水稻小熱休克蛋白OsHSP20抗體特性鑒定及應(yīng)用

何婧 劉寒 郭留明 李靜 張恒木

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水稻小熱休克蛋白OsHSP20抗體特性鑒定及應(yīng)用

何婧1, 2劉寒1, 2郭留明1, 2李靜2張恒木1, 2, *

(1浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004;2浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所/省部共建植物有害生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地, 杭州 310021;*通訊聯(lián)系人, E-mail: zhhengmu@tsinghua.org.cn)

【目的】在前期克隆了一個(gè)水稻小熱休克蛋白(OsHSP20)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析該蛋白多克隆抗體的免疫反應(yīng)特性和應(yīng)用范圍，為深入鑒定該類基因的功能奠定基礎(chǔ)。【方法】利用合成多肽和其原核表達(dá)產(chǎn)物分別免疫家兔制備了相應(yīng)的多克隆抗體；ACP(Antigen-coated plate)-ELISA和dot-ELISA用于分析比較多克隆抗體效價(jià)和靈敏度；Western blot用于鑒定多克隆抗體的特異性和應(yīng)用范圍?！窘Y(jié)果】Western blot分析顯示，利用重組OsHSP20蛋白及其合成多肽所制備的多克隆抗體均可以在原核表達(dá)OsSHSP樣品中特異性檢測(cè)到1條大小與預(yù)期一致(37 kD)的條帶，表明兩種方法獲得的多克隆抗體都具有高度的特異性；ACP(Antigen-coated plate)-ELISA和dot-ELISA分析表明，利用重組蛋白制備的多克隆抗體效價(jià)和靈敏度均高于利用多肽制備的抗體。進(jìn)一步的Western blot分析顯示該抗體可用于多種植物小熱休克蛋白(SHSP)的檢測(cè)?！窘Y(jié)論】制備了OsHSP20蛋白質(zhì)抗體，且具有高度的特異性和較高的效價(jià)和靈敏度，可廣泛地用于多種單、雙子葉植物HSP20蛋白的表達(dá)分析，有助于OsHSP20及其他植物同源蛋白的功能鑒定。

小熱休克蛋白；多克隆抗體；蛋白質(zhì)印跡法

熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)是生物體細(xì)胞受到高溫等外界非生物條件刺激時(shí)產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)保守的分子伴侶蛋白，分子量大小分布為10~200 kD,其中小熱休克蛋白(small heat shock protein，SHSP)的分子量大小一般在15~30 kD，且在充當(dāng)分子伴侶時(shí)不依賴ATP[1-2]。作為生物抗逆重要防線的SHSP廣泛存在于各類生物細(xì)胞中且含量豐富，在重金屬、干旱、冷凍和氧化脅迫等諸多非生物逆境以及細(xì)胞凋亡、分化等發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要功能[3-5]。與動(dòng)物SHSP相比，植物SHSP種類更為豐富多樣，進(jìn)化過(guò)程也更為復(fù)雜；進(jìn)化樹(shù)分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明植物SHSP 至少可分為14個(gè)亞類(subfamilies)，不同亞類的SHSP 可能定位于不同的細(xì)胞器，不同的亞細(xì)胞器定位在一定程度上反映了植物SHSP功能多樣性[6]。最近的報(bào)道顯示，植物SHSP 不僅參與保護(hù)植物免受非生物逆境的傷害，還可能參與病毒等生物逆境響應(yīng)過(guò)程[7]，但對(duì)于它們的功能機(jī)制仍然了解很少。

