廣譜抗稻瘟病種質(zhì)75-1-127的褐飛虱抗性基因鑒定及分子標(biāo)記輔助選擇育種

降好宇 曾蓋 郝明 黃湘桂 肖應(yīng)輝

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廣譜抗稻瘟病種質(zhì)75-1-127的褐飛虱抗性基因鑒定及分子標(biāo)記輔助選擇育種

降好宇#曾蓋#郝明 黃湘桂 肖應(yīng)輝*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/水稻油菜抗病育種湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 長(zhǎng)沙 410128;#共同第一作者;*通訊聯(lián)系人, E-mail: xiaoyh@hunau.edu.cn)

【目的】水稻品系75-1-127攜帶廣譜抗稻瘟病基因，已被廣泛應(yīng)用于抗稻瘟病水稻品種改良。筆者育種實(shí)踐發(fā)現(xiàn)75-1-127表現(xiàn)出較強(qiáng)的褐飛虱抗性，因此鑒定該品系中的褐飛虱抗性基因并進(jìn)行分子輔助選擇育種。【方法】根據(jù)水稻品系B5中褐飛虱抗性基因和的序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增75-1-127的基因組DNA，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。采用苗期集團(tuán)法鑒定了75-1-127和B5的褐飛虱抗性表型。利用與與連鎖的分子標(biāo)記篩查了75-1-127為稻瘟病抗源回交轉(zhuǎn)育的兩系不育系后代，并鑒定了這些后代的稻瘟病抗性、褐飛虱抗性和主要農(nóng)藝性狀?！窘Y(jié)果】75-1-127中含有與B5完全一致的和序列。75-1-127和B5苗期褐飛虱抗性均為1級(jí)。在以75-1-127為抗源改良的兩系不育系中，攜帶、的單基因系或雙基因系的褐飛虱抗性均得以改良，其中雙基因聚合系的死苗率為8.5%，與供體親本75-1-127以及陽(yáng)性對(duì)照B5差異不顯著，進(jìn)一步證實(shí)75-1-127含有褐飛虱抗性基因?！窘Y(jié)論】水稻品系75-1-127攜帶褐飛虱抗性基因和，可以作為抗源應(yīng)用于水稻褐飛虱抗性育種。

水稻；褐飛虱抗性；；；分子標(biāo)記輔助育種

褐飛虱是單食性刺吸式害蟲(chóng)，吸食維管束內(nèi)汁液造成植物萎蔫、死亡，同時(shí)傳播草狀叢矮病和齒葉矮縮病等病毒誘發(fā)水稻病害，是我國(guó)南方稻區(qū)的主要害蟲(chóng)之一[1]。褐飛虱平均每年為害我國(guó)水稻面積約2.467億hm2，年均損失稻谷1.12億kg[2]，而且其繁殖力強(qiáng)、生長(zhǎng)周期短和遠(yuǎn)距離遷飛特性，我國(guó)南方稻區(qū)褐飛虱危害呈逐年加劇趨勢(shì)。施用化學(xué)農(nóng)藥是防治稻飛虱的最常用手段，然而化學(xué)防治增加生產(chǎn)成本，加劇環(huán)境污染，殺傷害蟲(chóng)的天敵，尤其是長(zhǎng)期施用造成稻飛虱種群抗藥性不斷增強(qiáng)，不利于稻作可持續(xù)發(fā)展[3]。水稻在與褐飛虱共進(jìn)化的過(guò)程中，形成了多種有效的抗性機(jī)制[1]，其中利用抗性基因培育抗性品種是抵御和防治褐飛虱危害最有效的途徑[4]。

Pathak等[5]報(bào)道水稻中存在抗褐飛虱基因，自此各國(guó)相繼開(kāi)展了水稻褐飛虱抗性基因的發(fā)掘工作。迄今，從栽培稻和野生稻挖掘的水稻抗褐飛虱主效基因至少有31個(gè)[4,6-10]，除、以外的29個(gè)抗性基因均已定位[11-12]。其中，[13]、[14]、[15]、[16]、[10]、[17]、[18]和[19]等13個(gè)褐飛虱抗性基因已成功克隆，為通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇和轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗蟲(chóng)新品種提供了優(yōu)異的抗性資源。

