清熱除濕止痛液的提取工藝研究

潘從澤 李喜香 董云霞2 馮彥俊

1甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2 蘭州市肺科醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

清熱除濕止痛液是甘肅省中醫(yī)院協(xié)定處方制劑，由秦艽、忍冬藤、防己等十味中藥組成，具有清熱除濕，通絡(luò)止痛的功效，用于治療風(fēng)濕性、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，強(qiáng)直性脊柱炎、肩周炎、頸椎病等屬風(fēng)濕熱痹、出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛，局部紅腫灼熱等癥。歷經(jīng)多年臨床應(yīng)用效果明顯，可顯著改善風(fēng)濕熱痹型膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限、局部腫脹，發(fā)熱等局部和全身癥狀[1]?，F(xiàn)擬將傳統(tǒng)湯劑改為便于服用的合劑，對(duì)其提取工藝進(jìn)行研究，轉(zhuǎn)化為醫(yī)院制劑，更好的為臨床服務(wù)。方藥中秦艽為祛風(fēng)濕熱藥，指標(biāo)成分為龍膽苦苷，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解熱、抗炎等作用[2-4]。本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)，以龍膽苦苷為評(píng)判指標(biāo)，對(duì)清熱除濕止痛液進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，找到最佳提取條件，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)有一定指導(dǎo)意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 2695型HPLC儀，Waters 2998型光電二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；ABT100-5M電子天平(KERN德國(guó))；MH-5000型可調(diào)式電熱套(武漢格萊莫檢測(cè)設(shè)備有限公司)；AKRY-UP-1816超純化水機(jī)(成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司)；RE 5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SB-5200DTR超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 材料 秦艽、忍冬藤、防己等十味藥材均購(gòu)于蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，經(jīng)甘肅省中醫(yī)院李喜香主任中藥師鑒定，符合2015版《中國(guó)藥典》藥材項(xiàng)下規(guī)定；龍膽苦苷對(duì)照品(批號(hào)110770-201716，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，甲醇為色譜純(批號(hào)20171204，天津市福晨化學(xué)試劑廠)，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定[4-7]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symm-etry-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇：水=30∶70；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm；柱溫：25 ℃。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以龍膽苦苷峰計(jì)應(yīng)不少于4 000，分離度>1.5，龍膽苦苷對(duì)照品、清熱除濕止痛液供試品及陰性樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取龍膽苦苷對(duì)照品1.08 mg置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。

2.1.3 供試品溶液的制備 按處方比例稱(chēng)取9份含秦艽、忍冬藤、防己等十味藥材的混合飲片(78 g)，按擬定的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行水煎煮提取，濾過(guò)后濃縮至適量，加入乙醇，使含醇量達(dá)55%，靜置16小時(shí)，抽取上清液，回收乙醇至無(wú)醇味，加純化水至100 mL，得到清熱除濕止痛液。精密量取10 mL清熱除止痛液置于100 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，微孔濾膜濾過(guò)，濾液即為供試品溶液。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備 按清熱除濕止痛液處方和制備工藝制備缺秦艽的陰性樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.1.5 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液2.5、5、10、15、20 μL，按上述色譜條件依次進(jìn)樣，以進(jìn)樣量(μL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性回歸方程為：y=1 727.834 38x+15.004 19，r=0.999 94(n=5)線性范圍：0.52～4.16 μg。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，龍膽苦苷峰面積的RSD為1.24%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.1.3” 項(xiàng)下供試品溶液10 μL，分別與放置在0、2、6、10、14、24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，龍膽苦苷峰面積的RSD為1.39%(n=6)，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按處方比例稱(chēng)取處方藥材78 g，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，龍膽苦苷峰面積的RSD為1.71%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 按處方比例稱(chēng)取秦艽、忍冬藤、防己等十味藥材混合飲片39 g，平行9份，平均分為3組，每組分別按清熱除濕止痛液中龍膽苦苷含量的80%，100%，120%精密加入龍膽苦苷對(duì)照品，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共9份，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均加樣回收率為99.48%，RSD=1.67%(n=9)，表明該方法可行。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 龍膽苦苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.2 正交試驗(yàn) 以提取時(shí)間(A)、加水倍量(B)、空白(C)及提取次數(shù)(D)為考察因素[8-9]，以龍膽苦苷含量為指標(biāo)，按正交L9(34)進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果和方差分析分別見(jiàn)表2、表3和表4。

表2 因素水平表

表3 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

注：F0.05(2，2)=19.00，F(xiàn)0.01(2，2)=99.00

由極差分析結(jié)果可以得出，各因素對(duì)龍膽苦苷含量影響的大小順序?yàn)椋?A(提取時(shí)間)>B(加水倍量)>D(提取次數(shù))，其最佳工藝為A2B1D2。

由方差分析結(jié)果可知，提取時(shí)間(A)和加水倍量(B)差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而提取次數(shù)(D)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)?？紤]到藥材的提取效果，確定提取次數(shù)為3倍，得出最佳提取工藝為A2B1D3，即加水量8倍，提取3次，每次提取50 min。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照最佳提取工藝A2B1D3分別提取三批處方量藥材進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，按照“2.1.3” 項(xiàng)下方法測(cè)定龍膽苦苷的含量，取平均值，結(jié)果優(yōu)于或近似于正交試驗(yàn)的數(shù)據(jù)。驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

清熱除濕止痛液是由秦艽、忍冬藤、絡(luò)石藤、桑寄生、薏苡仁等10味中藥制成的復(fù)方制劑，其中秦艽為君藥，傳統(tǒng)用于風(fēng)濕痹痛、筋脈拘攣、骨節(jié)酸痛等病癥，廣泛用于風(fēng)濕病的治療，在本院治療膝骨關(guān)節(jié)炎疾病的眾多案例中，取得了良好的臨床效果[1]。秦艽藥材中的主要成分以龍膽苦苷為主的裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物，而龍膽苦苷為其指標(biāo)性成分[10]，選其為含量測(cè)定指標(biāo)，且對(duì)清熱除止痛液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步研究有一定的參考作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)清熱除濕止痛液提取工藝進(jìn)行優(yōu)化篩選，通過(guò)測(cè)定龍膽苦苷的含量來(lái)評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量，確定了最佳的提取工藝為加水量8倍，提取3次，每次提取50 min，適合實(shí)際生產(chǎn)，可作為后續(xù)研究的基礎(chǔ)和參考。