花生中油酸與亞油酸含量測(cè)定方法研究

趙 星 ，張嘉楠 ，楊 華 ，王 瑾 ，宋亞輝 ，陳四龍 ，李玉榮

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所 河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050035；2.石家莊學(xué)院 化工學(xué)院，河北 石家莊 050035；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所 國家谷子改良中心，河北 石家莊 050035）

0 引言

花生又名落花生、長(zhǎng)生果，是全球最重要的四大油料作物之一，在世界油脂生產(chǎn)中具有舉足輕重的地位.中國是世界最大的花生生產(chǎn)國，除西藏、青海外，其他省份均有種植，并以山東、河南、河北、廣東、安徽等地的產(chǎn)量和種植面積最大.花生富含維生素、礦物質(zhì)和多種生物活性物質(zhì)，并含有多種對(duì)心臟有益的物質(zhì)，例如不飽和脂肪酸、鉀、鎂、煙酸、甾醇、白藜蘆醇、類黃酮等[1-3].長(zhǎng)期以來，我國60%的花生用于榨油[4]，花生油氣味醇香，深受人們喜愛，被譽(yù)為“中國的橄欖油”.脂肪酸的組成是決定花生油質(zhì)量的重要因素，花生中的脂肪酸包括飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸的含量達(dá)85%以上，且以對(duì)心血管疾病有益的油酸與亞油酸為主[2，3，5].油酸具有降低高血脂癥患者血脂水平以及預(yù)防心血管疾病的作用，而油酸/亞油酸（O/L）影響著油脂的氧化穩(wěn)定性，即貨架期，是決定花生油品質(zhì)的重要因素[6].因此，對(duì)花生中的油酸與亞油酸進(jìn)行定量分析，是進(jìn)行花生原料品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要步驟.

本研究以花生仁為原料，采用超聲波輔助提取法獲得的正己烷提取液為樣品溶液，以十七烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)，確定最佳氣相條件，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，為花生中油酸與亞油酸的含量測(cè)定建立專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便的氣相分析方法.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

安捷倫6890N型氣相色譜儀（配有FID檢測(cè)器與氣相色譜工作站，美國安捷倫公司）；SB-5200D型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；AL204型電子天平購自梅特勒-托利多儀器有限公司；HHS-21.6型水浴鍋購自山西省文水醫(yī)療器械廠；PICO21型離心機(jī)購自賽默飛世爾科技公司；Research型移液器購自德國Eppendorf公司.

正己烷（色譜純，德國默克公司）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；十七烷酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯對(duì)照品均購自美國Sigma-Alorich公司；氫氧化鉀為國產(chǎn)分析純；去離子水由美國Milli-Q Academic純水器制備.花生仁樣品由河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所花生組自采，采制日期為2013年10月.

1.2 溶液的制備

1.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

取十七烷酸甲酯適量，精密稱定，置50 mL的量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后得濃度為0.298 6 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，置4℃冰箱中保存，備用.

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

取油酸甲酯與亞油酸甲酯適量，精密稱定，分別置5 mL的量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別為58.60 mg/mL和54.85 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置4℃冰箱中保存，備用.

1.2.3 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密量取油酸甲酯與亞油酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，置同一5 mL量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別為10.15 mg/mL和7.032 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以甲醇逐級(jí)稀釋制成油酸甲酯（亞油酸甲酯）濃度分別為 10.15（7.032），5.074（3.516），2.029（1.406），1.015（0.703 2），0.5074（0.351 6），0.2029（0.140 6），0.101 5（0.070 32）mg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用現(xiàn)配.

1.2.4 甲酯化試劑的制備

取氫氧化鉀適量，加入少量水溶解，以甲醇稀釋，配制成濃度為0.4 mol/L的KOH-甲醇溶液，室溫放置24 h，即得.

1.3 油酸與亞油酸樣品提取液的制備

取粉碎并烘干至恒重的花生仁樣品0.1 g，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加入正己烷1 mL，浸泡30 min后，于45℃下超聲（功率250 W）提取20 min，冷卻至室溫，以正己烷稀釋至刻度，搖勻，離心15 min（室溫，14 000 r/min）后，上清液以正己烷稀釋5倍，即得.

