煙堿暴露對(duì)成癮相關(guān)煙堿型乙酰膽堿受體的影響及調(diào)控機(jī)理

耿怡佳,陳 歡,朱欣潮,侯宏衛(wèi),胡清源

(國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,中國(guó)河南鄭州450001)

煙草的煙氣成分復(fù)雜,包含5 000多種化學(xué)成分[1],其中煙堿被認(rèn)為是最重要的藥理學(xué)成分。吸煙時(shí)煙堿隨煙氣進(jìn)入肺部,而后經(jīng)肺泡中的毛細(xì)血管吸收進(jìn)入血液循環(huán)。攝入體內(nèi)的煙堿能迅速通過(guò)血腦屏障,與中樞神經(jīng)元表面的煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)結(jié)合,作用于中腦邊緣多巴胺系統(tǒng),進(jìn)而產(chǎn)生獎(jiǎng)賞效應(yīng)[2]。已有研究表明,與非吸煙者相比,吸煙者腦部α4β2型nAChRs的表達(dá)量顯著升高[3],重度吸煙者α7型nAChRs顯著上調(diào)[4]。因此研究者推測(cè),煙堿暴露對(duì)大腦中nAChRs的影響可能與煙堿成癮密切相關(guān)。本文簡(jiǎn)要介紹了nAChRs的分類、結(jié)構(gòu)以及測(cè)定方法,綜述了煙堿暴露對(duì)nAChRs的影響,闡述了煙堿作用下nAChRs的變化趨勢(shì)與煙堿成癮的關(guān)系,并從細(xì)胞內(nèi)nAChRs的組裝、運(yùn)輸、成熟和降解以及組成與構(gòu)象變化等各方面綜述了煙堿調(diào)控nAChRs變化的相關(guān)機(jī)制。

1 nAChRs的種類和分布

nAChRs是半胱氨酸環(huán)配體門控離子通道(the cysteine-loop ligand-gated ion channel,cys-loop LGIC)超家族中的一員,該家族還包含5-羥色胺受體、γ-氨基丁酸A型受體和甘氨酸受體等,是介導(dǎo)脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物突觸傳遞的神經(jīng)遞質(zhì)受體[5]。nAChRs是由5個(gè)相同或不同的亞基圍繞中心離子通道構(gòu)成的五聚體,其結(jié)構(gòu)如圖1[6]所示。目前已確認(rèn) 17 種 nAChR 亞基(α1～α10、β1～β4、γ、δ、ε)[5],這些亞基通過(guò)不同的組合形成功能各異的nAChR亞型。

哺乳動(dòng)物中的nAChRs分為肌肉型受體和神經(jīng)型受體:肌肉型受體包含4種亞基,在成年哺乳動(dòng)物和胚胎中分別為 α1、β1、δ、ε 和 α1、β1、δ、γ,而神經(jīng)型受體僅由 α2～α10 和 β2～β4 亞基組成[5]?；趯?duì)α-銀環(huán)蛇毒素的敏感程度,可將神經(jīng)型nAChRs分為兩類,一類是對(duì)α-銀環(huán)蛇毒素敏感的受體亞型,包括α7～α10亞基,這4種亞基性質(zhì)相似,既能單獨(dú)組成僅包含一種亞基的均質(zhì)五聚體,也能與其他亞基組合形成包含多種亞基的異質(zhì)五聚體;另一類為對(duì)α-銀環(huán)蛇毒素不敏感的受體亞型,由 α2～α6 和 β2～β4 亞基通過(guò)不同的組合形成異質(zhì)五聚體[7]。

神經(jīng)型nAChRs廣泛分布在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)和大腦其他部位,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,可調(diào)節(jié)γ-氨基丁酸、谷氨酸、多巴胺、5-羥色胺、去甲腎上腺素和乙酰膽堿等多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[8]。α4β2*nAChRs(符號(hào)“*”表示可能存在其他亞基)是腦中最豐富的異質(zhì)受體,主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),并對(duì)煙堿具有高親和力[9]。α7*nAChRs也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)的受體亞型,主要存在于皮質(zhì)、海馬、杏仁核、小腦、下丘腦、嗅區(qū)、脊髓中,對(duì)煙堿的親和力較低[5]。α3*nAChRs也存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,但不如 α7*nAChRs 或 α4β2*nAChRs 普遍[6]。nAChRs在認(rèn)知功能、精神疾病以及藥物成癮中的作用一直是研究的熱點(diǎn),目前已有許多報(bào)道對(duì)nAChRs的分類、結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了全面的論述[10～12]。

2 受體表達(dá)的測(cè)定方法

圖1 nAChR的帶狀結(jié)構(gòu)示意圖[6](A)俯視圖;(B)側(cè)視圖。兩條水平灰線表示膜平面。Fig.1 Ribbon diagrams of the nAChR structure[6](A)Top view;(B)Side view.Two horizontal gray lines indicate the membrane plane.

