一株植物根際促生菌Gnyt1的特性研究及分類地位的確定

李建宏，李雪萍，李昌寧，韓冰，徐萬里，姚拓*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，甘肅 蘭州 730070；3.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；4.鎮(zhèn)原縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅 慶陽 744599)

微生物資源不僅是新時代具有戰(zhàn)略意義的資源，更是一類開發(fā)潛力巨大的可再生資源，是世界各國都優(yōu)先發(fā)展的方向[1]。植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是定殖于植物根系附近，具有促進(jìn)植物生長的功能，或具有抑制植物病原菌作用的一大類細(xì)菌[2]。植物根際促生菌作為植物根際微生物的功能性組分，是非常重要的微生物資源。植物根際促生菌中的某些類群可以促進(jìn)土壤中難溶性養(yǎng)分的溶解，如促進(jìn)磷、鉀元素的溶解釋放；而另有一些類群可以通過自身代謝作用固定空氣中的氮素，使之成為植物可以吸收利用的硝態(tài)氮或銨態(tài)氮；還有一些類群可以分泌諸如植物生長素(indole-3-acetic acid，IAA)、赤霉素(gibberellin，GA)、玉米素(trans-Zeatin，t-Z)等植物激素，促進(jìn)植物的生長[3]。此外，還有某些類群可以有效抑制鐮刀菌(Fusarium)、絲核菌(Rhizoctonia)等植物病原菌的生長，起到防治植物病害的作用[4]。目前，我國農(nóng)業(yè)所遇到的作物養(yǎng)分與肥料供應(yīng)問題、作物病害問題、連作障礙問題、土壤污染與退化問題、間套作和水旱輪作問題都與根際系統(tǒng)相關(guān)[5-7]，歸納來看，都是根—土界面的物質(zhì)交換和理化變化問題，因此，都能從植物根際促生菌中找到突破口[3,8]。

植物根際促生菌的發(fā)現(xiàn)和其調(diào)控技術(shù)的完善為解決我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的問題提供了新思路，其應(yīng)用潛力已被廣泛認(rèn)可，越來越多的研究者投身于植物根際促生菌的研究，大量性能優(yōu)良的促生菌株被篩選出來，并有部分已在生產(chǎn)中得到了應(yīng)用，其產(chǎn)品也日趨多樣化，如各種含促生菌的微生物肥料、土壤生物改良劑等[9-10]。本課題組從西北地區(qū)不同生境下數(shù)十種植物根際分離出了具有不同功效的優(yōu)良植物根際促生菌上千株，其中部分菌株已被用來制作生物肥料或促生菌劑[11-13]，進(jìn)入中試階段。Gnyt1菌株是分離自甘肅天祝縣高寒草地優(yōu)勢植物珠芽蓼(Polygonumviviparum)根際的一株優(yōu)良促生菌，對其進(jìn)行了初步的研究，研究數(shù)據(jù)顯示該菌株具有促生性能，將其試制為促生菌制劑，發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)植物生長、提高土壤肥力的作用[14]。但是，從工業(yè)化開發(fā)的角度來看，前期的工作還不夠系統(tǒng)，一般而言，適合于工業(yè)化開發(fā)的微生物資源不僅要求其具備良好的功能特性，而且還必須具備良好的生物學(xué)特性，如較高的生長速度、易于滿足的培養(yǎng)條件、生物安全性以及穩(wěn)定性，這些方面是工業(yè)微生物應(yīng)用價值非常重要的評判標(biāo)準(zhǔn)，其性能高低，直接決定著菌株能否進(jìn)入規(guī)?；_發(fā)階段。鑒于此，本研究以Gnyt1菌株為材料，對其性能進(jìn)行系統(tǒng)的研究，以期對其有更為全面的認(rèn)識，為開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，同時也為其他PGPR資源的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2016年6月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院實驗室進(jìn)行。菌株Gnyt1現(xiàn)保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草地生物多樣性實驗室。對照菌株Jm92、Lx191、LSH11、Jm170等均為課題組前期研究中積累的優(yōu)良菌株材料，其特性見表1。

致病性檢測試驗中供試的青稞(Hordeumvulgare)品種為“藏青”，種子由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供;供試番茄(Lycopersiconesculentum)品種為“巨粉寶石”，種子市售;供試油菜(Brassiacampestris)品種為“互豐010”，種子市售;供試當(dāng)歸(Angelicasinensis)苗購自甘肅省渭源縣會川鎮(zhèn);供試苜蓿(Medicagosativa)品種為“甘農(nóng)三號”，種子市售。