1.4 油酸甲酯與亞油酸甲酯供試溶液的制備

精密量取上述樣品提取液250 μL、甲醇100 μL、內(nèi)標(biāo)溶液100 μL于2 mL離心管中，加入甲酯化試劑0.5 mL，混勻，于60℃水浴反應(yīng)20 min，期間振蕩混勻3次.反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入0.6 mL去離子水，搖勻，離心15 min（室溫，14 000 r/min），分離正己烷層于200 μL離心管中，進(jìn)行氣相色譜分析.

1.5 氣相色譜分析

色譜柱：Agilent DB-23 毛細(xì)管柱（0.25 μm×320 μm×30 m）；載氣：氮?dú)?；升溫程序：初始溫?140℃，以8℃/min升至220℃，保持3 min，然后以10℃/min上升到220℃，保持5 min；進(jìn)樣口及檢測(cè)器溫度：250℃；柱流量：0.7 mL/min；分流比：1∶20；進(jìn)樣量：2 μL.

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用安捷倫6890N工作站計(jì)算內(nèi)標(biāo)、油酸甲酯、亞油酸甲酯色譜峰的保留時(shí)間（tR）、峰面積（A）、對(duì)稱因子（T）、分離度（R）與理論塔板數(shù)（N），并將內(nèi)標(biāo)、油酸甲酯、亞油酸甲酯色譜峰面積分別代入公式（1）、（2），計(jì)算花生樣品中油酸與亞油酸的含量.

式中（A油/A內(nèi)）樣，（A亞油/A內(nèi)）樣分別代表供試溶液中油酸甲酯、亞油酸甲酯與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積的比值；（A油/A內(nèi)）對(duì)，（A亞油/A內(nèi)）對(duì)分別代表對(duì)照品中油酸甲酯、亞油酸甲酯與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積的比值；c油，c亞油分別代表對(duì)照品溶液中油酸甲酯、亞油酸甲酯的濃度（單位：mg/mL）；V樣為樣品提取時(shí)所用量瓶的體積（單位：mL）；F油，F(xiàn)亞油分別代表油酸、亞油酸的校正系數(shù)，F(xiàn)油=1.905 4，F(xiàn)亞油=1.904 8；W樣為樣品提取時(shí)的稱樣量（單位：g）.

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性

精密吸取內(nèi)標(biāo)溶液、對(duì)照溶液和無內(nèi)標(biāo)的供試溶液各2 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖1），內(nèi)標(biāo)物、油酸甲酯、亞油酸甲酯的保留時(shí)間分別為8.29，9.38，9.84 min，對(duì)稱因子、各峰與相鄰峰的分離度均符合氣相色譜的定量要求[7]，理論板數(shù)按油酸甲酯峰計(jì)算不低于5 000，且內(nèi)標(biāo)物與樣品中的各成分無交叉干擾.

精密吸取供試溶液2 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，分別計(jì)算油酸甲酯、亞油酸甲酯與內(nèi)標(biāo)物峰的相對(duì)峰面積（A油/A內(nèi)）、（A亞油/A內(nèi)）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.43%和0.51%，色譜系統(tǒng)重復(fù)性符合定量要求[7].

2.2 線性與范圍

精密量取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL，分別置于2 mL離心管中，以250 μL正己烷代替樣品提取液，加入內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，按1.4節(jié)的方法處理，照1.5節(jié)的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖.每個(gè)濃度3樣本分析，分別以油酸甲酯與亞油酸甲酯質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X），平均相對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)（Y），采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，權(quán)重系數(shù)以1/X2計(jì)算，所得的回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線.

按照上述方法計(jì)算，油酸甲酯、亞油酸甲酯的回歸方程與相關(guān)系數(shù)（r）分別為：油酸甲酯：Y=4.210X-0.027，r=0.999 3（n=7）；亞油酸甲酯：Y=3.906X-0.042，r=0.999 3（n=7）.