nAChRs分布在腦部各個(gè)區(qū)域,且不同區(qū)域數(shù)量不同,使用放射性配體對(duì)nAChRs進(jìn)行顯像能夠檢測(cè)nAChRs在不同腦區(qū)的分布和表達(dá)差異。大多數(shù)腦成像研究聚焦于腦內(nèi)表達(dá)水平最高的 α4β2*nAChRs和 α7*nAChRs,目前已開(kāi)發(fā)出多種放射性配體來(lái)實(shí)現(xiàn)成像,其中一些已成功應(yīng)用于臨床研究。表1總結(jié)了一些主要的nAChRs放射性配體的種類和特點(diǎn)。其中,最早使用的放射性同位素是[3H]-煙堿、[11C]-煙堿以及[3H]-乙酰膽堿[13],主要結(jié)合α4β2*nAChRs,但具有高度非特異性結(jié)合與代謝快的特點(diǎn),成像性能較差[14]。之后出現(xiàn)了[3H]-野靛堿[15]以及可被[3H]或[125I]標(biāo)記的地 棘 蛙 素[16～17]。[3H]-野 靛堿主 要 結(jié) 合 α4β2*nAChRs,但同時(shí)對(duì)α3*nAChRs也具有高親和力,而地棘蛙素可針對(duì)多種受體亞型,只能用來(lái)反映nAChRs整體的變化,且其毒副作用也限制了進(jìn)一步的應(yīng)用研究。α4β2受體激動(dòng)劑2-[18F]-FA-85380(2-[18F]fluoro-3-[2(S)-2-azetidinylmethoxy]pyridine)是目前最成熟的研究人腦α4β2*nAChRs的放射性配體,對(duì)nAChRs的選擇性和特異性高,對(duì)人體無(wú)損害,但其在人腦中表現(xiàn)出緩慢的分布動(dòng)力學(xué),具有較長(zhǎng)的掃描時(shí)間,因此需要開(kāi)發(fā)性能更好的nAChRs放射性示蹤劑[18～19]。近年來(lái),人們開(kāi)發(fā)了包括[18F]nifene(2-[18F]-fluoro-3-[2-((S)-3-pyrrolinyl)methoxy]pyridine)和(-)-[18F]Flubatine((-)-[18F]norchloro-fluoro-homoepibatidine)在內(nèi)的新型nAChRs放射性配體,這些新型配體具有優(yōu)于2-[18F]-FA-85380的檢測(cè)性能[20～21],可大大縮短掃描時(shí)間,對(duì)于臨床研究具有十分重要的作用。[11C]CHIBA-1001(4-[11C]methylphenyl-1,4-diazabicyclo[3,2,2]nonane-4-carboxylate)是可應(yīng)用于人體的α7*nAChRs放射性配體,但它在腦部的特異性結(jié)合較差[22]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的[18F]標(biāo)記的ASEM(4-(6-fluorodibenzo[b,d]thiophen-3-yl)-1,4-diazabicyclo[3,2,2]nonane 5,5-dioxide),即[18F]ASEM,是對(duì)α7*nAChRs具有高特異性和選擇性的放射性配體,在嚙齒動(dòng)物和狒狒的研究中表現(xiàn)出優(yōu)異的體內(nèi)成像性能,并成功應(yīng)用于人腦活體成像的研究,為研究人腦中α7*nAChRs開(kāi)拓了新的視野[23]。此外,Sarasamkan等[24]合成出首個(gè)用于 α3β4*nAChRs分子成像的放射性配體(S)-[18F]T1((S)-[18F]-3-(4-(4-fluorophenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)quinuclidine),而且針對(duì)小鼠和豬大腦的分析表明(S)-[18F]T1在腦區(qū)的結(jié)合與α3β4*nAChRs的表達(dá)有關(guān),這使得(S)-[18F]T1成為對(duì)腦內(nèi)α3β4*nAChRs進(jìn)行成像研究的潛在工具。

目前,正電子發(fā)射斷層掃描(positron emission tomography,PET)是進(jìn)行活體腦部非侵入性研究的最先進(jìn)的方法,在量化放射性的區(qū)域分布和時(shí)間測(cè)量方面表現(xiàn)出較好的分辨率和準(zhǔn)確性,因而優(yōu)于其他所有成像模式[25]。但是,現(xiàn)有的放射性配體各有不足,針對(duì)不同受體的新型配體尚處于研究中,且多限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn),毒性與安全性尚未確定,因而制約了人腦中nAChRs PET成像研究的發(fā)展,今后需要篩選出可以進(jìn)行快速成像分析的更理想的放射性配體用于nAChRs的研究。

此外,使用放射性配體也可通過(guò)體外途徑對(duì)nAChRs的分布和變化進(jìn)行研究。體外研究通常使用放射性標(biāo)記的化合物與nAChRs進(jìn)行結(jié)合,然后利用液體閃爍計(jì)數(shù)、放射自顯影、免疫沉淀等手段檢測(cè)受體的分布,測(cè)定煙堿暴露引起的受體結(jié)合位點(diǎn)的變化,從而評(píng)價(jià)煙堿對(duì)受體的影響。