耐藥性檢測試驗中供試青霉素為注射用青霉素鈉(80萬單位，河南新鄉(xiāng)華星藥廠)，鏈霉素為注射用硫酸鏈霉素(100萬單位，華北制藥集團(tuán)愛諾有限公司)，羅紅霉素(華北制藥集團(tuán)愛諾有限公司)，頭孢拉定(武漢欣欣佳麗生物科技有限公司)。

盆栽所用土壤采挖自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田，加入少量蛭石備用。將準(zhǔn)備好的混有蛭石的土壤過3 mm的土壤篩，輻照滅菌(委托蘭州綠源輻照有限責(zé)任公司完成)，裝入已消毒的花盆(直徑18 cm，深19 cm)備用。

表1 對照菌株的特性Table 1 The characteristics of PGPR strains

1.2 主要方法

1.2.1菌株促生特性的測定 采用乙炔還原法(acetylene reduction assay，ARA)測定菌株固氮能力，以固氮酶活性表示[17-18]；采用鉬藍(lán)比色法(molybdenum blue colorimetry，MBC)測定溶磷能力[17-18]；采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定分泌植物激素能力[14]。

1.2.2菌株生物學(xué)特性研究 設(shè)置平行實驗，每個溫度梯度設(shè)3次重復(fù)，分別將活化后菌株接種置于4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44 ℃培養(yǎng)，在培養(yǎng)第32 h時取樣，測定其OD600和有效活菌數(shù)，對比分析不同溫度對菌株生長的影響。

配制溶菌肉湯(Luria-Bertani，LB)培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水定容至1000 mL，調(diào)節(jié)至pH 7.0)，滅菌后在無菌條件下使用1 mol·L-1的NaOH溶液和HCl溶液將培養(yǎng)液初始pH值分別調(diào)節(jié)至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，將待測菌株和對照菌株的對數(shù)期培養(yǎng)液(24 h)等量接種于不同初始pH的培養(yǎng)液中，每個梯度設(shè)3次重復(fù)，置于28 ℃培養(yǎng)48 h，測定其OD600和有效活菌數(shù)，對比分析不同pH對菌株生長的影響。

采用濾紙片法[19]分別測試菌株對青霉素、鏈霉素、羅紅霉素、頭孢拉定4種抗生素的耐受性。

分別選擇青稞、番茄、油菜、當(dāng)歸、苜蓿進(jìn)行試驗，采用灌根法和葉面接種法，測試菌株對植物的致病性。

將菌株活化后在LB培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接50代，取其第10、20、30、40、50代的培養(yǎng)物，分別測試其固氮、溶磷、分泌植物激素(以IAA為指標(biāo))的能力，測試方法如1.2.1所述，以此對比菌株的穩(wěn)定性。

1.2.3供試菌株對青稞的影響 挑選飽滿、無破損的種子，雙氧水浸種30 min消毒，無菌水浸泡2 h，然后置于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)催芽處理，發(fā)芽后挑選長勢一致的幼苗進(jìn)行栽培。每盆栽培15株，栽培7 d后選擇長勢一致的幼苗，每盆留苗10株。將活化后的菌株接種于LB培養(yǎng)液，180 r·min-1，28 ℃培養(yǎng)，血球計數(shù)板檢驗菌體濃度，待菌體濃度達(dá)到108cfu·mL-1時終止培養(yǎng)，用移液槍吸取培養(yǎng)液，滴加到幼苗根部，每苗加2 mL，對照為滅菌的LB培養(yǎng)液。置于室溫、自然光下培養(yǎng)，定期澆水。待種子成熟期測定青稞的株高、產(chǎn)量、地上生物量、地下生物量、千粒重等指標(biāo)。

1.2.4菌株分類地位的確定 菌株表型特征觀察：活化菌株，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、芽孢染色、革蘭氏染色[17]。生理生化特征研究：依據(jù)國標(biāo)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品微生物學(xué)檢驗-蠟樣芽胞桿菌檢驗》[20]的方法，分別設(shè)置動力試驗、溶血試驗、根狀生長測試、溶菌酶耐受性測試、蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶測試、V-P測試、檸檬酸鹽利用測試、明膠液化測試等生理生化實驗，觀察并記錄實驗結(jié)果。

16S rRNA基因分析：用試劑盒(OMEGA)提取菌株總DNA，瓊脂糖凝膠電泳法分析DNA的純度，紫外分光光度法測定其純度[19]。引物選用16S rRNA基因擴(kuò)增通用引物27F-1492R(由上海派森諾生物科技股份有限公司提供)，序列分別為，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和擴(kuò)增反應(yīng)程序參照李雪萍等[19]的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測合格后直接送交測序，測序工作委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成。獲得序列后登陸NCBI數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行BLAST比對。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA分析，Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗，Excel 2010繪圖，使用CLUSTALX 1.83軟件和MEGA 5.1.2軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株促生特性