結(jié)果表明，油酸甲酯、亞油酸甲酯分別在質(zhì)量濃度0.101 5～10.15 mg/mL和0.070 32～7.032 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，在樣品定量分析過程中，可采用“一點(diǎn)法”進(jìn)行濃度計(jì)算，經(jīng)推導(dǎo)得公式（1）和（2）.油酸甲酯、亞油酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的推薦濃度分別為1 mg/mL與0.7 mg/mL.

圖1 內(nèi)標(biāo)溶液、對(duì)照溶液和無內(nèi)標(biāo)物的供試溶液色譜圖

2.3 重復(fù)性

2.3.1 衍生化反應(yīng)重復(fù)性

取來源相同的樣品提取液，按照1.4節(jié)的方法處理進(jìn)行衍生化處理，平行6樣本，進(jìn)行氣相色譜分析，記錄峰面積，分別計(jì)算油酸甲酯與亞油酸甲酯相對(duì)峰面積的RSD，考察油酸與亞油酸衍生化反應(yīng)的重復(fù)性.結(jié)果表明，油酸甲酯與亞油酸甲酯相對(duì)峰面積的RSD分別為4.33%和4.04%，衍生化反應(yīng)重復(fù)性良好，可滿足油酸與亞油酸的定量測(cè)定要求.

2.3.2 方法重復(fù)性

取來源相同的花生樣品，按1.3節(jié)和1.4節(jié)的方法處理，平行6樣本，進(jìn)行氣相色譜分析，記錄峰面積，分別代入公式（1）、（2）計(jì)算油酸、亞油酸的含量及其RSD，考察方法的重復(fù)性.結(jié)果表明，花生樣品中油酸與亞油酸6次測(cè)定結(jié)果的平均值分別為179.5 mg/g和150.6 mg/g，RSD分別為2.43%和2.11%，方法重復(fù)性良好.

2.4 回收率

取與2.3.2節(jié)來源相同的花生樣品0.05 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，精密加入含油酸（亞油酸）17.98（15.06）mg/mL的溶液0.5 mL，按照1.3和1.4節(jié)的方法處理，平行6樣本，進(jìn)行氣相色譜分析，記錄峰面積，并按照公式（3）計(jì)算回收率：

結(jié)果表明，油酸、亞油酸的平均回收率分別為95.59%和97.42%，RSD分別為1.97%和2.11%，方法準(zhǔn)確度高，能夠滿足花生中油酸、亞油酸定量分析的要求.

2.5 穩(wěn)定性

2.5.1 油酸與亞油酸樣品提取液的穩(wěn)定性

取來源相同的花生樣品3份，照1.3節(jié)的方法制備樣品提取液，分別在室溫下放置0，1，2，3，5 h后，按照1.4節(jié)方法處理，進(jìn)行氣相色譜分析，記錄峰面積，分別計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)相對(duì)峰面積與0 h相對(duì)峰面積的相對(duì)誤差（RE），考察油酸與亞油酸樣品提取液的穩(wěn)定性.結(jié)果表明，室溫下放置2 h以內(nèi)，油酸、亞油酸的RE分別為-2.24～4.59%和-2.98～4.74%，放置3 h之后，個(gè)別樣品中油酸、亞油酸的RE＞5.0%.由此可見，油酸與亞油酸樣品提取液的穩(wěn)定性較差，應(yīng)臨用現(xiàn)配，制備完成后應(yīng)盡快進(jìn)行衍生化，不宜長(zhǎng)時(shí)間放置.

2.5.2 油酸與亞油酸甲酯供試溶液的穩(wěn)定性

取新制備的3份衍生化溶液，分別在室溫放置0，1，3，7，24，48 h后進(jìn)樣，記錄峰面積，分別計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)與0 h相對(duì)峰面積的RE，考察油酸甲酯與亞油酸甲酯供試溶液的穩(wěn)定性.結(jié)果表明，室溫下放置48 h，油酸甲酯、亞油酸甲酯的RE分別為-1.24～3.80%和-0.76～2.34%.由此可見，供試溶液于制備后48 h內(nèi)穩(wěn)定，在氣相分析過程中，因放置時(shí)間與進(jìn)樣順序不同而引入的誤差可忽略不計(jì).