Marks等[26]采用放射性標(biāo)記的化合物與大腦切片結(jié)合后進(jìn)行放射自顯影,比較了慢性煙堿暴露下 α4β2*nAChRs和 α6β2*nAChRs的表達(dá)變化。Whiteaker等[27]使用[125I]單克隆抗體免疫標(biāo)記α4和β2亞基,通過(guò)放射自顯影來(lái)對(duì)受體的表達(dá)進(jìn)行定位和定量。放射自顯影技術(shù)通過(guò)放射性標(biāo)記的配體或抗體特異性結(jié)合受體來(lái)進(jìn)行定位分析,從組織水平測(cè)定受體的分布和數(shù)量,具有直觀、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),但還存在一定的應(yīng)用局限:nAChRs在許多大腦區(qū)域以低水平表達(dá),當(dāng)配體具有相對(duì)高的非特異性結(jié)合時(shí),其分辨率不足以鑒定一些亞型的結(jié)合位點(diǎn),同樣也難以可靠地鑒定特異性免疫標(biāo)記[28]。

表1 nAChRs放射性配體的種類和特點(diǎn)Table 1 Species and characteristics of nAChRs radioligand

Lai等[29]使用抗β2和α4亞基的單克隆抗體吸附[125I]-地棘蛙素結(jié)合的受體,然后通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定受體結(jié)合位點(diǎn)的變化。Gotti等[30]用亞基特異性抗體免疫沉淀證明在皮質(zhì)和丘腦中超過(guò)70%的[3H]-地棘蛙素結(jié)合位點(diǎn)僅包含α4和β2亞基,隨后進(jìn)一步用蛋白質(zhì)印跡法分析α4、β2基因的野生型和雜合子小鼠兩個(gè)腦區(qū)中α4和β2亞基的含量。免疫沉淀可通過(guò)不同nAChR亞基的特異性抗體免疫吸附放射性標(biāo)記的受體,然后使用液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定受體結(jié)合位點(diǎn)的變化,并結(jié)合蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定受體的表達(dá),雖然所使用的特異性抗體對(duì)受體具有高親和力與特異性,但無(wú)法直觀顯示受體的分布。

Moretti等[31]使用抗α7和β2亞基的抗體從樣品中純化nAChRs,然后通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法對(duì)特定腦區(qū)中兩種亞基的水平進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)印跡法通過(guò)凝膠電泳分離蛋白質(zhì),使用特異性抗體或抗原與靶蛋白結(jié)合進(jìn)行染色觀察或直接鑒定,無(wú)需進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記,具有高分辨率和高特異性,可用于定量測(cè)定nAChR亞基含量水平,但同樣無(wú)法實(shí)現(xiàn)定位分析。

另外,熒光標(biāo)記的nAChR亞基已應(yīng)用于檢測(cè)轉(zhuǎn)染nAChR亞基的細(xì)胞中煙堿誘導(dǎo)的上調(diào),以及構(gòu)建基因敲除和敲入小鼠模型[32～33]。Nashmi等[34]將胞漿結(jié)構(gòu)域中已分別融合了黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)和青色熒光蛋白(cyan fluorescent protein,CFP)的α4和β2亞基轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的人胚腎細(xì)胞和中腦腹側(cè)的神經(jīng)元中,當(dāng)暴露于煙堿時(shí)兩種細(xì)胞均顯示出α4-YFP亞基熒光的增加,與煙堿誘導(dǎo)的α4亞基數(shù)量的增加一致,而且α4-YFP亞基熒光的增加與α4β2受體的功能性上調(diào)相關(guān),這證明檢測(cè)α4-YFP亞基熒光信號(hào)可以表征α4β2受體的功能性上調(diào)。

3 煙堿暴露下nAChRs的變化及其在煙堿成癮中的作用

煙堿和乙酰膽堿結(jié)構(gòu)相似,是nAChRs的激動(dòng)劑,可結(jié)合并激活nAChRs。但煙堿不會(huì)被乙酰膽堿酯酶水解,因此煙堿在nAChRs附近的保持時(shí)間長(zhǎng)于乙酰膽堿[35]。基于吸煙者和慢性煙堿暴露下動(dòng)物大腦的研究表明,慢性煙堿暴露會(huì)引起[3H]-地棘蛙素標(biāo)記的nAChRs數(shù)量增加[19]。這主要是由于煙堿暴露使得對(duì)煙堿具有高親和力的α4β2*nAChRs發(fā)生上調(diào)。此外,α6、α7 和 α3 等nAChR亞型表現(xiàn)出對(duì)煙堿不同程度的靈敏度,煙堿暴露也會(huì)影響這些受體的表達(dá)。表2列出了煙堿暴露對(duì)不同nAChR亞型的影響以及亞基基因敲除小鼠模型中煙堿引起的行為學(xué)、生理學(xué)作用的變化。