2.1.1菌株固氮及溶磷能力 如表2所示，對照菌株Jm92、LSH11、Jm170的固氮酶活性均低于Gnyt1，且Gnyt1菌株的固氮酶活性高出3個對照菌株數(shù)十倍之多，顯示了Gnyt1菌株的巨大應(yīng)用潛力。不同的菌株溶解無機(jī)磷的能力不同(表2)，供試菌株的溶無機(jī)磷量遠(yuǎn)高于4個對照菌株，差異顯著(P<0.05)。4個對照菌株中，LSH11菌株的溶無機(jī)磷量最高，達(dá)264.22 μg·mL-1，最低的是Jm170，為33.68 μg·mL-1。不同菌株溶解有機(jī)磷的能力不同，供試菌株Gnyt1溶解有機(jī)磷的能力僅次于Jm92，而高于LSH11和Lx191兩個菌株，而Jm170未檢測出對有機(jī)磷的溶解能力，綜上，可以看出，菌株Gnyt1溶解有機(jī)磷的能力雖非最強(qiáng)，但也較高，因此具有開發(fā)利用前途。

2.1.2菌株分泌植物激素能力 如表3所示，供試菌株Gnyt1和4株對照菌株Jm92、Lx191、LSH11、Jm170均有不同程度地分泌植物激素的能力，說明分泌植物激素能力在PGPR中是一種常見的功能，但不同菌株分泌植物激素的種類不同，如Gnyt1和Jm170具有分泌IAA、GA3、t-Z等3種植物激素的能力，而Jm92有分泌IAA和GA3的能力，LSH11則具有分泌IAA和t-Z的能力，Lx191只能分泌IAA。就同一植物激素來看，不同菌株分泌能力差別很大，分泌IAA的能力以供試菌株Gnyt1為最高,另外兩種激素GA3和t-Z的分泌能力也以供試菌株Gnyt1為最高。綜上，就分泌植物激素能力而言，最突出的為供試菌株Gnyt1，其不僅分泌植物激素的種類多，分泌量也最高。

表2 菌株固氮酶活性、溶磷能力的比較Table 2 Comparison of nitrogen fixation activities, phosphorus dissolving ability of strain (mean±SD, n=3)

注：表中數(shù)值為3次重復(fù)試驗的平均值； “/”表示該菌株未檢測出固氮酶活性或溶磷能力；不同小寫字母表示各菌株間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: The values in the table are the average of 3 replicates; “/” indicates that the strain did not be detected nitrogenase activity or phosphate solubilization; different lowercase letters indicate significant differences between the strains (P<0.05). The same below.

表3 樣品中植物激素的含量Table 3 The amount of plant hormones in the sample (mean±SD, n=3) (μg·mL-1)

注：表中“/”表示待測菌株未檢測出該活性。下同。

Note: “/” in table indicates that the strain did not be detected activity, the same below.

2.2 菌株生物學(xué)特性

2.2.1菌株對溫度的耐受性 如圖1所示，本研究選用的供試菌株和對照菌都對溫度變化具有敏感性，溫度對其生長的影響十分明顯，在4 ℃，各菌株都停止生長，而到8 ℃，各菌株都有微弱的生長，但生長速率不同，其中以Jm170生長相對最好。到12 ℃時，各菌株生長變得較為明顯。16～28 ℃時，各菌株都是隨生長溫度越高、生長越好。但超過28℃，不同菌株的趨勢不同，Lx191、Gnyt1和Jm92的生長速率仍隨溫度升高而加快，而其余兩株菌則生長受到了抑制，到36 ℃時，Gnyt1的生長速率與32 ℃接近，證明Gnyt1的最佳生長溫度應(yīng)在32～36 ℃，而Lx191和Jm92的生長速率則到36 ℃時達(dá)到最高。到40 ℃以上，所有菌株的生長都明顯受到了抑制。

