靈芝及其產(chǎn)品中麥角甾醇物質(zhì)的測定方法

1. 湛江中醫(yī)學(xué)校，廣東 湛江 524094;2. 廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070

靈芝為多孔菌科真菌赤芝GauodermaLucidum(Leyss. ex Fr.)Karst.或紫芝GauodermasinenseZhao Xu et Zhang的干燥子實體，具有補氣安神、止咳平喘之功效[1]。靈芝是傳統(tǒng)的名貴滋補中藥，也是常見的保健食品，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。隨著生活水平的提高，越來越多的消費者喜愛購買靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品保健養(yǎng)生，尤其腫瘤病患者，更是樂于購買這些產(chǎn)品作輔助治療。靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品產(chǎn)量雖大但監(jiān)管依據(jù)未健全，若沒有有效的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，靈芝及其加工品很難從外表判斷其質(zhì)的優(yōu)劣，若不法商家以次充好，輕則給消費者造成經(jīng)濟(jì)損失，重則加重了原有的病情而危及人身安全，因此建立靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品有效的質(zhì)量控制方法是非常有必要的[2]。

目前行業(yè)內(nèi)公認(rèn)的傳統(tǒng)功校驗證指標(biāo)尚顯粗放，缺乏對靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法。因麥角甾醇類是菌類植物中特有成分，具有調(diào)節(jié)新陳代謝、調(diào)節(jié)激素水平、預(yù)防心血管疾病等功能，且在靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品中含量較高，可作為評價靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的有力質(zhì)量控制指標(biāo)。故本研究建立了HPLC測定靈芝及其產(chǎn)品中麥角甾醇含量的方法，以期為靈芝及其產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供有效方法和檢驗依據(jù)[3-4]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 安捷倫高效液相色譜；電子天平；水浴鍋；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；循環(huán)水式真空泵；超聲波清洗器。

1.2 材料 色譜純甲醇；去離子純凈水；95%乙醇；分析純石油醚。

麥角甾醇對照品購于中國藥品生物制品檢定所；靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品均由廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[4-5]色譜柱：Agilent prep-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm )；流動相：98%純甲醇；檢測波長：282 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：28 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；外標(biāo)法測定。

2.2 對照品溶液的制備 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密稱定麥角甾醇對照品10 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻超聲，即得(每1 mL中含麥角甾醇0.2000 mg)。

2.3 供試品溶液的制備[6]靈芝提取物溶液：取本品1.0 g(n=3)，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇溶解，超聲處理60 min，取出，放冷，用甲醇補足減失的質(zhì)量，過濾，取濾液過0.45 μm微孔濾膜，置4 ℃冰箱保存。孢子油溶液：取靈芝袍子油0.5 g(n=3)，精密稱定，置10 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得，過0.45 μm微孔濾膜，置4 ℃冰箱保存。

靈芝菌絲體/靈芝子實體/靈芝孢子粉/全靈芝孢子粉溶液：精密稱取樣品1.0 g(n=3)，加95%乙醇50 mL，恒溫85 ℃水浴，回流1 h，過濾，于殘渣中分別按上面方法提取3次，合并濾液，減壓濃縮，用甲醇定容至10 mL，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，置4 ℃冰箱保存。

2.4 供試品溶液制備方法的優(yōu)選[7-8]

2.4.1 提取方法的選擇 取干燥靈芝子實體1 g，用95%乙醇浸泡過夜，濾出上清液；殘渣中加95%乙醇后超聲30 min或85 ℃回流1 h，過濾合并濾液，濃縮，定容至10 mL，過0.45 μm濾膜，進(jìn)樣分析。實驗結(jié)果表明，采用回流提取方法測得的麥角甾醇含量高于超聲提取方法，故本實驗采用回流提取。見表1。

表1 提取方法試驗結(jié)果

2.4.2 提取溶劑的選擇 取干燥靈芝子實體1 g，分別用甲醇、95%乙醇、石油醚等不同溶劑，以上述回流方式處理，結(jié)果表明采用甲醇為提取溶劑的麥角甾醇提取量最高，乙醇提取略次之，考慮到用乙醇的毒性及成本均低于甲醇，故選擇乙醇為提取溶劑。見表2。

