響應(yīng)面法優(yōu)化牛蒡根總黃酮超聲波提取工藝

劉群群，王 燕，邱艷明，毛群芳

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖南長沙 410128；2.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W校，湖南株洲 412000）

牛蒡（Arctium lappa L.），又名惡實、大力子、東洋參，又名東洋牛鞭菜等，主要分布于中國、西歐、克什米爾地區(qū)、歐洲等地。我國牛蒡的種植地主要分布于江蘇省和山東省，尤以江蘇省的徐州豐縣、沛縣，山東省的蒼山種植歷史悠久、面積規(guī)模較大[1]。牛蒡根中含有許多藥用成分，如小分子的揮發(fā)油、多酚類、黃酮類化合物[2]、醛類，以及多炔類物質(zhì)，如綠原酸、牛蒡甙、木脂素等[3-4]，其具有多種藥物作用及保健功效，特別是對心腦血管保護、抗氧化、抗衰老、抗菌及抗病毒、保護肝腎胃腸損傷、抗疲勞、抗腫瘤、抗突變、調(diào)節(jié)糖代謝和脂代謝紊亂、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、調(diào)整腸道菌群、潤腸通便和預防男性疾病等方面都具有一定的作用[5]。已有相關(guān)研究表明，黃酮類化合物具有降血脂、降血壓、抑制血小板聚集、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用及保健功效，是一種特別有開發(fā)意義的保健品原材料[6]。

超聲波產(chǎn)生的機械振動和強烈的空化效應(yīng)會破壞細胞的結(jié)構(gòu)，能夠加速目標成分的溶出。超聲波輔助提取不僅能縮短提取時間，還避免了高溫對有效成分的破壞[7]。試驗在超聲波輔助前提下研究了提取牛蒡根總黃酮的影響因素，優(yōu)化了牛蒡根總黃酮的提取工藝條件，為牛蒡根黃酮的開發(fā)和利用提供了研究的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

牛蒡根，徐州大自然公司提供；蘆丁對照品，中國藥品生物制品檢定所提供；NaNO2、無水乙醇、Al（NO3）3、NaOH等試劑，均為分析純。

QE-5A型高速中藥粉粹機，武義縣屹立工具有限公司產(chǎn)品；CPA225D型電子分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司產(chǎn)品；101A-4型電熱鼓風恒溫干燥箱，上?？德穬x器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；KQ-100B型超聲波清洗器，鞏義市予華儀器有限責任公司產(chǎn)品；L5S型紫外可見分光光度計，上海儀電科學儀器股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛蒡根的預處理

將新鮮的牛蒡根清洗干凈、切片，并用0.75%維C溶液浸泡30 min，瀝干水分后于40℃條件下鼓風干燥至恒質(zhì)量，粉粹過60篩，得牛蒡根干粉，低溫冷凍儲存以備用。

1.2.2 黃酮含量的測定

黃酮含量的測定采用 NaNO2-Al（NO3）3法[8]。以蘆丁為標準品，制作標準曲線，得到吸光度與黃酮質(zhì)量濃度的方程：

Y=0.012 1X+0.029 8，R2=0.999 0.將0.5 mL牛蒡根總黃酮提取液加入到25 mL比色管中，再加5%的NaNO2溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min后加入10%Al（NO3）3溶液0.4 mL，搖勻后靜置6 min，最后加入4%NaOH溶液4.0 mL，用純水定容至25 mL刻度，在室溫下靜置15 min后，于波長509 nm處測定處吸光度，并將其代入標準曲線，求得比色管中牛蒡根總黃酮的質(zhì)量濃度，計算牛蒡根總黃酮的提取率。

式中：C——牛蒡根總黃酮的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V1——25 mL（比色管量程）；

V2——0.5 mL（反應(yīng)體系中牛蒡根總黃酮提取液的體積）；

V——牛蒡根總黃酮提取液的總體積，mL；

m——牛蒡粉質(zhì)量，g。

1.2.3 總黃酮提取單因素試驗

（1）料液比對牛蒡根中總黃酮提取率的影響。選取料液比 1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g∶mL），在超聲功率100 W，乙醇體積分數(shù)60%，提取時間30 min，提取溫度40℃條件下，研究料液比對牛蒡根總黃酮提取率的影響。