3.1 α4β2*nAChRs

當(dāng)煙堿到達(dá)中腦邊緣多巴胺區(qū)域時(shí)可激活nAChRs,特別是具有高親和力的α4β2*nAChRs。研究發(fā)現(xiàn),慢性煙堿暴露(3～6 mg·kg-1·d-1,微泵給藥14 d)的動(dòng)物體內(nèi)以及吸煙者的腦部均顯示出由于α4β2*nAChRs數(shù)量增加而導(dǎo)致的[3H]-地棘蛙素結(jié)合的增加,在小鼠γ-氨基丁酸能神經(jīng)元中煙堿暴露也可引起α4β2*nAChRs的上調(diào)[36]。此外,自給藥模型下的間歇性煙堿暴露也可以使松鼠猴大腦整體水平上以及特定腦區(qū)(杏仁核和殼核)中α4β2*nAChRs發(fā)生上調(diào)[37]。Semenova 等[38]評(píng)價(jià)了煙堿戒斷對(duì)α4β2*nAChRs表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)同樣的煙堿劑量下,間歇暴露后戒斷使得腹側(cè)被蓋區(qū)和前邊緣皮層中α4β2*nAChRs上調(diào),而連續(xù)暴露后戒斷使得伏隔核中α4β2*nAChRs上調(diào)。α4β2*nAChRs可以兩種化學(xué)計(jì)量方式存在,即在五聚體中所含 α4 亞基數(shù)量不同的[(α4)2(β2)3]和[(α4)3(β2)2],兩種亞型具有不同的藥理學(xué)特性,并在慢性煙堿處理下產(chǎn)生不同的變化[39]。Fasoli等[40]研究了14 d慢性煙堿處理以及戒斷對(duì)C57BL/6小鼠皮質(zhì)和丘腦中α4β2*nAChRs的表達(dá)與β2/α4比例的影響,發(fā)現(xiàn)煙堿暴露使得皮質(zhì)中[3H]-地棘蛙素結(jié)合的受體密度增加,同時(shí)α4和β2蛋白水平以及 β2/α4 亞基比例均增加,表明 α4β2*nAChRs中(α4)2(β2)3的比例增加,并且這些變化僅在煙堿暴露后短暫發(fā)生,戒斷后即回到基準(zhǔn)水平,而在丘腦中未觀察到上述變化。當(dāng)然,也有研究指出,煙堿暴露會(huì)使α4β2α5*nAChRs在海馬區(qū)、紋狀體區(qū)、大腦皮層和丘腦中的上調(diào)受到抑制,這種現(xiàn)象很可能是α5亞基的存在導(dǎo)致的[7]。有研究發(fā)現(xiàn)包含α5亞基的α4β2*nAChRs中,α5亞基可與相鄰的α4亞基形成結(jié)合位點(diǎn),并具有特殊的配體選擇性,因而可能影響煙堿暴露下受體產(chǎn)生的變化[41]。

α4β2*nAChRs在煙堿獎(jiǎng)賞、耐受及其引發(fā)的多巴胺釋放和行為效應(yīng)中發(fā)揮重要作用[42]。Renda等[43]在不同年齡小鼠的煙堿自給藥模型中對(duì)包含α4亞基受體的表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定,發(fā)現(xiàn)VTA神經(jīng)元細(xì)胞中α4*nAChRs的表達(dá)具有年齡差異,并與煙堿攝入量之間存在很強(qiáng)的正相關(guān)性,表明α4*nAChRs的表達(dá)水平在煙堿自給藥中發(fā)揮作用。在針對(duì)大鼠的煙堿自給藥和復(fù)吸行為的研究中,選擇性結(jié)合(α4)3(β2)2的正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑NS-9283(3-[3-(3-pyridyl)-1,2,4-oxadiazol-5-yl]benzonitrile)減弱了大鼠對(duì)煙堿的攝入和渴求[44],而在小鼠的煙堿戒斷模型中使用正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑dFBr(des-formylflustrabromine)特異性結(jié)合 α4β2*nAChRs,也可對(duì)小鼠的戒斷癥狀產(chǎn)生消除作用[45]。Peng等[46]使用自給藥和條件性位置偏愛(ài)(conditioned place preference,CPP)模型研究了α4亞基刪除與煙堿獎(jiǎng)賞相關(guān)行為之間的關(guān)系,結(jié)果表明腹側(cè)中腦中α4亞基的刪除阻斷了煙堿誘導(dǎo)的CPP,并使得小鼠在提供的最高煙堿濃度下攝入更多的煙堿。以上信息表明,α4β2*nAChRs的表達(dá)變化對(duì)煙堿成癮有著關(guān)鍵的作用,α4β2*nAChRs可作為今后開(kāi)展煙堿成癮治療相關(guān)研究的核心靶點(diǎn)。