2.6 討論

2.6.1 衍生化方法的選擇

本研究比較了三氟化硼法[8]與氫氧化鉀-甲醇法對(duì)油酸與亞油酸甲酯化的衍生效果，發(fā)現(xiàn)三氟化硼的加入會(huì)使花生中油酸、亞油酸樣品提取液在甲酯化過程中產(chǎn)生白色沉淀，且氣相色譜圖中油酸甲酯與亞油酸甲酯色譜峰響應(yīng)降低，出現(xiàn)比采用氫氧化鉀-甲醇法進(jìn)行甲酯化更多的“本底峰”.因此，本研究采用操作簡(jiǎn)便、“本底峰”較少、毒性相對(duì)較低的氫氧化鉀-甲醇法進(jìn)行衍生化.考察了反應(yīng)溫度與時(shí)間對(duì)油酸與亞油酸甲酯化效率的影響，為了縮短反應(yīng)時(shí)間，排除環(huán)境溫度變化的影響，并且兼顧油酸與亞油酸樣品提取液的穩(wěn)定性，最終確定于60℃下反應(yīng)20 min.

2.6.2 校正因子的應(yīng)用

本研究以油酸甲酯與亞油酸甲酯為對(duì)照品，通過加校正因子對(duì)花生中的油酸、亞油酸的含量進(jìn)行計(jì)算.因?yàn)樵诨厥章实目疾熘校退?、亞油酸?duì)照品在實(shí)驗(yàn)過程中未表現(xiàn)出與花生樣品所含油酸、亞油酸相同的甲酯化效率，且花生樣品提取液甲酯化得到的油酸甲酯、亞油酸甲酯色譜峰在保留時(shí)間、對(duì)稱因子、理論板數(shù)等方面，均與油酸甲酯、亞油酸甲酯對(duì)照品無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.推測(cè)產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因，可能是由于本研究測(cè)定總油酸與總亞油酸，而花生中的油酸、亞油酸存在多種順、反異構(gòu)體[9]，不同異構(gòu)體在甲酯化效率上可能存在著差異.

2.6.3 定量方法的選擇

在精密度驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)，直接以油酸與亞油酸甲酯峰面積計(jì)算含量時(shí)，RSD分別為6.47%和5.90%，不符合定量分析的要求，故本研究采用內(nèi)標(biāo)法，可有效控制甲酯衍生化過程和氣相色譜分析進(jìn)樣誤差，獲得了滿足定量分析要求的準(zhǔn)確度和精密度.在穩(wěn)定性試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)由于正己烷的揮發(fā)性強(qiáng)，供試溶液放置48 h后可能出現(xiàn)溶液被濃縮或揮干現(xiàn)象，以正己烷稀釋或復(fù)溶處理后，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算，不影響油酸甲酯與亞油酸甲酯的定量結(jié)果.雖有文獻(xiàn)[10]報(bào)道，花生中含有十七烷酸，然而在所選樣品濃度范圍內(nèi)，花生中十七烷酸甲酯化后產(chǎn)生的色譜信號(hào)低于儀器的檢測(cè)限（信噪比S/N＜3），在所選條件下，不產(chǎn)生色譜峰，對(duì)油酸、亞油酸定量分析的干擾可忽略不計(jì).

3 結(jié)論

本研究以正己烷為提取溶劑，采用超聲波輔助提取法制備樣品提取液，氫氧化鉀-甲醇法進(jìn)行甲酯衍生化制備供試溶液，并以十七烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)，建立了花生中油酸與亞油酸含量測(cè)定的氣相色譜方法.經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本研究所建立的定量分析方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，且操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、毒性小、檢測(cè)費(fèi)用低，適用于花生中油酸與亞油酸的常規(guī)定量分析，為花生原料品質(zhì)的評(píng)價(jià)與質(zhì)量的控制研究奠定了基礎(chǔ).