和是武漢大學(xué)從藥用野生稻衍生的水稻品系B5中鑒定的2個(gè)顯性主效抗褐飛虱基因，對(duì)褐飛虱生物型1、2型具有高抗性[1]。是水稻中克隆的抗褐飛虱基因，編碼由1323個(gè)氨基酸組成的NBS-LRR家族蛋白，該基因通過(guò)抗生作用發(fā)揮抗褐飛虱功能[13]。編碼一種凝集素類受體蛋白激酶，通過(guò)與OsADF互作調(diào)控防衛(wèi)基因的表達(dá)，進(jìn)而抵御褐飛虱的危害[20]。利用雜交、連續(xù)回交及分子標(biāo)記輔助技術(shù)將和基因?qū)腚s交稻恢復(fù)系，發(fā)現(xiàn)恢復(fù)系及其配制的雜交組合的褐飛虱抗性均得到顯著改良[21-23]；將和基因滲入粳稻品種或者兩系不育系遺傳背景，均有顯著增強(qiáng)褐飛虱抗性的效果[24-26]。

是從四倍體小粒野生稻與栽培稻遠(yuǎn)緣雜交、回交構(gòu)建的滲入系75-1-127中克隆的第一個(gè)水稻廣譜抗稻瘟病基因，對(duì)來(lái)自13個(gè)國(guó)家的43個(gè)稻瘟病菌株均表現(xiàn)出很高的抗性[27]，被廣泛用于分子標(biāo)記輔助選擇育種實(shí)踐改良水稻稻瘟病抗性[28-30]。近年，筆者分別利用75-1-127和B5為稻瘟病和褐飛虱抗性基因的供體親本，開(kāi)展了C815S、幫191S等水稻兩用核不育系的抗性基因聚合育種研究[31]，育種實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)75-1-127的褐飛虱抗性表現(xiàn)突出，并且在和基因附近開(kāi)發(fā)的DNA標(biāo)記不能有效區(qū)分75-1-127與B5間的多態(tài)性。因此，本研究比較了兩水稻品系目標(biāo)基因的DNA序列和褐飛虱抗性，并進(jìn)一步對(duì)源于75-1-127系譜的改良株系進(jìn)行了和基因的DNA分子標(biāo)記篩選和褐飛虱抗性鑒定，旨在鑒定出75-1-127中的褐飛虱抗性基因，并利用其創(chuàng)制聚合稻瘟病和褐飛虱抗性基因的新種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

受體親本為水稻光溫敏兩用核不育系幫191S(B191S)，稻瘟病抗性供體親本75-1-127，褐飛虱抗性供體親本B5。分別采用CO39和TN1作為稻瘟病和褐飛虱抗性鑒定的陰性對(duì)照。所有試驗(yàn)材料種子均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻科學(xué)研究所提供。

表1 用于Bph14和Bph15基因測(cè)序的PCR引物

表2 用于稻瘟病和褐飛虱抗性基因型分析的分子標(biāo)記

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料種植

所有試驗(yàn)材料夏季和冬季分別種植在湖南長(zhǎng)沙湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地和海南三亞試驗(yàn)基地。改良不育系材料在長(zhǎng)沙種植時(shí)，當(dāng)不育系幼穗分化處于Ⅳ至Ⅵ期，采用20℃~22℃的低溫冷水串灌，誘導(dǎo)植株育性轉(zhuǎn)換。在海南種植時(shí)，一般將育性敏感期安排在1~2月份，利用自然低溫誘導(dǎo)植株恢復(fù)育性自交繁種。

1.2.2 DNA測(cè)序

分別提取水稻材料75-1-127和B5的全基因組DNA，委托華智水稻生物技術(shù)有限公司進(jìn)行和基因的序列測(cè)定。區(qū)間的2個(gè)抗性效應(yīng)基因分別命名為和[13]；編碼凝集素類受體蛋白激酶(lectin receptor-like kinase，)[20]，在定位區(qū)間包含3個(gè)基因，分別命名為、和。根據(jù)參考序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物(表1)，獲取目的基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至轉(zhuǎn)錄結(jié)束位點(diǎn)產(chǎn)物，并進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序。

1.2.3 植株基因型分析

根據(jù)文獻(xiàn)[21, 32]，篩選在親本75-1-127和B191S間多態(tài)性較好的引物RM7311和RM7178，用于抗稻瘟病基因的篩選；篩選出InDel標(biāo)記76-2和SSR標(biāo)記MS5分別用于抗褐飛虱基因和的分析（表2）。PCR采用10 μL反應(yīng)體系：10×緩沖液1.0 μL，5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，2 μmol/ L引物1.0 μL，5 U/μL酶0.1 μL，DNA模板(約10 ng/μL)1.0 μL，ddH2O 6.7 μL。引物由Invitrogen公司合成，其他試劑購(gòu)自上海TaKaRa公司。PCR擴(kuò)增程序如下：95℃下預(yù)變性5 min；95℃下30 s；55℃下30 s，72℃下1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃下延伸7 min。PCR產(chǎn)物采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色后根據(jù)帶型分析基因型。