（2）乙醇體積分數(shù)對牛蒡根總黃酮提取率的影響。分別選用體積分數(shù)為20%，40%，60%，80%，100%的乙醇溶液作為溶劑，在超聲功率100 W，提取時間30 min、料液比1∶20（g∶mL），提取溫度40℃條件下，研究乙醇體積分數(shù)對牛蒡根總黃酮提取率的影響。

（3）提取時間對牛蒡根總黃酮提取率的影響。選擇提取時間分別為20，30，40，50，60，70 min，在超聲功率100 W，提取溫度40℃，乙醇體積分數(shù)60%，料液比1∶20（g∶mL）條件下，研究提取時間對牛蒡根總黃酮提取率的影響。

（4）提取溫度對牛蒡根總黃酮得率的影響。選取提取溫度30，40，50，60，70，80℃，在超聲功率100 W、乙醇體積分數(shù)60%，料液比1∶20（g∶mL），提取時間30 min條件下，研究不同提取溫度對牛蒡根總黃酮提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以料液比、乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度為考查因素，牛蒡根總黃酮的提取率為響應(yīng)值進行Box-Behnken的中心組合設(shè)計（四因素三水平）。通過Design Expert 10.0.3軟件進行數(shù)據(jù)分析和試驗設(shè)計，優(yōu)化牛蒡根總黃酮在超聲波輔助下的提取條件。

Box-Behnken的中心組合因素水平見表1。

表1 Box-Behnken的中心組合因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 料液比對牛蒡根總黃酮提取率的影響

料液比對牛蒡根總黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對牛蒡根總黃酮提取率的影響

由圖1可知，料液比為1∶10～1∶20（g∶mL）時，黃酮提取率隨料液比的增加而增加；料液比為1∶20時，總黃酮提取率達到最大；料液比超過1∶20時，提取率反而下降。這是由于隨著溶劑與原料的比值增大濃度差也就增大，這雖然促進了傳質(zhì)的過程，但是當比例過大時，影響了超聲波產(chǎn)生的效應(yīng)，使得黃酮提取率不增加反而下降[9]。因而，最適料液比選擇為1∶20（g∶mL）。

2.1.2 乙醇體積分數(shù)對牛蒡根總黃酮提取率的影響

乙醇體積分數(shù)對牛蒡根總黃酮提取率的影響見圖2。

由圖2可知，牛蒡根總黃酮提取率隨乙醇體積分數(shù)的增加先增加后急速降低，當乙醇體積分數(shù)為80%時，其提取率最高，此結(jié)果與蔡茜彤等人的研究結(jié)果一致；現(xiàn)有研究表明[10]，植物中的黃酮類化合物主要以苷元和苷類的形式存在，高體積分數(shù)的乙醇更適于黃酮苷元的提取，而低體積分數(shù)的乙醇（60%以下）適于黃酮苷的提取。這也說明牛蒡根中黃酮苷元比黃酮苷類含量更高，因此最佳的乙醇體積分數(shù)選為80%。

2.1.3 提取時間對牛蒡根總黃酮提取率的影響

提取時間對牛蒡根總黃酮提取率的影響見圖3。

圖2 乙醇體積分數(shù)對牛蒡根總黃酮提取率的影響

圖3 提取時間對牛蒡根總黃酮提取率的影響

由圖3可知，在60 min以內(nèi)，牛蒡根總黃酮提取率隨著提取時間的延長而增大；而60 min以后，其隨時間的增加而減少，由此確定最佳提取時間為60 min。由于細胞的破裂和黃酮類物質(zhì)的溶出都需要時間，黃酮類物質(zhì)隨著提取時間的增加提取也越充分，但是時間過長，超聲波巨大的機械能會破壞黃酮類物質(zhì)，而使黃酮類物質(zhì)提取率下降[11]。

2.1.4 提取溫度對牛蒡根總黃酮提取率的影響

提取溫度對牛蒡根總黃酮得率的影響見圖4。

圖4 提取溫度對牛蒡根總黃酮得率的影響

由圖4可知，提取溫度在30～60℃時，黃酮提取率迅速增加；但當提取溫度大于60℃時，黃酮提取率隨溫度的增加反而降低，呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。這主要是因為升高的提取溫度，增大了擴散系數(shù)，降低了提取液黏度，加快了分子熱運動的速度，從而促進了物質(zhì)的溶出。但溫度過高，會破壞牛蒡根總黃酮的組織結(jié)構(gòu)，使其被氧化分解，同時，溶劑會隨溫度的升高而損失，雜質(zhì)溶出也會大量增加，而使總黃酮的提取率降低[12]。由此，牛蒡根總黃酮最適提取溫度為60℃。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面結(jié)果

