分成兩組(各11只)，第一組每管加入5mL含有MRPs的液體培養(yǎng)基和40μL菌液，第二組每管加入5mL液體培養(yǎng)基與40μL菌液，分別貼上標(biāo)簽，塞上塞子用報(bào)紙包裹，放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱里細(xì)菌37℃培養(yǎng)4h，酵母菌28℃培養(yǎng)8h，培養(yǎng)完成后分別用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度，每對(duì)試管做3組平行(細(xì)菌組加入果糖和賴氨酸MRPs，酵母菌組加入葡萄糖和精氨酸MRPs)。

抑菌率計(jì)算公式如下：

抑菌率=(A1-A2)/A1

式中：

A1為不加MRPs組培養(yǎng)菌液的吸光度；

A2為加入MRPs培養(yǎng)的菌液吸光度

1.3.2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

參照Anis Ben Hsouna[13](2011),Sweetie R.Kanatt[14](2008)等的方法。采用二倍連續(xù)稀釋法測(cè)定[15]MRPs的最小抑菌濃度。取10支無(wú)菌試管編號(hào)，每支試管各加入5mL的液體培養(yǎng)基。無(wú)菌移液槍吸取5mLMRPs至1號(hào)試管，混勻后從1號(hào)試管吸取5mL至2號(hào)試管，以此類推，直至9號(hào)試管(棄去5mL)，分別將MRPs稀釋2、4、8、16、32、64、128、256、512倍，除9號(hào)試管外各加入40μL制備好的菌懸液，9號(hào)作為陰性對(duì)照，10號(hào)作為陽(yáng)性對(duì)照。搖床培養(yǎng)后，從每支試管各吸取40μL至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，并用無(wú)菌涂布棒涂布均勻，每支試管做3個(gè)平行。上述操作完畢后，將所有平板放置于(細(xì)菌37℃，真菌28℃)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，查看各平板內(nèi)各菌落的生長(zhǎng)情況，其中完全沒有菌生長(zhǎng)的平板對(duì)應(yīng)的最低稀釋濃度即為最小抑菌濃度(MIC)[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MRPs對(duì)不同菌種的抑菌活性的比較

2.1.1 牛津杯法測(cè)定抑菌活性

以抑菌圈直徑為測(cè)試指標(biāo)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)不同菌種的抑制效果分別用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，試驗(yàn)結(jié)果如表1和表2所示。

表1 MRPs對(duì)不同真菌的抑菌作用

如表1所示，通過方差分析和多重比較，得出葡萄糖和精氨酸MRPs對(duì)所測(cè)酵母菌均有不同程度的抑制，抑菌作用從大到小為MQ1-23>MQ3-18>MQ3-21>釀酒酵母>MQ3-11>MQ3-23>MQ2-6，其中對(duì)MQ1-23的抑制效果最好。因?yàn)榕＝虮睆綖?mm，如果抑菌圈直徑小于8mm則代表無(wú)明顯的抑菌效果，所以從表2我們可以得出，果糖和賴氨酸MRPs對(duì)BL21抑制作用比較弱。同一濃度的MRPs對(duì)不同菌種的抑菌效果也不相同，其中抑菌作用從大到小為Trans·T1>TOP.10>枯草芽孢桿菌>BL21。

表2 MRPs對(duì)不同細(xì)菌的抑菌作用

注：1.表中“-”表示抑菌圈直徑≤8mm，無(wú)明顯抑菌作用。

2.同一行中，具有不同字母的表示差異顯著(p<0.05)，具有相同字母的表示差異不顯著(p>0.05)。

從試驗(yàn)結(jié)果中可以看出美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)真菌和細(xì)菌均有一定的抑菌效果。其中葡萄糖精氨酸MRPs對(duì)MQ1-23酵母菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑為25.58±0.49mm；果糖賴氨酸MRPs對(duì)大腸桿菌Trans·T1的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑為21.69±0.47mm。

2.1.1 菌落總數(shù)法測(cè)定結(jié)果分析

以菌落總數(shù)為指標(biāo)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)不同菌種的抑制效果如圖1所示。

圖1 不同MRPs對(duì)細(xì)菌和真菌的抑菌作用Fig.1 The bacteriostatic effects to bacereia and fum juus from