1.2.4 稻瘟病抗性鑒定

2018年夏季，在位于湖南瀏陽(yáng)大圍山的稻瘟病圃采用大田接種法鑒定稻瘟病抗性。于5月13日播種改良不育系及其受體親本B191S，將誘發(fā)品種CO39播種在試驗(yàn)材料周邊，播種后7 d，將提前在溫室接種發(fā)病的植株秧苗移栽在誘發(fā)品種周邊。播種后約30 d，CO39秧苗基本枯死，每份材料取15株按國(guó)際水稻研究所稻瘟病抗性評(píng)價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[33]調(diào)查發(fā)病等級(jí)，取平均值為該株系的發(fā)病等級(jí)。

1.2.5 稻飛虱抗性鑒定

參照黃得潤(rùn)等[34]的苗期集團(tuán)鑒定法鑒定褐飛虱抗性。每一類基因型任選一個(gè)株系為樣本，S171002、S171008和S171005分別代表單基因系、單基因系以及和聚合系。分別采用TN1和B5為感蟲(chóng)對(duì)照和抗蟲(chóng)對(duì)照，同時(shí)放入受體親本B191S和供體親本75-1-127。供試材料統(tǒng)一浸種催芽破胸后播種于小塑料缽(直徑15 cm，高5 cm)，每株系播3盆，每盆約播種50粒。待秧苗長(zhǎng)至4葉1心時(shí)，按每株5~7頭2~3齡若蟲(chóng)的標(biāo)準(zhǔn)接種褐飛虱，當(dāng)感蟲(chóng)對(duì)照品種TN1死苗率達(dá)到95%時(shí)，根據(jù)各株系水稻死苗率評(píng)定抗性級(jí)別[31,34]。

1.2.6 農(nóng)藝性狀鑒定

2018年夏季，所有試驗(yàn)材料種植在湖南長(zhǎng)沙縣江背鎮(zhèn)的北大荒墾豐種業(yè)湖南育種站試驗(yàn)基地，4月18日播種，5月14日移栽，每個(gè)株系田間分小區(qū)順序排列種植，每小區(qū)種2行，每行8株，單本栽植，株行距為20 cm×20 cm。齊穗期后每小區(qū)隨機(jī)取3株生長(zhǎng)正常的植株，隨機(jī)選取16~20個(gè)單株考查株高、穗長(zhǎng)、每穗穎花數(shù)、柱頭外露率等主要農(nóng)藝性狀。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進(jìn)行處理數(shù)據(jù)，用DPS 9.5進(jìn)行方差分析。采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

圖1 稻瘟病抗性基因分子標(biāo)記輔助選擇轉(zhuǎn)育程序

Fig. 1. Procedure of rice blast gene transfer with molecular marker-assisted selection.

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病抗性基因Pi9的回交轉(zhuǎn)移及分子標(biāo)記輔助選擇

2011年夏季，采用B191S為受體親本，以攜帶廣譜抗稻瘟病基因的水稻品系75-1-127為供體親本配制雜交組合，并收獲雜交種子。于同年冬季在海南三亞種植F1，與B191S回交獲得BC1F1種子。在BC1F1和BC2F1世代，采用與基因連鎖的標(biāo)記RM7311、RM7178分析各植株的基因型，選擇標(biāo)記基因型雜合、田間農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株作父本混合授粉B191S，獲得回交種子。在BC3F1世代，依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)選擇單株自交收種獲得BC3F2種子。2013年冬季，在海南種植BC3F2植株，采取連鎖標(biāo)記對(duì)基因進(jìn)行篩選，在標(biāo)記基因型純合單株中，根據(jù)田間農(nóng)藝性狀選擇優(yōu)良單株自交收種。此后連續(xù)多代自交繁殖，并逐代針對(duì)改良不育系的育性、異交特性、稻米品質(zhì)等性狀進(jìn)行鑒定和選擇。至2018年夏季，獲得改良的BC3F11植株(圖1)。

75, 75-1-127.

Fig. 2. PCR products ofandgene.

表3 75-1-127與B5中抗褐飛虱基因Bph14和Bph15序列相似性分析

序列位置是根據(jù)對(duì)應(yīng)基因在GenBank中的堿基序列標(biāo)定。

The location of sequence is based on the base sequence of the corresponding gene in GenBank.