2.2.2菌株對不同pH的適應(yīng)能力 如圖2所示，供試菌株Gnyt1和4株對照菌株都對pH具有敏感性，pH值的改變引起菌株生長速率的強(qiáng)烈變化，pH低于4時，所有菌株都不生長，酸環(huán)境抑制了菌體酶活性，從而抑制了菌株的生長。在pH為4時，菌株開始生長，但生長十分微弱，在該條件下，供試菌和對照菌的差異不明顯，pH為6時各菌株的生長速率進(jìn)一步加快，不同菌株的差異較pH為5時增大；pH為7時，Jm92、LSH11及Jm170等3株菌的生長速率達(dá)到最高。而Lx191和Gnyt1兩株菌pH為8時的生長速率和pH為7時相近，推測其最適pH應(yīng)在7和8之間。當(dāng)pH繼續(xù)增大，到9以上時，所有菌株的生長都受到了嚴(yán)重的抑制，但Lx191和Gnyt1兩株菌到pH為10時仍能微弱生長，pH為11以上所有菌株停止生長。

圖1 菌株對溫度的響應(yīng)Fig.1 The curve of strain response to temperature

圖2 菌株對pH的響應(yīng) Fig.2 The curve of strain response to pH

2.2.3菌株的耐藥性 本研究選擇了幾種常見的抗生素，檢驗菌株對其耐受性。由圖3可以看出，本研究所測試的目的菌Gnyt1和4種對照菌對青霉素、鏈霉素、羅紅霉素及頭孢拉定的反應(yīng)不同。同一種菌對不同抗生素的敏感程度不同，以供試菌Gnyt1為例，其對羅紅霉素的敏感性最高，其抑菌圈半徑最大，其次是青霉素和頭孢拉定，而鏈霉素的抑菌圈半徑最小。而不同菌對同一種抗生素的敏感程度也不同，以鏈霉素為例，菌株Jm92對其極為敏感，抑菌圈半徑較大，而Lx191的敏感程度最低，抑菌圈最小，其余菌株居于二者之間。但總體而言，本研究選用的5株菌對4種抗生素均沒有耐藥性，可見其具有生物安全性。

圖3 菌株的耐藥性Fig.3 Bacterial resistance CK為無菌水，不同小寫字母表示差異顯著。下同。CK is sterile water, and different lowercase letters indicate significant differences. The same below.

2.2.4菌株致病性的測定 本試驗主要測定了兩種處理方式下，供試菌和對照菌對作物致病的情況。如表4所示，在菌液灌根的處理組，5株菌對青稞、番茄、油菜、當(dāng)歸、苜蓿均未發(fā)現(xiàn)其有致病性，證明其在根際并不能引起作物發(fā)病。在葉面接種的處理組，Gnyt1、Jm92、Lx191等3株菌對5種植物均不致病，但LSH11和Jm170處理油菜時，發(fā)現(xiàn)個別植株出現(xiàn)了葉斑病癥狀，疑似細(xì)菌性葉斑病，但從該葉斑上，并沒有分離出與LSH11和Jm170相似的菌株，因此，其原因還要進(jìn)一步分析。綜上，供試菌Gnyt1在兩種接種方式下供試植物均未發(fā)病，說明Gnyt1菌株具有生物安全性，有進(jìn)一步開發(fā)利用的潛力。

表4 菌株致病性測試結(jié)果Table 4 The pathogenicity of the tested strains

注： “-”代表未發(fā)病；“+”代表發(fā)病；用LSH11菌株和Jm170菌株葉面接種法處理油菜后，3組重復(fù)中有1組的油菜葉片出現(xiàn)疑似細(xì)菌性葉斑病癥狀；對發(fā)病的評價依據(jù)是其引起的細(xì)菌性病害，某些不明因素引起疾病的如蟲咬、真菌侵染等未計入內(nèi)。

Note: “-” stands for no disease; “+” stands for disease; after treating rapeseed with LSH11 strain and Jm170 strain by foliar inoculation method, one of three groups of repeated leaves showed suspected bacterial leaf spot symptoms; The basis for the evaluation of the disease is the bacterial disease caused by it, and some diseases caused by unknown factors such as insect bites and fungal infections are not included.

2.2.5菌株的性狀穩(wěn)定性 如表5～7所示，無論是供試菌Gnyt1，還是對照菌Jm92、LSH11、Lx191和Jm170，在純培養(yǎng)條件下隨著菌株傳代次數(shù)的增加，其各性狀都呈下降趨勢?？梢?，在純培養(yǎng)條件下，菌株功能退化是一種普遍存在的現(xiàn)象。但不同的性狀其退化程度有所不同，如固氮能力和分泌IAA能力退化較為明顯，而溶無機(jī)磷能力則退化不明顯。

表5 菌株的固氮性狀穩(wěn)定性測試結(jié)果Table 5 Results of stability on nitrogen fixation activities (mean±SD, n=3)

表6 菌株的分泌IAA性狀穩(wěn)定性測試結(jié)果Table 6 Results of stability on produce IAA activities (mean±SD, n=3)