3.2 α6*nAChRs

在中腦和紋狀體區(qū)域中鑒別出的幾種主要的α6*nAChRs亞型包括 α6β2*nAChRs(不含 α4)和α4α6β2*nAChRs。有研究表明,在發(fā)現(xiàn) α6*nAChRs的所有腦區(qū)域(包括腹側(cè)被蓋區(qū)、黑質(zhì)致密層、上丘和內(nèi)側(cè)韁核)中,α6*nAChRs在慢性煙堿暴露下發(fā)生上調(diào)[47]。但是,基于嚙齒動(dòng)物的相關(guān)研究表明α6β2*nAChRs不隨慢性煙堿暴露上調(diào)[48]。Perez等[49]的研究則進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)煙堿暴露下不含有 α4 亞基的 α6β2*nAChRs上調(diào),而 α4α6β2*nAChRs則不發(fā)生上調(diào)。在煙堿自給藥模型中,大鼠腦內(nèi)α6*nAChRs數(shù)量表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)[50],但慢性煙堿給藥(3～6 mg·kg-1·d-1,通過(guò)微泵給藥14 d)或飲用水(50～300 μg/mL長(zhǎng)達(dá)6周)則可減少中腦多巴胺神經(jīng)元中 α6*nAChRs的數(shù)量[29,51～52]。Walsh等[53]將煙堿誘導(dǎo)的 α6β2*nAChRs上調(diào)情況與α3β2*nAChRs和 α4β2*nAChRs的上調(diào)情況作比較,發(fā)現(xiàn)α6β2*nAChRs上調(diào)的時(shí)間過(guò)程和濃度依賴性與 α3β2*nAChRs相似,但是與 α4β2*nAChRs相比,α6β2*nAChRs的上調(diào)快 10倍,不需要經(jīng)過(guò)2～3 h的延遲,并且需要更高的煙堿濃度,這些差異表明受體的上調(diào)具有亞型特異性,而且可能發(fā)生在煙堿攝入的不同階段。

α6*nAChRs在紋狀體多巴胺釋放、運(yùn)動(dòng)行為和煙堿自給藥中起重要作用[51]。Beckmann等[54]研究發(fā)現(xiàn),α6β2*nAChRs的選擇性拮抗劑r-bPiDI(1,10-bis(3-methyl-5,6-dihydropyridin-1(2H)-yl)decane)可顯著減弱大鼠的煙堿自給藥(75%)。Sanjakdar等[55]采用 α6β2*nAChRs拮抗劑和 α6、α4亞基基因缺失小鼠,研究并比較了α6*nAChRs亞型在CPP模型中對(duì)煙堿獎(jiǎng)賞的作用,結(jié)果顯示伏隔核注射選擇性α6β2*nAChRs拮抗劑可阻斷煙堿CPP,表明煙堿的獎(jiǎng)賞效應(yīng)可能是由中腦邊緣α6β2*nAChRs介導(dǎo)的;同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照小鼠相比,α6缺失小鼠在煙堿劑量-反應(yīng)曲線上表現(xiàn)出向右移動(dòng),而α4缺失小鼠未能建立煙堿CPP,表明煙堿獎(jiǎng)賞涉及α6α4β2*nAChRs。另外有研究表明,內(nèi)側(cè)僵核膽堿能神經(jīng)元中含有α6亞基的nAChRs能夠調(diào)節(jié)煙堿戒斷所引發(fā)的焦慮癥狀[56]。

3.3 α7*nAChRs

Slotkin等[57]對(duì)大鼠進(jìn)行煙堿給藥(2 mg·kg-1·d-1或 6 mg·kg-1·d-1),使用[125I]-α-銀環(huán)蛇毒素檢測(cè)到紋狀體中煙堿誘導(dǎo)的α7*nAChRs的瞬時(shí)上調(diào)。Doura等[58]對(duì)青春期的大鼠進(jìn)行煙堿給藥(2～6 mg·kg-1·d-1),觀察到含 α4β2 和 α7 亞基受體的上調(diào),并且發(fā)現(xiàn)青年和成年大鼠大腦中的α4β2*nAChRs和α7*nAChRs數(shù)量存在明顯差異,相比α4β2*nAChRs,α7*nAChRs的數(shù)量變化程度較小。

針對(duì)煙堿依賴的研究表明,α7*nAChRs與煙堿引起的行為變化以及煙堿戒斷癥狀有關(guān)[59]。通過(guò)阻斷背側(cè)紋狀體α7*nAChRs可顯著降低煙堿暴露引起的細(xì)胞外谷氨酸濃度的增加程度,并減弱大鼠的運(yùn)動(dòng)活力,表明煙堿暴露產(chǎn)生的行為變化與α7*nAChRs介導(dǎo)的大鼠背側(cè)紋狀體中的谷氨酸反應(yīng)活化有關(guān)[60]。