2.2 水稻品系75-1-127和B5中褐飛虱抗性基因Bph14和Bph15的序列比較

根據(jù)參考序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)目的基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至結(jié)束位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，B5和75-1-127兩份材料中均含有、和(圖2)，經(jīng)BLAST分析兩份材料的基因編碼區(qū)序列完全一致(表3)，表明水稻品系75-1-127中包含褐飛虱抗性基因和。

2.3 改良系中褐飛虱抗性基因Bph14和Bph15的篩查

采用與連鎖的InDel標(biāo)記76-2、與連鎖的SSR標(biāo)記MS5，分析了B191S為受體親本、75-1-127為供體親本的18個(gè)回交株系的標(biāo)記基因型，鑒定到3個(gè)株系為純合標(biāo)記基因型，6個(gè)株系為純合標(biāo)記基因型，僅有2個(gè)株系同時(shí)為純合與標(biāo)記基因型，其余7個(gè)株系和標(biāo)記基因型均為非抗性類型。

表4 B191S不同基因型改良系的稻瘟病抗性

#感病級(jí)數(shù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(=株系數(shù)×15)；**表示改良系與受體親本B191S的稻瘟病感病級(jí)數(shù)在1%水平差異顯著。

#Values are mean±(=number of lines×15);**Means significant difference between improved lines and B191S at 1% level.

表5 B191S不同基因型改良系的褐飛虱抗性

#死苗率為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(=3)；數(shù)字后的大小寫(xiě)字母相同者分別表示在1%和5%水平上差異不顯著。

#Values are mean±(=3); The same capital and lowercase letters mean no significant difference at 1% and 5% levels, respectively.

2.4 改良材料的稻瘟病抗性鑒定

采用田間病圃對(duì)基于B191S背景、包含不同抗性標(biāo)記基因型的各株系進(jìn)行了稻瘟病抗性鑒定，感病對(duì)照CO39和受體親本B191S的感病級(jí)數(shù)分別為8.7級(jí)和7.3級(jí)(表4)。與受體親本B191S相比，包含單一稻瘟病抗性基因的B191S()、聚合和單一褐飛虱抗性基因的B191S(+)和B191S(+)以及聚合和2個(gè)褐飛虱抗性基因的B191S(++)感病級(jí)數(shù)均顯著下降，而B(niǎo)191S()、B191S(+)、B191S(+)和B191S(++)的稻瘟病抗性未表現(xiàn)出顯著差異。

表6 改良株系的主要農(nóng)藝性狀

除播始?xì)v期外，其余性狀值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(=16~20)；**表示改良系與受體親本B191S的相應(yīng)性狀在1%水平差異顯著。

Trait values are mean±except duration from seeding to heading(=16~20);**means significant difference between improved lines and B191S at 1% level.

圖3 改良材料的褐飛虱抗性鑒定

Fig. 3. Brown planthopper resistance of the improved lines and the parents.

2.5 改良材料的褐飛虱抗性鑒定

B191S和TN1苗期接蟲(chóng)鑒定后死苗率達(dá)100%，表現(xiàn)為高感；B5和75-1-127苗期抗性級(jí)別均為1級(jí)，表現(xiàn)為高抗，兩者無(wú)顯著差異(表5、圖3)。改良株系中，單基因系的死苗率為41.8%，抗性顯著低于供體親本75-1-127或者雙基因聚合系；而單基因系或者/雙基因聚合系的死苗率分別為11.5%和8.5%，與75-1-127死苗率差異不顯著。進(jìn)一步證實(shí)75-1-127含有褐飛虱抗性基因和，并且采用與B5中褐飛虱抗性基因相同的分子標(biāo)記輔助選擇同樣有效。

2.6 改良材料的農(nóng)藝性狀分析

與受體親本B191S相比，改良株系的播始?xì)v期、株高、穗長(zhǎng)、每穗穎花數(shù)、雙邊柱頭外露率和柱頭外露率等主要農(nóng)藝性狀都發(fā)生了較大變化(表6)。受體親本B191S是一個(gè)早稻類型的兩系不育系，播始?xì)v期僅為81 d，改良不育系播始?xì)v期較受體親本延長(zhǎng)4~9 d，可望配制生育期較長(zhǎng)的中晚稻組合。伴隨著株高的顯著增高，穗長(zhǎng)、每穗穎花數(shù)等性狀值也相應(yīng)增大。值得注意的是，改良株系的柱頭外露率顯著改善，較受體親本提高了5.7~7.3個(gè)百分點(diǎn)，尤其是雙邊柱頭外露率提高了7.6~8.8個(gè)百分點(diǎn)。