菌株在純培養(yǎng)條件下(表5)，固氮酶活性隨傳代次數(shù)增加都出現(xiàn)了下降，但不同菌株變化的趨勢有所不同，Gnyt1菌株的下降率略低于其他菌株，且前30代基本能保持穩(wěn)定。在純培養(yǎng)條件下(表6)，菌株分泌IAA的能力隨傳代次數(shù)增加均會下降，其中LSH11菌株傳代到第50代，分泌IAA能力消失，而Lx191菌株傳代至40代時分泌IAA能力即消失。本研究的目的菌Gnyt1隨傳代次數(shù)增加分泌IAA的能力也在下降，傳代前期下降速度較緩慢，30代后下降速度加快。

菌株在純培養(yǎng)條件下(表7)，隨傳代次數(shù)增加，各菌株的溶磷能力都出現(xiàn)了下降，但不同菌株變化的趨勢有所不同，Gnyt1菌株的下降率略低于其他菌株，且前30代基本能保持穩(wěn)定。

表7 菌株的溶磷性狀穩(wěn)定性測試結(jié)果Table 7 Results of stability on phosphate solubilization activities (mean±SD, n=3)

2.3 菌株對青稞的影響

2.3.1對青稞株高的影響 如圖4所示，青稞種植中施入PGPR菌對青稞株高有顯著的促進(jìn)生長作用。無論是目的菌株Gnyt1，還是對照菌Jm92、LSH11、Lx191和Jm170，施入根際后，均能起到促進(jìn)青稞生長的作用。但不同菌株促生能力不同，促生作用最強(qiáng)的是Gnyt1菌株，其次是Jm92菌株，結(jié)合2.1.1的研究結(jié)果可以看出，這兩個菌株有相對較強(qiáng)的固氮能力，而青稞作為禾本科的作物，其對氮肥的依賴較高，因此這兩個菌株在青稞根際使用時促生能力突出。促生能力最弱的是LSH11菌株，Jm170和Lx191菌株居中。

2.3.2對青稞生物量的影響 如圖5所示，PGPR對青稞生物量的增加有很明顯的促進(jìn)作用，施入PGPR制劑后，無論是地上生物量還是地下生物量，處理組都較CK有顯著的提高。不同菌株對青稞生物量的影響不同，Gnyt1菌株對青稞生物量的促進(jìn)作用最強(qiáng)，其次是Jm92和Lx191菌株，相對最弱的是Jm170菌株。地上生物量和地下生物量的規(guī)律基本一致。而將圖5和圖4進(jìn)行對比可以發(fā)現(xiàn)，二者變化的趨勢相近，但青稞株高對不同菌株的反應(yīng)更為敏感。

圖4 菌株對青稞株高的影響 Fig.4 Effect of the PGPR strains on plant height

圖5 菌株對青稞生物量的影響Fig.5 Effect of the PGPR strains on plant biomass

2.3.3對青稞產(chǎn)量的影響 單株籽粒產(chǎn)量是評判糧食作物重要的指標(biāo)，而千粒重則反映顆粒的大小和飽滿程度，二者是產(chǎn)量構(gòu)成的重要因素。如圖6所示，促生菌株對青稞的單株產(chǎn)量有很明顯的影響，施入促生菌劑，青稞的單株籽粒產(chǎn)量有了很明顯的增加，無論是目的菌株Gnyt1，還是對照菌株Jm92、LSH11、Lx191和Jm170，其菌劑都能有效提高青稞的單株產(chǎn)量，證明其確實能增加土壤中氮、磷等養(yǎng)分的含量，促進(jìn)植物生長。但不同菌株菌劑的促生效果有差異，其趨勢和生物量及株高基本一致，均為Gnyt1菌株最強(qiáng)，Jm92和Lx191菌株次之，相對最弱的是LSH11菌株。如圖7所示，促生菌對青稞的千粒重也有促進(jìn)作用，各菌株都有作用，但不同菌株間的差異不明顯。

圖6 菌株對青稞單株產(chǎn)量的影響 Fig.6 Effect of the PGPR strains on average individual yield

圖7 菌株對青稞千粒重的影響Fig.7 Effect of the PGPR strains on thousand seed weight

2.4 菌株分類地位的確定

2.4.1菌株形態(tài)特征 經(jīng)菌落形態(tài)、革蘭氏染色、芽孢染色等觀察試驗，最終得出：本研究目的菌株Gnyt1菌落呈乳白色，不透明，邊緣不圓整，表面不光滑、不隆起，革蘭氏陽性；菌體長桿狀，具圓端，鏈狀排列、中生芽孢，且芽孢橢圓形，孢囊不膨大。根據(jù)形態(tài)特征和本課題組前期的研究，可以初步認(rèn)為該菌株為蠟樣芽孢桿菌組(BacilluscereusGroup)的菌株，但其為圓端，與典型的蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)不符合。