3.4 α3*nAChRs

α3β4*nAChRs通常在與吸煙者腦內(nèi)煙堿水平相當(dāng)?shù)臒焿A濃度(50～200 nmol/L)下不上調(diào),而在煙堿濃度大于等于10 mmol/L的情況下發(fā)生上調(diào)[61]。有意思的是,這種煙堿濃度僅可能在吸煙期間短暫出現(xiàn)在氣道中。體外研究表明,與α3β2*nAChRs相比,α3β4*nAChRs對(duì)煙堿的誘導(dǎo)不太敏感,在能觀察到α3β4*nAChRs上調(diào)的區(qū)域中,僅少數(shù)上調(diào)發(fā)生在細(xì)胞膜(細(xì)胞表面受體增加30%),大部分的上調(diào)存在于細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器中,其中約95%的α3β4*nAChRs上調(diào)發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[61]。此外,有研究表明,α3β4*nAChRs介導(dǎo)煙堿的獎(jiǎng)賞和軀體戒斷癥狀[62]。Yuan 等[63]報(bào)道 α3β4*nAChRs部分激動(dòng)劑AT-1001可減少大鼠的煙堿自給藥,并能減弱戒斷期間大鼠煙堿尋求行為的恢復(fù)。

綜上可知,nAChRs的上調(diào)由于亞基組成、細(xì)胞類型和大腦區(qū)域的不同而存在差異,煙堿的暴露方式和暴露濃度也對(duì)受體的表達(dá)產(chǎn)生復(fù)雜的影響。研究顯示,人吸煙后的煙堿濃度可以激活、脫敏和上調(diào) α4β2*、α6β2*、α3β2*nAChRs,而含有α7和β4的nAChRs對(duì)煙堿似乎不太敏感,需要更高的煙堿濃度來(lái)激活[36,47]。

4 煙堿誘導(dǎo)nAChRs上調(diào)的調(diào)控機(jī)理

目前,圍繞煙堿誘導(dǎo)nAChRs上調(diào)的作用機(jī)制一直存在廣泛的討論。研究表明nAChRs的上調(diào)不依賴于受體表達(dá)所在的細(xì)胞,并且當(dāng)受體在除神經(jīng)元之外的細(xì)胞中表達(dá)時(shí)也會(huì)在煙堿的誘導(dǎo)下發(fā)生上調(diào),因此上調(diào)是受體本身固有的性質(zhì),不受細(xì)胞類型的限制[64]。一般認(rèn)為nAChRs的上調(diào)作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后,因?yàn)闊焿A暴露不改變大鼠和小鼠腦中nAChRs亞基的mRNA表達(dá)水平;此外,當(dāng)使用環(huán)己酰亞胺抑制蛋白質(zhì)合成后,煙堿暴露仍會(huì)導(dǎo)致α4β2*nAChRs上調(diào)約10倍,表明受體上調(diào)發(fā)生在蛋白質(zhì)翻譯后[34,42]。以下總結(jié)了目前可能存在的幾種煙堿誘導(dǎo)nAChRs上調(diào)的機(jī)制。

4.1 促進(jìn)亞基的成熟和裝配

有研究表明煙堿誘導(dǎo)nAChRs上調(diào)的關(guān)鍵步驟是受體的裝配、轉(zhuǎn)運(yùn)及其在細(xì)胞表面的表達(dá)。Sallette等[65]研究發(fā)現(xiàn)煙堿暴露(10～1 000 mmol/L,24 h)通過(guò)增加亞基的裝配對(duì)α4β2*nAChRs在細(xì)胞內(nèi)的成熟過(guò)程起增強(qiáng)作用。Kuryatov等[66]發(fā)現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中煙堿作為分子伴侶促進(jìn)亞基的裝配,從而導(dǎo)致nAChRs裝配速率的增加,同時(shí)也使得細(xì)胞膜表面上nAChRs的壽命增加5倍。這些研究表明煙堿可直接上調(diào)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜上的nAChRs,進(jìn)而揭示了煙堿在細(xì)胞內(nèi)對(duì)nAChRs發(fā)揮誘導(dǎo)作用。但是,也有另外一些研究結(jié)果與裝配機(jī)制存在矛盾,Vallejo等[67]發(fā)現(xiàn)煙堿暴露(10 mmol/L,17～18 h)導(dǎo)致[125I]-地棘蛙素與 α4β2*nAChRs的結(jié)合增加4～6倍,然而表面受體的數(shù)目并未發(fā)生顯著變化,即使裝配效率增加到100%,受體數(shù)量也不會(huì)明顯增加。

4.2 增強(qiáng)nAChRs的轉(zhuǎn)運(yùn)

另一種煙堿誘導(dǎo)nAChRs上調(diào)的可能機(jī)制是受體向細(xì)胞表面胞吐轉(zhuǎn)運(yùn)的增加[68]。Darsow等[68]使用布雷菲德菌素A(brefeldin A,BFA)處理HEK-293T細(xì)胞,從而干擾膜蛋白分泌轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜的過(guò)程,當(dāng)處理后的細(xì)胞暴露于煙堿時(shí),未能檢測(cè)到煙堿誘導(dǎo)的nAChRs的上調(diào),提示nAChRs通過(guò)分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜是煙堿誘導(dǎo)的nAChRs上調(diào)所必需的。Foxloe等[69]發(fā)現(xiàn),煙堿暴露增強(qiáng)了α4β2*nAChRs向細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)運(yùn),同時(shí)也增加了其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的裝配,兩種機(jī)制的共同作用可能產(chǎn)生細(xì)胞表面受體的上調(diào)。但也有研究報(bào)道,使用BFA處理HEK細(xì)胞從而分散高爾基體并阻斷高爾基體的運(yùn)輸后,煙堿誘導(dǎo)的[125I]-地棘蛙素結(jié)合位點(diǎn)的上調(diào)保持不變,表明上調(diào)可能并非來(lái)自于受體向細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)的增加[67]。

