響應(yīng)面法優(yōu)化斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟油的水酶法提取工藝研究

安徽富煌三珍食品集團(tuán)有限公司 安徽巢湖 238076

斑點(diǎn)叉尾鮰魚原產(chǎn)于北美洲，是一種具有重要商業(yè)價(jià)值的淡水魚，受到了世界廣大消費(fèi)者的青睞，斑點(diǎn)叉尾鮰魚肉味鮮美，無肌間刺，主要用于生產(chǎn)鮰魚片；但是，加工過程中產(chǎn)生大量的包括內(nèi)臟等下腳料(占原料的40%～55%)，主要用于生產(chǎn)飼料魚粉，對(duì)其中的油脂等營(yíng)養(yǎng)成分開發(fā)程度不高。內(nèi)臟油脂作為下腳料的重要組成部分之一，大約占了整個(gè)魚體重的10%，具有很大的開發(fā)潛力。同時(shí)魚油中含有豐富的EPA、DHA等多不飽和脂肪酸，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可以調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防老年癡呆、提高記憶力、提高免疫力等[1～3]。

傳統(tǒng)的魚油提取工藝中的溶劑萃取法、蒸煮法具有提取率低的缺點(diǎn)、淡堿水解法具有提取過程不易控制，提取率不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，而酶解法提油具有提取率高、反應(yīng)條件穩(wěn)定、有效成分損失少等優(yōu)點(diǎn)[4]。

本文在酶解法提油工藝基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，采用水酶法對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟油進(jìn)行提取，通過響應(yīng)面法優(yōu)化了對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟油提取的工藝條件，最終得出了水酶法提油最佳的工藝參數(shù)，為斑點(diǎn)叉尾鮰魚的綜合利用及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟：安徽富煌三珍公司提供，實(shí)驗(yàn)前去膽去鰾清洗干凈后用組織搗碎機(jī)打碎勻漿，冷藏備用。

酶制劑：木瓜蛋白酶(標(biāo)注活力80萬U/g)，南寧龐博生物工程有限公司。

L-酪氨酸：上?？到萆锟萍及l(fā)展有限公司。

酪蛋白：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

三氯乙酸(AR)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

氫氧化鈉(AR)：汕頭市西隴化工廠有限公司。

鹽酸(AR)：上海振企化學(xué)試劑有限公司。

高純氮?dú)猓汉戏时娨婊ぎa(chǎn)品有限責(zé)任公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

TU-1810紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

B11-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司。

AL204-IC分析天平:梅特勒托利多儀器(上海)有限公司。

PHS-3C精密PH計(jì)：上海大普儀器有限公司。

FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

臥式冷凍冷藏可轉(zhuǎn)換冷柜：廣州市穗凌電器有限公司。

TGL-16C高速離心機(jī)：安亭科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水酶法提油工藝流程[5]

原料→清理、勻漿→調(diào)液料比→調(diào)pH→加酶→保溫酶解→離心→粗魚油。

將去膽囊、魚鰾及腸內(nèi)雜質(zhì)并清洗干凈的斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟原料解凍后，然后用組織搗碎機(jī)將內(nèi)臟搗碎，加水調(diào)整液料比(mL/g),用4mol/L的NaOH或HCL調(diào)解酶解液的初始pH值，加入一定量的木瓜蛋白酶，一定溫度下，恒溫水解一段時(shí)間，趁熱在5 000g的離心力下離心10min，分離出上層魚油。

根據(jù)下式計(jì)算魚油提取率：

注：原料中魚油質(zhì)量測(cè)定按照《GB5009.6-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》的方法進(jìn)行；魚油提油率下述簡(jiǎn)稱“提油率”。

1.2.2 木瓜蛋白酶活性的測(cè)定

參照黃春喜等(2012)[6]，zhen-xingtang等(2006)[7]測(cè)定木瓜蛋白酶活性。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以提油率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究不同的液料比、加酶量、酶解pH、溫度、時(shí)間對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟油提油率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提油率為指標(biāo)，利用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件的one-way ANOVA 和TuKey多重比較來檢驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)的差異，當(dāng)p<0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著。采用Design-Expert進(jìn)行響應(yīng)面分析，所有數(shù)據(jù)和圖表均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 水酶法提取斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟油的單因素分析

2.1.1 液料比對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟油提油率的影響

設(shè)定pH值7.5、加酶量3 000U/g、時(shí)間60min、溫度60℃，探討不同液料比(mL/g)(0.25∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟油提油率的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，隨著液料比的增加，提油率先增加，后降低，在液料比mL/g為1∶1時(shí)，提油率最高。這是由于液料比偏低時(shí)，參加反應(yīng)的底物濃度大，分散性差，可能導(dǎo)致較多的底物聚集在酶的活性中心，降低酶的生化活性；液料比偏高時(shí)，反應(yīng)體系濃度低，不利于反應(yīng)的進(jìn)行，而且給后期的離心分離帶來了一定的困難，綜合考慮，確定最佳的液料比mL/g為1∶1。

2.1.2 加酶量對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟油提油率的影響

設(shè)定pH值7.5、液料比(mL/g) 1∶1、時(shí)間60min、溫度60℃，探討不同加酶量(1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000、4 500U/g)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟油提油率的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著加酶量的增加，提油率增加速率由前期顯著至后期趨于平穩(wěn)，在加酶量為3 500U/g時(shí)，提油率增速趨于平穩(wěn)。這是由于隨著加酶量的增加，底物濃度逐漸趨于飽和的緣故，綜合考慮生產(chǎn)成本和反應(yīng)速率等因素，初步確定最佳的加酶量為3 500U/g。