2.4.2生理生化特征分析 如表8所示為本研究目的菌株Gnyt1和蠟樣芽孢桿菌組(B.cereusGroup)菌株生理生化特性的對比，將其結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物學(xué)檢驗-蠟樣芽胞桿菌檢驗》[20]所規(guī)定的指標(biāo)進(jìn)行對比，可以發(fā)現(xiàn)，Gnyt1菌株的生理生化特性與蕈狀芽孢桿菌(Bacillusmycoides)的生理生化特征的吻合度為100%。

2.4.316S rRNA基因序列分析 通過在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(圖8)，與Gnyt1菌株16S rRNA基因序列相似度較高的菌株有炭疽桿菌(Bacillusanthracis)、蠟樣芽孢桿菌、Bacillustoyonensis、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、蕈狀芽孢桿菌、Bacillusweihenstephanensis、兵馬俑芽胞桿菌(Bacillusbingmayongensis)、假真菌樣芽孢桿菌(Bacilluspseudomycoides)等，其中，與蕈狀芽孢桿菌和Bacillusweihenstephanensis的相似度最高，達(dá)100%。

2.4.4Gnyt1菌株分類地位的確定 結(jié)合表型特征的觀察結(jié)果、生理生化特性的分析以及16S rRNA基因序列分析的結(jié)果，最終初步確定Gnyt1菌株為蕈狀芽孢桿菌(B.mycoides)(但其準(zhǔn)確分類地位還需要依靠二者之間的DNA-DNA同源性雜交等實驗結(jié)果來確定)，該菌株由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草地微生物多樣性實驗室保存，保存系列編號為GAU-48。將該菌株提交至中國典型培養(yǎng)物保藏中心專利保藏，保藏號為CCTCCM 2017177。將BacillusmycoidesGnyt1菌株16S rRNA基因序列提交至NCBI，獲得序列登陸號為：KY887028。

3 討論

3.1 菌株Gnyt1優(yōu)良的多功能促生特性

本研究所選用的供試菌株Gnyt1和優(yōu)良的對照菌株Jm92、LSH11、Lx191、Jm170均具有多功能性，即都具有兩種或兩種以上的促生能力。但Gnyt1促生性能最為突出， 其固氮酶活性為3193.04 nmol C2H4·h-1·mL-1，

表8 Gnyt1菌株的生理生化特性與蠟樣芽孢桿菌組內(nèi)菌株對照Table 8 Physiological and biochemical characteristics of strain Gnyt1 and comparison of strains in the Bacillus cereus Group

注：本表中的蠟樣芽孢桿菌組(B.cereusGroup)菌株對照的數(shù)據(jù)引自國標(biāo)(GB 4789.14-2014)；表中的“+”代表該菌株此反應(yīng)為陽性，“-”代表此反應(yīng)為陰性。對照菌數(shù)據(jù)中的“+/-”代表該菌的大部分菌株為“+”，“-/+”代表該菌的大部分菌株為“-”。

Note: The comparison data of theB.cereusgroup strains in this table is quoted from the national standard (GB 4789.14-2014); the “+” in the table indicates that the reaction is positive, and the “-” represents this reaction is negative. “+/-” in the data of control bacteria indicates that most of the strains are “+”, and “-/+” represents that most of the strains are “-”.

圖8 Gnyt1菌株的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.8 The phylogenetic tree of strain Gnyt1 and its closely related type strains in the same group