4.3 阻斷亞基的降解

泛素化可調(diào)節(jié)配體門控受體(包括nAChRs)的降解、膜運(yùn)輸和轉(zhuǎn)錄,在哺乳動(dòng)物突觸中泛素-蛋白酶體系統(tǒng)影響突觸傳遞和可塑性[70]。煙堿可通過(guò)與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)相互作用影響nAChRs的降解,Rezvani等[71]研究發(fā)現(xiàn),在與吸煙者血液中煙堿平均水平相當(dāng)?shù)臐舛认?煙堿能夠抑制蛋白酶體的活性,減少α7亞基的蛋白酶體依賴性降解,從而導(dǎo)致泛素化α7亞基的積累,并增加總體蛋白質(zhì)水平。另外,在HEK細(xì)胞和重組HeLa細(xì)胞模型中,煙堿暴露也可減少α4β2*nAChRs[72]和 α3β4*nAChRs[61]的降解。

表2 煙堿暴露對(duì)不同nAChR亞型以及亞基敲除小鼠的影響Table 2 Effects of nicotine exposure on nAChRs and subunit knockout mice

4.4 改變亞基的化學(xué)計(jì)量

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中,α4β2亞型可以兩種化學(xué)計(jì)量方式存在,即在五聚體中分別包含兩個(gè)或三個(gè)α4亞基,其中具有兩個(gè)α4亞基的亞型(α4)2(β2)3對(duì)煙堿具有較高的靈敏度[39]。亞基的定量研究顯示,在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)α4β2*nAChRs的HEK293細(xì)胞中,(α4)3(β2)2受體占優(yōu)勢(shì),但長(zhǎng)期暴露于煙堿(0.5～1 000 mmol/L 下暴露 14～72 h)會(huì)促進(jìn)對(duì)乙酰膽堿高度敏感的(α4)2(β2)3受體的表達(dá)[65,67]。卵母細(xì)胞中編碼α4和β2亞基的mRNA的不同比率可產(chǎn)生具有不同化學(xué)計(jì)量的受體,但是在慢性煙堿暴露后僅有(α4)2(β2)3受體明顯上調(diào),提示這種化學(xué)計(jì)量的變化對(duì)于煙堿誘導(dǎo)的α4β2*nAChRs的上調(diào)是關(guān)鍵的[73]。

Fasoli等[40]對(duì)C57BL/6小鼠皮質(zhì)和丘腦的研究也支持了這一結(jié)論,皮質(zhì)中(α4)2(β2)3的表達(dá)低于丘腦,但在慢性煙堿暴露下(α4)2(β2)3比例增加,表明煙堿暴露增加了包含3個(gè)β2亞基的(α4)2(β2)3的裝配。然而,另有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面的α4β2*nAChRs與[125I]-地棘蛙素結(jié)合的上調(diào)與亞基化學(xué)計(jì)量的變化不一致,這是因?yàn)橐坏┎迦氲郊?xì)胞表面,受體亞基化學(xué)計(jì)量的變化就不太可能發(fā)生[67]。

4.5 改變nAChRs的構(gòu)象

nAChRs存在兩個(gè)獨(dú)立的狀態(tài),一種狀態(tài)為靜息狀態(tài),對(duì)煙堿和其他激動(dòng)劑的親和力非常低,不會(huì)與放射性標(biāo)記的激動(dòng)劑進(jìn)行顯著的結(jié)合;另一狀態(tài)為上調(diào)狀態(tài),對(duì)煙堿和其他激動(dòng)劑的親和力高,可與放射性標(biāo)記的激動(dòng)劑進(jìn)行結(jié)合,狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換由煙堿調(diào)節(jié)[74]。煙堿暴露誘導(dǎo)受體從靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯险{(diào)狀態(tài),從而觀察到結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目的增加,但是受體數(shù)目并沒(méi)有增加。Buisson等[75]研究表明α4β2*nAChRs的功能性上調(diào)主要由α4β2*nAChRs進(jìn)入不同的功能狀態(tài)引起,表現(xiàn)為脫敏率的變化、單通道電導(dǎo)的變化和乙酰膽堿濃度依賴性激活的變化。功能狀態(tài)變化與構(gòu)象變化一致。Vallejo等[67]提出,煙堿可能與細(xì)胞表面以及細(xì)胞內(nèi)的nAChRs相互作用,引起構(gòu)象變化,從而改變其功能以及對(duì)激動(dòng)劑的親和力。