2.1.3 pH值對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟油提油率的影響

設(shè)定加酶量3 500U/g、液料比(mL/g) 1∶1、時(shí)間60min、溫度60℃，探討不同pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟油提油率的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著pH值的增加，提油率先增加后降低，pH值7.0時(shí)，提油率最高。這是因?yàn)楦鞣N酶在一定的條件下都有其最適宜的pH值，pH值偏高或偏低都會(huì)造成酶解效果下降。因此，在本試驗(yàn)給定的條件下，初步確定最佳的pH值為7.0。

2.1.4 溫度對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟油提油率的影響

設(shè)定加酶量3 500U/g、液料比(mL/g) 1∶1、時(shí)間60min、pH值7.0，探討不同溫度(40、45、50、55、60、65、70、75、80℃)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟油提油率的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，隨著溫度的增加，提油率先增加后降低，溫度60℃時(shí)，提油率最高。這是因?yàn)樵谝欢囟确秶鷥?nèi)隨著溫度的升高，酶活性增強(qiáng)；但是溫度過高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致蛋白酶變性，造成其反應(yīng)活性下降。因此，在本試驗(yàn)條件下，初步確定最佳的溫度為60℃。

2.1.5 時(shí)間對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟油提油率的影響

設(shè)定加酶量3 500U/g、液料比(mL/g) 1∶1、溫度60℃、pH值7.0，探討不同時(shí)間(15、30、60、90、120、150、180min)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟油提油率的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，提油率呈現(xiàn)先升高后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。這是由于在一定反應(yīng)條件下，隨著系統(tǒng)反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶與底物的作用趨于徹底，同時(shí)與蛋白結(jié)合的油脂也逐漸釋放出來；后期增速緩慢主要是因?yàn)榻^大多數(shù)的結(jié)合油脂已經(jīng)釋放出來了?？紤]到持續(xù)加熱會(huì)導(dǎo)致提取油脂色澤加深及造成不飽和脂肪酸氧化，綜合考慮，初步確定最佳的時(shí)間為60min。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

利用Design-Expert建立的提油率Y與影響因素之間的二次多項(xiàng)回歸模型為：Y=84.77+1.30×A-0.92×B+4.40×C+1.67×D+0.59×A×B+1.35×A×C+0.26×A×D+0.77×B×C-0.78×B×D+2.87×C×D-2.51×A2-0.34×B2-5.27×C2-4.37×D2。

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果詳見表2。

2.2.2 響應(yīng)面曲線圖

響應(yīng)面曲線圖詳見圖6～圖11。

組別A溫度/℃B加酶量/U·g-1C時(shí)間/minDpH值Y提油率/%1654000607.083.41±2.562553500907.078.46±1.123603500607.085.39±0.484553500606.575.86±1.805603000606.577.71±1.426553500607.579.20±0.917554000607.077.62±1.088553500307.073.37±0.859604000606.579.56±1.3810604000907.082.7±1.4311603500906.575.48±1.0312604000307.071.98±2.0813603500607.083.79±1.4914603500307.568.68±1.1915653500607.580.15±0.9216604000607.581.49±0.8517653500606.575.77±1.2018603500907.583.86±1.1219603500306.571.79±0.8120653000607.084.66±0.5521603000307.076.89±0.8622603000907.084.51±1.2323553000607.081.25±1.0324653500907.083.95±0.7925603000607.582.77±0.7526603500607.085.12±0.6227653500307.073.45±1.33

2.2.3 二次多項(xiàng)回歸模型方差分析

通過表3的二次多項(xiàng)回歸模型方差分析可看出：模型顯著性檢驗(yàn)極顯著(p<0.01)，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。自變量一次項(xiàng)A(溫度)、C(時(shí)間)、D(pH)極顯著(P<0.01)、B(加酶量)顯著(P<0.05)；二次項(xiàng)CD、A2、C2、D2極顯著(p<0.01)。失擬項(xiàng)P值為0.3040>0.05，表明無失擬因素存在，因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

回歸系數(shù)R2(0.9339)、校正決定系數(shù)R2(0.9219)均大于0.80和變異系數(shù)1.67%，進(jìn)一步表明模型擬合優(yōu)度較好。

表3 二次多項(xiàng)回歸模型方差分析

2.3 最佳提取方案驗(yàn)證

在單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面分析的基礎(chǔ)上，通過數(shù)學(xué)模型優(yōu)化的最佳提取工藝參數(shù)為：時(shí)間75.2min、液料比(mL/g) 1∶1、溫度61.51℃、pH值7.23、加酶量3 000.06U/g，預(yù)測(cè)魚油提取率為87.0%；為便于操作，確定最佳的提取工藝參數(shù)為：時(shí)間75min、液料比(mL/g) 1∶1、溫度61.5℃、pH值7.2、加酶量3 000U/g。在最佳條件下，得到的魚油提取率為86.34%，結(jié)果與預(yù)測(cè)基本吻合。由此可見響應(yīng)面法得到的魚油提取率具有較高的可靠性。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以魚油提取率為指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及分析，最終得到最佳的提取工藝參數(shù)為：時(shí)間75min、液料比(mL/g) 1∶1、溫度61.5℃、pH值7.2、加酶量3 000U/g，在最佳條件下，得到的魚油提取率為86.34%。經(jīng)方差分析得知A(溫度)、C(時(shí)間)、D(pH)極顯著(p<0.01)、B(加酶量)顯著(p<0.05)；二次項(xiàng)CD、A2、C2、D2極顯著(p<0.01)。驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)一步表明，響應(yīng)面分析方法可以較好地優(yōu)化斑點(diǎn)叉尾鮰魚內(nèi)臟油的水酶法提取工藝，對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。