高出優(yōu)良對照菌株中固氮能力最強(qiáng)菌株Jm92數(shù)十倍之余，顯示了其巨大的固氮潛力。微生物固氮是除了植物光合作用之外地球上第二重要的生物化學(xué)反應(yīng)，具有固氮能力的微生物將存在于空氣或土壤中的氮素通過固氮酶的催化作用而形成植物可以吸收利用的氮素，要比人類發(fā)明的化學(xué)固氮在效率上優(yōu)越的多[21]。此外，Gnyt1對無機(jī)磷溶解量為564.34 μg·mL-1，比對照菌株中溶解無機(jī)磷最強(qiáng)菌株LSH11更突出，有研究表明，溶磷量的多寡與分泌有機(jī)酸的能力有關(guān)，這些有機(jī)酸可降低土壤局部的pH值，使一些難溶性磷酸鹽在酸性條件下分解；還使一些與有機(jī)酸結(jié)合的金屬離子(如Al3+、Fe3+、Ca2+、Mg2+)發(fā)生絡(luò)合或鰲合，減少了易與磷酸根結(jié)合的金屬陽離子，使磷酸根離子被釋放出來[22]，使無機(jī)磷有效的溶解和被植物吸收。此外，其分泌的植物激素不僅種類多，分泌量也最高，而其他對照菌株分泌植物激素的能力都弱于Gnyt1，如Lx191只有分泌IAA能力，沒有分泌植物激素GA3和t-Z的能力。馬文彬[18]研究發(fā)現(xiàn)，菌株分泌的植物激素不僅促進(jìn)植物吸收礦物質(zhì)和水分，還可抑制病原微生物，使植物的生理活性提高，促進(jìn)植物生長發(fā)育。一般而言，植物的生長并不是某一個因素的作用，它是諸多環(huán)境因子共同作用的結(jié)果，因此，針對某個單一因素的改善其效果往往有限且容易顧此失彼，例如化肥，就是單一的增加某種成分，雖然能在一定程度上起到增產(chǎn)的作用，但是“顧此失彼”的情況也不容忽視，短期產(chǎn)量增加了，土壤質(zhì)量的破壞也很嚴(yán)重。Gnyt1的多功能性正好彌補(bǔ)了這種缺陷，因為其功能多樣，所以能夠全面、均衡的提高土壤質(zhì)量，提高農(nóng)作物產(chǎn)量，這也正是Gnyt1制劑作為微生物肥料的潛力所在。

3.2 菌株Gnyt1退化的問題

無論是供試菌株Gnyt1，還是對照菌株Jm92、LSH11、Lx191和Jm170，在純培養(yǎng)條件下，固氮性狀、溶磷能力和分泌植物激素性狀都隨著菌株傳代次數(shù)的增加其能力呈下降趨勢。可見，在純培養(yǎng)條件下，菌株功能退化是一種普遍存在的現(xiàn)象，但菌株Gnyt1有強(qiáng)大的固氮、溶解有機(jī)磷、分泌植物激素的能力，即使在培養(yǎng)至第50代，Gnyt1的固氮酶活性和溶解無機(jī)磷量仍比其他對照菌株強(qiáng)，分別為1256.31 nmol C2H4·h-1·mL-1和287.51 μg·mL-1。如韓華雯等[12]2013年測定Jm92菌株的固氮酶活性為75.34 nmol C2H4·h-1·mL-1，而本研究的測定為61.82 nmol C2H4·h-1·mL-1，還有如Lx191菌株的溶解無機(jī)磷能力，馮瑞章等[13]在2009年測定其無機(jī)磷增量時數(shù)值為200.2 μg·mL-1，而本研究中僅為173.08 μg·mL-1，下降很明顯，排除了測定方法的誤差，推測其與菌株特性的退化有關(guān)。Gnyt1不同性狀其退化程度有所不同，如固氮能力和分泌IAA能力退化較為明顯，而溶解無機(jī)磷能力則退化不明顯。分析其原因，菌株溶解無機(jī)磷，主要是菌株產(chǎn)酸引起的，是細(xì)胞的基本功能之一，而分泌IAA和固氮，則非必要功能[23]，故不同菌株之間退化程度也有所不同。要解決此類業(yè)界難題，一方面要不斷地選育和改良菌株，另一方面，更要不停地從不同的環(huán)境中分離篩選，得到更好的菌株。

3.3 菌株Gnyt1優(yōu)良的生物學(xué)特性

近年來，抗生素在農(nóng)業(yè)上已成為防治病害的重要手段。而隨著抗生素的濫用，由此導(dǎo)致的環(huán)境惡化、病原菌耐藥性增強(qiáng)、藥物殘留以及相關(guān)食品安全性等問題也日益為人們所關(guān)注[23]。有研究發(fā)現(xiàn)抗生素的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性及抗生素抗性基因污染比較普遍[24]，因此，工業(yè)微生物的開發(fā)，應(yīng)該充分重視耐藥性的問題，本研究對供試菌株進(jìn)行了耐藥性驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株Gnyt1對羅紅霉素和頭孢拉定的敏感性最高，其次是青霉素，而鏈霉素最弱，但總體而言，菌株對4種抗生素均沒有耐藥性，可見其具有生物安全性。通過對菌株溫度的測定表明，菌株Gnyt1的最佳生長溫度為32～36 ℃，而對照菌株Lx191和Jm92的生長速率在36℃時達(dá)到最高，到40 ℃以上，所有菌株的生長都明顯受到了抑制，徐巖[25]研究表明在發(fā)酵工業(yè)中，微生物生長的溫度一般在20～40 ℃，在發(fā)酵過程中，需要控制適當(dāng)?shù)臏囟?，才能使菌體生長和代謝產(chǎn)物的合成順利進(jìn)行。靳國杰等[26]研究發(fā)酵溫度(15～25 ℃)對霞多麗干白葡萄酒香氣質(zhì)量的影響，發(fā)現(xiàn)隨發(fā)酵溫度的升高，葡萄酒的果香特征(青蘋果、菠蘿、香蕉、檸檬、梨等)先增后減。較高的發(fā)酵溫度有利于形成甜果香與不良?xì)馕?。由此可見，菌株Gnyt1在發(fā)酵工程中也具有良好的應(yīng)用前景。