根據(jù)Box-Beknhen中心組合試驗設(shè)計，以料液比、乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間為考查因素，在單因素基礎(chǔ)上進行了四因素三水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計。

響應(yīng)面試驗設(shè)計見表2。

利用Design Expert 10.0.3軟件對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行了多元回歸擬合，并對影響牛蒡根總黃酮提取的因素進行條件優(yōu)化，得到牛蒡根總黃酮提取的回歸方程：

2.2.2 響應(yīng)面分析

對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行方差分析。

方差分析見表3。

表3 方差分析

圖5 料液比和乙醇體積分數(shù)交互影響

圖6 料液比和提取溫度的交互影響

圖7 提取時間和料液比的交互影響

圖8 乙醇體積分數(shù)和提取時間的交互影響

圖9 提取時間和提取溫度的交互影響

圖10 乙醇體積分數(shù)和提取溫度的交互影響

由表3可知，該回歸模型的p＜0.001，為極顯著水平，相關(guān)系數(shù)R2=0.928 5，說明自變量和響應(yīng)值之間、預測值與試驗值之間有顯著的關(guān)系，試驗模型與實際試驗能較好的擬合。而且失擬項p=0.534 8>0.05，差異不顯著，試驗誤差小，這說明該模型能較好的擬合牛蒡根總黃酮提取率的實際值與預測值。變異系數(shù)（CV%）為2.34%，較小，說明試驗結(jié)果重復性較好。從檢驗值F可以看出，影響牛蒡根中總黃酮提取率的因素的主次順序為料液比（A）>乙醇體積分數(shù)（B）>提取溫度（C）>提取時間（D），其中乙醇體積分數(shù)、乙醇體積分數(shù)的二次項、料液比、料液比的二次項、提取溫度的二次項都是極顯著水平，而其他的則不顯著。

料液比和乙醇體積分數(shù)的交互影響見圖5，料液比和提取溫度的交互影響見圖6，提取時間和料液比的交互影響見圖7，乙醇體積分數(shù)和提取時間的交互影響見圖8，提取溫度和提取時間的交互影響見圖9，乙醇體積分數(shù)和提取溫度的交互影響見圖10。

由圖5～圖10可知，響應(yīng)面圖呈現(xiàn)凸狀，開口朝下，并且有最高點，且從最高點向四周邊緣逐漸下降，這表明各因素作用增大時，響應(yīng)面值也增大，達到最高點后，各因素作用增大，響應(yīng)面值反而減小[13]。

2.2.3 驗證試驗

經(jīng)過Design Expert 10.0.3軟件進行分析，牛蒡根總黃酮在超聲波功率為100 W輔助提取下的最優(yōu)提取條件為料液1∶23.48（g∶mL），提取溫度60.05℃，乙醇體積分數(shù)61.05%，提取時間59.03 min，從該條件得出的牛蒡根總黃酮提取率為28.19 mg/g。為了方便實際操作，將各因素稍作調(diào)整，分別取整數(shù)為料液比1∶23（g∶mL），提取溫度60℃，乙醇體積分數(shù)61%，提取時間59 min，該條件下測得的牛蒡根總黃酮提取率為27.96 mg/g，和理論值比較，相對誤差為0.82%，試驗值與理論值能夠吻合較好。說明該模型對牛蒡根總黃酮提取條件擬合較好，得到的優(yōu)化條件可行。

3 結(jié)論

以牛蒡根為原料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，得出超聲功率為100 W時的牛蒡根中總黃酮的最佳提取條件為料液比1∶23（g∶mL），乙醇體積分數(shù)61%，提取溫度 60℃，提取時間59 min，在此條件下，得到牛蒡根總黃酮提取率為27.96 mg/g。研究結(jié)果表明，牛蒡根中總黃酮含量豐富，是黃酮提取的良好原材料，具有較好的開發(fā)潛能，為進一步研究牛蒡黃酮提供了理論基礎(chǔ)。