3 討論

本研究通過(guò)PCR產(chǎn)物測(cè)序證實(shí)75-1-127和B5存在相同的和基因序列，褐飛虱苗期集團(tuán)鑒定結(jié)果也表明75-1-127表現(xiàn)出與B5水平相當(dāng)?shù)暮诛w虱抗性，推斷75-1-127攜帶有褐飛虱抗性基因和。采用與水稻品系B5中抗褐飛虱基因與相同的DNA分子標(biāo)記，對(duì)75-1-127回交轉(zhuǎn)育的兩系不育系進(jìn)行DNA分子標(biāo)記篩選，發(fā)現(xiàn)聚合和基因的株系與供體親本75-1-127、陽(yáng)性對(duì)照品種B5苗期抗性水平基本相當(dāng)(表5)，進(jìn)一步證實(shí)上述推斷是正確的。

因攜帶稻瘟病廣譜抗性基因，75-1-127已被廣泛應(yīng)用于不同生態(tài)區(qū)域的稻瘟病抗性改良育種中[28-30]，本研究的發(fā)現(xiàn)將進(jìn)一步拓寬其育種應(yīng)用價(jià)值。一方面，利用75-1-127作為抗源進(jìn)行水稻品種抗性改良，可以同時(shí)對(duì)稻瘟病抗性基因和褐飛虱抗性基因和進(jìn)行篩選，同步改良褐飛虱和稻瘟病抗性，將大大加速育種進(jìn)程。另一方面，本研究也提示以往采用75-1-127為稻瘟病抗源改良的后代材料中，可采用與和連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行篩查，可望獲得同時(shí)兼抗稻瘟病和褐飛虱的新種質(zhì)。

B5是由兩倍體或四倍體CC染色體組的藥用野生稻衍生而來(lái)[1]，后者主要分布在亞洲熱帶、亞熱帶和澳大利亞熱帶地區(qū)[35]。75-1-127是小粒野生稻與栽培稻遠(yuǎn)緣雜交、回交構(gòu)建的滲入系[27]，四倍體BBCC染色體組的小粒野生稻分布于菲律賓以及巴布亞新幾內(nèi)亞等亞洲熱帶地區(qū)[35]。暗示起源于低緯度熱帶地區(qū)或者CC染色體組的野生稻中可能蘊(yùn)含豐富的褐飛虱抗性基因，這種類型的水稻種質(zhì)在褐飛虱抗性基因挖掘研究中值得重視。

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Identification of Brown Planthopper Resistance Genes in Broad-spectrum Blast Resistant Rice Germplasm 75-1-127 and Its Molecular Marker-Assisted Selection Breeding

JIANG Haoyu#, ZENG Gai#, HAO Ming, HUANG Xianggui, XIAO Yinghui*

(,//,,;#;*Corresponding author,:)

【Objective】Rice line, 75-1-127, which harbors the broad-spectrum blast resistance gene, has been widely used in rice variety improvement for blast resistance. Given that 75-1-127 shows strong resistance to brown planthoppers in our previous breeding projects, we identified its resistance genes to brown planthoppers and used it in molecular marker-assisted selection breeding. 【Method】The PCR products, which amplified from the genomic DNA of 75-1-127 with the primers designed according to the sequence ofandgenes in rice line B5, were sequenced and analyzed. The brown planthopper resistance of 75-1-127 and B5 were also identified with seedling bulk test method. A series of two-line genic male sterile lines derived from backcross with 75-1-127 as a donor parent, were screened with the molecular markers linked toandgenes. The blast resistance, brown planthopper resistance and main agronomic traits of these progenies were also identified and evaluated. 【Result】The sequences ofandin 75-1-127 were identical with those in B5. The resistance scores at seedling stage of 75-1-127 and B5 were both grade 1. In the progenies with 75-1-127 as resistance resource, the resistances to brown planthoppers of those monogenic lines oforand thosepyramiding lines were all improved. That the seedling mortality ofpyramiding lines was 8.5%, equivalent to the donor parents 75-1-127 and the positive control B5, further confirming that 75-1-127 contained resistance genes to brown planthoppers. 【Conclusion】Rice line 75-1-127, which carries the genes ofand, could be used as resistance resource in breeding.

rice; brown planthopper resistance;;; molecular marker-assisted selection breeding

S511.03；Q943.2

A

1001-7216(2019)03-0227-08

10.16819/j.1001-7216.2019.9005

2019-01-08；

2019-02-18。

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2016YFD0101100); 湖南省科技重大專項(xiàng)(2015NK1001-1); 湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(CX2015B255)。