從圖1中我們可以看到在加入美拉德反應(yīng)產(chǎn)物后大腸桿菌Trans·T1從66減少到7，酵母菌MQ3-18從107減少到24，這兩種菌的菌落總數(shù)減少的幅度最大分別為89.39%和77.57%，酵母菌MQ1-23加入MRPs后菌落總數(shù)從79下降至19，減少幅度也很可觀為75.95%且僅次于MQ3-18位居第二。從圖1中我們還可以看出MRPs對(duì)這11種指示菌皆有不同程度的抑制作用，這與Einarsson[7](1983)等人曾提出的美拉德產(chǎn)物的抑菌效果與微生物的種類有關(guān)這一發(fā)現(xiàn)相符。

2.1.2 抑菌率法測(cè)定結(jié)果分析

以吸光度為指標(biāo)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)不同菌種的抑制效果如圖2所示。

圖2 不同MRPs對(duì)細(xì)菌和真菌的抑制效果Fig.2 The bacteriostatic effests to bacreria and fum jus from differemt MRPs

由圖2可得不管是細(xì)菌還是真菌，抑菌培養(yǎng)完成后，不添加美拉德反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)菌液的吸光度均高于添加美拉德反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)菌液的吸光度，說明MRPs對(duì)這些菌的生長(zhǎng)是有抑制作用的。從圖2中我們可以得出如下結(jié)論：美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)以上11種菌抑制強(qiáng)度存在差異，其中葡萄糖精氨酸對(duì)MQ2-6、MQ3-23、MQ3-11的抑菌率偏小，可能是因?yàn)樵诰号囵B(yǎng)的開始階段MRPs中未反應(yīng)完全的葡萄糖促進(jìn)了酵母菌的生長(zhǎng)[17]。另外葡萄糖精氨酸MRPs對(duì)MQ1-23抑制作用最強(qiáng)，抑菌率為68.15%；果糖賴氨酸MRPs對(duì)大腸桿菌Trans·T1的抑制效果最好，抑菌率為78.60%。

2.1.3 最小抑菌濃度(MIC)法測(cè)定結(jié)果分析

按照1.3.2.4所述試驗(yàn)方法及步驟，采用二倍連續(xù)稀釋法測(cè)定MRPs對(duì)11種常見腐敗菌的最小抑菌濃度(MIC)結(jié)果見表3。

如表3所示，MRPs對(duì)這11種指示菌均有不同程度的抑制作用。當(dāng)MRPs濃度在稀釋16倍以下時(shí)，Trans·T1、TOP.10、枯草芽孢桿菌均不生長(zhǎng)；當(dāng)MRPs濃度在稀釋倍數(shù)在4倍以下時(shí)，BL21、MQ3-11、MQ3-23、MQ3-18、MQ3-21、釀酒酵母均不生長(zhǎng)；其中抑制酵母菌MQ1-23所需MRPs最小抑菌濃度最小為稀釋倍數(shù)在32倍時(shí)。

表3 MRPs對(duì)供試菌的最小抑菌濃度

注：“—”表示無(wú)供試菌生長(zhǎng)；“+”表示有供試菌生長(zhǎng)；9號(hào)試管為陰性對(duì)照；10號(hào)試管為陽(yáng)性對(duì)照。

3 結(jié)論

我們用抑菌圈、菌落總數(shù)、抑菌率、最小抑菌濃度四個(gè)指標(biāo)來檢測(cè)MRPs對(duì)食物中常見細(xì)菌和真菌的抑制效果，并從4組數(shù)據(jù)中可以得出MRPs對(duì)大腸桿菌BL21的抑制效果比較弱，但對(duì)其它十種供試菌均有不同程度的抑制作用，并且綜合分析四個(gè)指標(biāo)可以得出MRPs對(duì)酵母菌MQ1-23和大腸桿菌Trans·T1的抑制效果是最明顯的。此外，由最小抑菌濃度分析可知，隨著MRPs添加量的增大，抑菌作用會(huì)逐漸增強(qiáng)。因此可以考慮MRPs作為一種防腐劑添加入食品中，提高其抑菌能力、保持其感官特性并延長(zhǎng)貨架期。