在前期的研究中，本實(shí)驗(yàn)室在研究水稻條紋病毒與水稻互作的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)病毒侵染可改變小熱休克蛋白在水稻細(xì)胞內(nèi)的定位和分布模式，并且水稻條紋病毒復(fù)制酶可特異性地與一個(gè)水稻小熱休克蛋白(OsHSP20)在細(xì)胞質(zhì)中相互作用，表明該OsHSP20可能參與病毒侵染宿主水稻的過(guò)程[7]。生物信息學(xué)分析顯示OsHSP20在分類上隸屬于CI 類, 其C端部分(52~143 aa) 具有保守的α-晶體蛋白結(jié)構(gòu)域(α-crystallin domain，ACD)，類似的結(jié)構(gòu)多存在于小熱休克蛋白及其他分子伴侶蛋白[8-9]；定量分析顯示熱激處理和病毒侵染都顯著影響該基因的表達(dá)[7,10]；非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析顯示該蛋白在體外能形成同源二聚體或寡聚體，支持該蛋白可能通過(guò)形成同源寡聚體的方式發(fā)揮其分子伴侶活性[11]。為了進(jìn)一步分析OsHSP20的特性，本研究在前期克隆和原核表達(dá)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過(guò)合成多肽和純化的異源重組表達(dá)產(chǎn)物作為抗原制備了該蛋白的多克隆抗體，并對(duì)其效價(jià)、靈敏度和特異性進(jìn)行比較分析，以期為深入鑒定植物SHSP特性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

基因及其原核表達(dá)載體均由本實(shí)驗(yàn)室克隆、構(gòu)建并保存[10-11]。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)使用的堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)、AP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔等均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；水稻()和本氏煙()種子由本實(shí)驗(yàn)室保存，玉米()、辣椒()、蘿卜()、青菜(Linn.)、白菜(Rupr)、生菜()等蔬菜種子購(gòu)自浙江勿忘農(nóng)種業(yè)公司并按商家說(shuō)明培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱，熱激處理植物材料的條件為45℃、2 h。

1.2 重組蛋白表達(dá)與純化

將含有基因的表達(dá)載體質(zhì)粒(pET-OsHSP20)轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21(DE3)，并接種于含氨芐抗生素的固體 LB 培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)過(guò)夜；第二天轉(zhuǎn)接至大量液體培養(yǎng)基，以180 r/min轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)，當(dāng)600值約 0.6 時(shí)加入異丙基-β--硫代半乳糖苷(IPTG)繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，離心收集菌體，經(jīng)超聲波裂解后，在4℃、12 000 r/min下離心25 min，收集上清；再按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，通過(guò)鎳柱從上清液中親和層析純化重組蛋白。

1.3 多肽抗原設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)OsHSP20蛋白的氨基酸序列[10]，應(yīng)用B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)程序ABCpred[12]篩選多肽表位“DQWHRVERSSGKFLR”，該多肽經(jīng)化學(xué)合成后偶聯(lián)至載體蛋白KLH(Keyhole limpet hemocyanin)上用作抗原(AB-LIND公司合成)。

1.4 抗體制備和純化

多肽抗原和純化蛋白抗原分別溶于磷酸鹽(PBS)緩沖液，加入等體積福氏免疫佐劑，經(jīng)完全乳化后作為免疫抗原。然后采用腹腔多點(diǎn)皮下注射的方法免疫家兔，免疫3次后，采集抗血清并按照商家說(shuō)明利用親和層析柱法純化抗體。

1.5 酸性磷酸酶-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ACP-ELISA)

ACP-ELISA參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行，具體步驟如下：蛋白樣品經(jīng)包被液稀釋后，取100 μL加入96孔板中，4℃下包被過(guò)夜；包被后的96孔板，用抗體稀釋液(PBST)清洗3次；加入250 μL封閉液(5％脫脂奶粉；5 g奶粉加入100 mL 1×PBS溶液中溶解)， 37℃下封閉0.5 h；封閉后，PBST清洗，每孔加入100 μL一抗稀釋液，37℃下反應(yīng)1 h，PBST清洗3次，每次3 min；每孔加入100 μL酶標(biāo)二抗稀釋液，37 ℃下反應(yīng)1 h；PBST清洗后，每孔加入100 μL顯色液，顯色30~60 min；用酶標(biāo)儀測(cè)定OD405值。