表2 不同溶劑回流提取試驗結(jié)果

2.4.3 正交實驗比較回流所用的料液比、提取次數(shù)及提取時間的組合選擇 選取料液比、提取次數(shù)及提取時間作為考察因素，分別記為因素A、因素B和因素C，作三因素三水平正交試驗。取干燥靈芝子實體1 g，用95%乙醇浸泡過夜，濾出上清液；殘渣中加95%乙醇后按正交設(shè)計的方法在85 ℃進(jìn)行回流，過濾合并濾液，濃縮，定容至10 mL，過0.45 μm濾膜，進(jìn)樣分析。見表3、表4和表5。

表3 L9正交實驗因素與水平設(shè)計

表4 正交實驗結(jié)果

表5 正交實驗結(jié)果的方差分析表

討論：使用軟件“正交設(shè)計助手”對正交數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明各因素對綜合評分的影響都無顯著性意義。極差分析表明，因素A(料液比)為主要影響因素，其次是提取次數(shù)因素，各因素作用主次順序為A>B>C，通過綜合考慮確定，最佳方法為A3B3C1，即料液比為1∶50，提取3次，每次回流1 h。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍[9-10]分別精密吸取對照品貯備液溶液10, 8, 4, 2,1 mL置于10 mL容量瓶中。加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得不同濃度對照品溶液。過0.45 μm微孔濾膜后分別吸取20 μL標(biāo)品溶液注入液相色譜儀。以峰面積(x)為橫坐標(biāo)，對照品麥角甾醇的進(jìn)樣量(y)為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程。線性回歸方程為：y=13.32x-24.32 ，r=0.9997，結(jié)果表明麥角甾醇在20-200 μg/mL呈良好的線性關(guān)系。定量限設(shè)定為20 g/mL，最低檢出限視所用儀器信噪比而定，一般為信噪比的2～10倍，本標(biāo)準(zhǔn)檢測限位0.2 g/mL，與目前國內(nèi)文獻(xiàn)檢測限相比，具有一定優(yōu)勢。色譜圖如圖1所示。

2.6 樣品含量測定 按2. 3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)行含量測定，根據(jù)樣品測定的色譜峰面積，以外標(biāo)法計算樣品中麥角甾醇的含量，計算公式:X= C×V/(M×1 000)，式中: X為試樣中游離麥角甾醇的含量(mg/g);C為游離麥角甾醇的質(zhì)量濃度(g/ mL); V為試樣定容體積(mL); M為試樣的質(zhì)量(g)。測定結(jié)果見表6。

表6 試樣測試結(jié)果

2.7 方法性能指標(biāo)考察[11]

2.7.1 精密度試驗 精密吸取麥角甾醇對照品浴液(0.2 000 mg/mL) 20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測定其峰面積值，計算峰面積積分值RSD為0.5%, 表明該儀器精密度良好。

2.7.2 重復(fù)性試驗 精密稱量樣品6份，按1.3項方法制備，進(jìn)樣20 μL，測定其峰面積值，計算峰面積積分值的RSD為1.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗 將樣品溶液在室溫下貯存,每間隔0、2、4、8、12、24 h各進(jìn)樣20 μL，測定其峰面積，RSD為1.08%，說明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.4 加樣回收率試驗 精密稱取己知含量的供試品，分別加入麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品1.90 mg、2.40 mg、2.80 mg，按照上述樣品的制備和分析步驟測定其峰面積值，計算回收率。見表7。

由表7可知，麥角固醇的回收率在98.50%～99.93%之間，表明回收良好，此方法穩(wěn)定可靠，適宜于靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品中麥角固醇含量的測定。

表7 加樣回收率試驗結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立的HPLC 測定麥角甾醇含量的方法，能準(zhǔn)確地測定靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品中該成分的含量。經(jīng)過精密度實驗、重復(fù)性實驗、穩(wěn)定性實驗、回收率實驗驗證，該方法均符合測定要求。該方法操作簡便，穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高，特異性強，可作為靈芝及其產(chǎn)品中麥角甾醇的有效測定方法和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，對于其他真菌的麥角甾醇含量測定與質(zhì)量評價方法的建立也有參考價值和依據(jù)。