5 總結(jié)與展望

神經(jīng)型nAChRs廣泛分布在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)和大腦其他部位,且不同區(qū)域數(shù)量不同,不同nAChR亞型表現(xiàn)出對(duì)煙堿不同程度的靈敏度,因而其受煙堿誘導(dǎo)產(chǎn)生的表達(dá)差異有所不同。PET作為非侵入性研究腦部nAChRs的定量分析方法,具有較好的分辨率和準(zhǔn)確性,放射性配體的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用使得PET具備實(shí)時(shí)定量檢測(cè)人腦nAChRs的發(fā)展?jié)摿?但目前放射性配體可識(shí)別的受體種類有限,且多限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn),因此需要開(kāi)發(fā)更高效更理想的放射性示蹤劑以用于人腦中nAChRs的成像研究。隨著檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展,對(duì)于nAChRs分布與表達(dá)的研究已從單個(gè)亞基表達(dá)水平進(jìn)化到對(duì)不同類型受體的成像檢測(cè)和定量分析,人們可基于這些手段檢測(cè)不同腦區(qū)nAChR亞型的分布差異和表達(dá)變化。目前,已有相當(dāng)多的研究深入探討了煙堿作用下各腦區(qū)中不同nAChR亞型的表達(dá)變化及其在煙堿成癮中發(fā)揮的作用,并提出多個(gè)機(jī)制來(lái)解釋煙堿誘導(dǎo)的上調(diào):煙堿可在細(xì)胞內(nèi)增加nAChRs組裝、運(yùn)輸以及亞基的成熟和折疊,減少亞基的降解,并且能夠改變亞基化學(xué)計(jì)量及受體構(gòu)象。盡管針對(duì)煙堿調(diào)節(jié)nAChRs機(jī)制的研究已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展,但許多研究結(jié)果之間存在矛盾,各個(gè)機(jī)制在煙堿誘導(dǎo)nAChRs上調(diào)中發(fā)揮的作用尚不清楚,同時(shí)也有研究顯示不同的機(jī)制可能在細(xì)胞中共同發(fā)揮作用,所以之后的研究應(yīng)更加重視煙堿作用下nAChRs的復(fù)雜變化以及多種作用機(jī)制之間的關(guān)聯(lián)。目前的研究大多數(shù)僅關(guān)注某一種或幾種受體,缺乏針對(duì)腦區(qū)各受體綜合作用的整體性研究,同時(shí)成癮不同階段中各受體分布變化的研究也尚不充分。此外,基于吸煙者腦部受體變化的研究需要更成熟的受體成像和原位檢測(cè)技術(shù),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)nAChRs的空間定位和實(shí)時(shí)定量檢測(cè),以便更深入地探究煙堿在體內(nèi)的復(fù)雜作用,明確煙堿與nAChRs表達(dá)的作用機(jī)制,從而明確煙堿成癮與nAChRs的相關(guān)性。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中nAChRs的激活導(dǎo)致各種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放增強(qiáng),包括乙酰膽堿、多巴胺、谷氨酸和γ-氨基丁酸。大量研究表明nAChRs多種亞型介導(dǎo)煙堿成癮、獎(jiǎng)賞和戒斷過(guò)程,并與帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)疾病有關(guān),因此nAChRs的結(jié)構(gòu)、功能以及信號(hào)傳導(dǎo)成為藥物成癮和精神疾病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。中腦多巴胺神經(jīng)元在煙堿依賴的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用,煙堿可通過(guò)多巴胺神經(jīng)元中表達(dá)的nAChR亞型調(diào)節(jié)多巴胺釋放及神經(jīng)元活性。腹側(cè)被蓋區(qū)的谷氨酸神經(jīng)元也是獎(jiǎng)賞回路的重要組成部分,有研究顯示nAChRs在谷氨酸神經(jīng)元中表達(dá),并且煙堿可通過(guò)nAChRs調(diào)節(jié)腹側(cè)被蓋區(qū)的興奮性傳遞,表明腹側(cè)被蓋區(qū)谷氨酸神經(jīng)元中的膽堿能機(jī)制參與煙堿誘導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[76]。另外,膽堿能也可調(diào)節(jié)海馬區(qū)和記憶功能,研究表明 9 種亞基(α2～α7 和 β2～β4)在海馬中表達(dá),其中最豐富的是α7*nAChRs和α4β2*nAChRs,對(duì)煙堿具有高親和力的 α4β2*nAChRs可介導(dǎo)海馬中煙堿誘導(dǎo)的突觸可塑性,α7*nAChRs則對(duì)Ca2+具有高度可滲透性,在突觸調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[77]。煙堿通過(guò)獎(jiǎng)賞回路各腦區(qū)中表達(dá)的nAChRs對(duì)突觸傳遞、神經(jīng)可塑性產(chǎn)生影響,進(jìn)而產(chǎn)生成癮等一系列變化,煙堿成癮過(guò)程中nAChRs介導(dǎo)作用的研究尚不全面,同時(shí)煙堿作用下nAChRs相關(guān)信號(hào)通路的變化及其與成癮之間的關(guān)聯(lián)也有待進(jìn)一步探討。