1.6 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(dot-ELISA)

dot-ELISA法參照文獻(xiàn)報(bào)道[14]的方法，略有修改。取2 μL蛋白樣品點(diǎn)樣至硝酸纖維膜上，室溫干燥10~20 min，將點(diǎn)樣后的硝酸纖維膜移至PBS封閉液(含5％脫脂奶粉)孵育1 h；棄去封閉液，用PBS洗膜3次，再加入含一抗的稀釋液室溫下反應(yīng)1 h，用PBS洗膜3次后，于二抗稀釋液中反應(yīng)1 h；洗膜3次后，加入NBT-BICP進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.7 SDS-PAGE和Western blot

植物組織用液氮研磨成粉末，加入細(xì)胞裂解液(含0.15 mol/L Tris-HCl，6% SDS，2% β-巰基乙醇)，離心取上清，即為植物總蛋白。提取的總蛋白或純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE(濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為12%)電泳[15]后，采用半干移印系統(tǒng)(BIO-RAD公司)通過(guò)電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜(美國(guó)GE公司)。經(jīng)蒸餾水清洗后，將膜放入含5%奶粉的PBS中室溫封閉1 h；用PBS洗膜3次后，加入一抗稀釋液，室溫下反應(yīng)1 h；用PBS洗膜3次，加入二抗稀釋液，室溫下反應(yīng)1 h；再用PBS洗膜3次。然后利用eECL Western Blot 試劑盒(Millipore公司)按照商家說(shuō)明進(jìn)行顯色反應(yīng)，應(yīng)用Amersham imager 600(美國(guó)GE公司)成像系統(tǒng)獲取圖像信號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsSHSP蛋白表達(dá)純化及其多克隆抗體特異性分析

為了表達(dá)OsHSP20，將重組質(zhì)粒pET-OsHSP20轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21 (DE3)誘導(dǎo)表達(dá)1~3 h后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)分析。在含重組質(zhì)粒pET-OsHSP20 的誘導(dǎo)表達(dá)菌株樣品中均存在一條與重組蛋白預(yù)期分子量大小一致的染色較深的條帶(第3~5泳道)，約為37 kD，而僅含空載體質(zhì)粒或含重組質(zhì)粒但未經(jīng)誘導(dǎo)的宿主菌樣品中則不存在對(duì)應(yīng)的條帶(圖1-A)；采用鎳柱親和層析方法從上清液中可成功純化該重組蛋白(圖1-A)，表明OsHSP20重組蛋白獲得正確表達(dá)，且1~3 h的誘導(dǎo)表達(dá)效果無(wú)顯著差異。

利用重組表達(dá)純化的全長(zhǎng)OsHSP20蛋白及合成的肽段分別免疫家兔，制備了兩種多克隆抗體。為便于描述，將由重組全長(zhǎng)蛋白制備的多克隆抗體命名為L(zhǎng)抗體；由合成短肽制備的多克隆抗體稱為S抗體。為了分析抗體的特異性，分別以L抗體和S抗體作為一抗進(jìn)行Western blot分析（圖1-B和C）。兩種方法所制備的抗體在誘導(dǎo)表達(dá)OsHSP20重組蛋白的宿主菌裂解物樣品和純化的OsHSP20重組蛋白樣品中均檢測(cè)到一條大小一致的信號(hào)條帶，而在不含重組載體質(zhì)粒的對(duì)照大腸桿菌裂解物樣品中均未檢測(cè)到反應(yīng)信號(hào)。因此，本研究所制備的兩種多克隆抗體均能夠與目標(biāo)重組蛋白發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)且條帶單一，具有良好的特異性。

M為蛋白標(biāo)記；第1、7、9泳道為誘導(dǎo)的含空載體的E coli BL21(DE3) 宿主菌樣品；第2泳道為未誘導(dǎo)的含OsHSP20的宿主菌；第3~5泳道分別為誘導(dǎo)1、2、3 h含OsHSP20的宿主菌；第6泳道為純化的HSP20蛋白；第8、10泳道為誘導(dǎo)1 h含OsHSP20的宿主菌。

Fig. 1. Analysis of recombinant OsHSP20 (A) and specificity of L and S antibodies (B and C) by SDS-PAGE and Western blot.

2.2 ACP-ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)

測(cè)定兩種抗體的效價(jià)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用純化的重組蛋白制備的抗體效價(jià)達(dá)到1∶512000(圖2-A)，應(yīng)用合成肽段方法制備的抗體效價(jià)1∶4000(圖2-B)。相比之下，應(yīng)用純化的OsHSP20重組蛋白所制備抗體的效價(jià)明顯高于應(yīng)用合成多肽所制備抗體。

2.3 dot-ELASA法分析抗體的靈敏度

為了比較上述兩種抗體的靈敏度，將純化的0.5 μg OsHSP20重組蛋白進(jìn)行梯度稀釋，依次點(diǎn)至硝酸纖維膜上進(jìn)行斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。兩種抗體均無(wú)法識(shí)別牛血清白蛋白(BSA)，但均能有效識(shí)別稀釋至64倍的重組蛋白抗原(8 ng)；但當(dāng)重組蛋白抗原稀釋至256倍(2 ng)時(shí)，S抗體已經(jīng)檢測(cè)不到信號(hào)，因此S抗體的檢測(cè)靈敏度約8ng；而L抗體一直可有效識(shí)別稀釋至256倍的抗原，表明其靈敏度可高達(dá)2 ng。

圖2 ACP-ELISA法分析L抗體(A)和S抗體(B)的效價(jià)

Fig. 2. Titer examination of L (A) and L (B) antibodies by ACP-ELISA.

圖A、B中均為16組斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)，每組3個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)。

Fig. 3. Sensitivity analysis of L (A) and S (B) antibodies by dot-ELISA.

2.4 在檢測(cè)植物HSP20中的應(yīng)用

為了應(yīng)用OsHSP20多克隆抗體，我們提取水稻總蛋白并以效價(jià)和靈敏度均較高的L抗體為一抗進(jìn)行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)在45℃熱激處理2 h的水稻樣品中可特異性地檢測(cè)到一條顯色較強(qiáng)的條帶，且分子量與預(yù)期大小一致，而未熱激處理的水稻樣品中則未檢測(cè)到相應(yīng)的條帶(圖4)。說(shuō)明該蛋白是熱激誘導(dǎo)蛋白，可能在高溫脅迫逆境中發(fā)揮作用。為了確定L抗體是否能應(yīng)用于其他植物HSP20的檢測(cè)，分別從45℃熱激處理2 h的玉米、本氏煙、辣椒、大白菜、生菜、青菜、蘿卜等植物樣品中提取了總蛋白，并進(jìn)行Western blot分析(圖4)。L抗體在所檢測(cè)的熱激處理樣品中，均可檢測(cè)到大小一致的條帶，而在未熱激處理的植物樣品也未檢測(cè)到任何信號(hào)，這些結(jié)果表明對(duì)應(yīng)的植物HSP20與OsHSP20一樣，在正常生長(zhǎng)條件下表達(dá)水平極低，甚至檢測(cè)不到，而在高溫逆境條件下高水平表達(dá)，支持該蛋白在高溫逆境下發(fā)揮重要功能的推論；同時(shí)也表明本研究所制備的多克隆抗體可廣泛地用于檢測(cè)植物HSP20。值得注意的是，不同植物中的雜交信號(hào)有強(qiáng)弱，可能反映這些植物的HSP20和OsHSP20的同源性存在一定程度上的差異。

3 討論

抗體是研究蛋白功能的前提條件之一，OsHSP20是一類在溫度逆境下發(fā)揮重要作用的功能蛋白，目前尚未見(jiàn)有關(guān)OsHSP20抗體的報(bào)道。以KLH偶聯(lián)的合成多肽作為抗原是當(dāng)前常用的制備抗體的方法之一，相比以完整蛋白為抗原的抗體制備方法而言，該方法也有一定的優(yōu)勢(shì)，如簡(jiǎn)單快速且易獲得多肽特異性抗體[16]。因此，近年來(lái)，該方法應(yīng)用也較為廣泛。本研究應(yīng)用該方法制備的S抗體表現(xiàn)出良好的特異性(圖1-C)；但從效價(jià)和靈敏度來(lái)看，以純化的重組蛋白作為抗原所制備的L抗體具有明顯的優(yōu)勢(shì)，因此完整的OsHSP20中可能存在豐富的表位，從OsHSP20中篩選免疫原性更好的表位可能有助于進(jìn)一步提高用KLH-多肽為抗原所制備抗體的效價(jià)和靈敏度。

ACP-ELISA和dot-ELISA是常用的檢測(cè)抗體效價(jià)和靈敏度的方法，本研究采用dot-ELISA法檢測(cè)兩種抗體的效價(jià)，結(jié)果表明L抗體效價(jià)較高。但根據(jù)以上結(jié)果可知dot-ELISA方法檢測(cè)的效價(jià)明顯比間接ELISA方法高，其原因可能是由于ACP-ELISA中使用的聚苯乙烯酶標(biāo)板與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合能力較弱；而dot-ELISA中使用的硝酸纖維膜對(duì)蛋白質(zhì)的親和力更高[17-18]。如此，我們?cè)陟`敏度檢測(cè)時(shí)選擇dot-ELISA方法。有關(guān)植物HSP20抗體的研究鮮有報(bào)道，本研究制備的OsHSP20抗體，為研究該蛋白功能奠定了良好的基礎(chǔ)；同時(shí)證實(shí)了該抗體可廣泛應(yīng)用于多種植物來(lái)源的同源基因的檢測(cè)分析，拓寬該抗體的應(yīng)用范圍，為直接探索其他植物來(lái)源的同源基因功能提供了特異性抗體材料。

M為蛋白Marker；HS?熱激處理；Os?水稻；Nb?本氏煙；Zm?玉米；Ca?辣椒；So?生菜；Ec?重組表達(dá)OsHSP20蛋白的菌株；Bc?青菜；Rs?蘿卜；Bp?大白菜。

Fig. 4. Detection of HSP20s with Western blot in different plant samples.

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Characterization and Application of Antibodies Against a Small Heat Shock Protein OsHSP20 from

HEJing1, 2, LIU Han1, 2, GUO Liuming1, 2, LI Jing2, ZHANG Hengmu1, 2, *

(College of Chemistry and Life Science,,,;/,,,;*Corresponding author,:)

【Objective】In previous studies,, a gene encoding small heat shock protein, was cloned from. Here its polyclonal antibodies were prepared and analyzed for their properties of immunological reactions and range of application. 【Method】 Synthetic peptide and recombinant protein of OsHSP20 were used to immunize the rabbits for preparing the polyclonal antibodies against the protein, respectively. Antigen-coated plate (ACP)- and dot-enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) were used for comparing the titer and sensitivity of antibodies. Western blotting was used to determine the antibody specificity and the range of application. 【Result】In Western blotting assays, both antibodies were strongly reacted with a band of protein with an expected size of 37 kD, suggesting that they were specific against the OsHSP20. ACP- and dot-ELISA assays showed that the polyclonal antibody prepared from the recombinant protein had a higher titer and sensitivity than that of peptide. Further assays showed that the polyclonal antibody could be used for detection of the SHSP homologs of plants. 【Conclusion】The polyclonal antibodies were successfully prepared with high specificity, titer, and sensitivity and could be widely used to analyze the expression of HSP20 protein in a variety of monocotylous and dicotyledonous plants, which could contribute to the functional characterization of OsHSP20 and its homologs in different plants.

small heat shock protein; polyclonal antibodies; Western blot

Q785; S511.01

A

1001-7216(2019)03-0235-06

10.16819/j.1001-7216.2019.9009

2019-01-21；

2019-02-17。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31601603)；浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2019C02018)。