劉二偉等[27]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液培養(yǎng)基的pH對微生物生長具有非常明顯的影響，pH也是影響發(fā)酵過程中各種酶活的重要因素。大多數(shù)微生物生長的pH范圍是6～8，最適pH在7和8之間。本實驗發(fā)現(xiàn)Lx191和Gnyt1兩株菌pH為8時的生長速率和pH為7時相近，推測其最適pH應(yīng)在7和8之間。當(dāng)pH繼續(xù)增大，到9以上時，所有菌株的生長都受到了嚴(yán)重的抑制，但Lx191和Gnyt1兩菌株在pH為10時仍能微弱生長，pH為11以上所有菌株停止生長。pH是發(fā)酵過程中重要的環(huán)境因子，它的改變會引起各種酶活的變化，影響菌體對基質(zhì)的利用，甚至改變菌體的代謝途徑和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最終影響產(chǎn)品的形成，且每種微生物都有適合生長的范圍，同一種微生物在不同的生長階段和不同生化過程中，對環(huán)境pH也有不同的要求[27]。

在菌液灌根的處理組，菌株對青稞、番茄、油菜、當(dāng)歸、苜蓿均未發(fā)現(xiàn)其有致病性，無致病性的菌株是優(yōu)良微生物肥料的關(guān)鍵所在。工業(yè)微生物不僅要具備卓越的功效，還應(yīng)滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要，如較高的生長速度、易于滿足的培養(yǎng)條件、生物安全性以及穩(wěn)定性，這些方面是工業(yè)微生物應(yīng)用價值非常重要的評判標(biāo)準(zhǔn)，其性能高低，直接決定著菌株能否進(jìn)入規(guī)?；_發(fā)的階段[28]。

3.4 菌株對青稞的影響

本研究發(fā)現(xiàn)施入促生菌劑，Gnyt1菌株對青稞生物量的促進(jìn)作用最強(qiáng)，地上生物量和地下生物量的規(guī)律基本一致；單株籽粒產(chǎn)量有了很明顯的增加，無論是目的菌Gnyt1，還是對照菌Jm92、LSH11、Lx191和Jm170，其菌劑都能有效提高青稞的單株產(chǎn)量，促進(jìn)植物生長。但不同菌株菌劑的促生效果有差異，其趨勢和生物量及株高基本一致，均為Gnyt1菌株最強(qiáng)，Jm92和Lx191菌株次之，相對最弱的是Jm170菌株。韋澤秀等[29]研究發(fā)現(xiàn)施用谷特菌能提高青稞分蘗能力，促進(jìn)青稞群體生長；其次，谷特菌能促進(jìn)青稞根系發(fā)育，有利于青稞抗倒伏，在拔節(jié)期施用谷特菌能提高青稞灌漿能力，增加青稞穗粒數(shù)，提高青稞產(chǎn)量，而本研究也得到了相似的結(jié)論。

3.5 關(guān)于Gnyt1菌株兩次鑒定差異的問題

本課題組劉婷[14]曾對Gnyt1菌株進(jìn)行過鑒定，當(dāng)時鑒定認(rèn)為其為蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)，該結(jié)論是基于16S rRNA基因序列得出的，本研究在后期研究中，發(fā)現(xiàn)該菌株與典型的B.cereus有差異，原因如下：1)菌體形態(tài)，B.cereus末端為方形，而Gnyt1菌株末端為圓形；2)根狀生長試驗中，Gnyt1菌株為陽性，而B.cereus的根狀生長試驗的結(jié)果應(yīng)為陰性(GB 4789.14-2014)；3)動力試驗的結(jié)果是Gnyt1菌株沿穿刺線呈絨毛狀生長，而典型的B.cereus應(yīng)沿穿刺線擴(kuò)散生長。以上3個現(xiàn)象與鑒定結(jié)果相矛盾，為解決這一疑惑，本研究運(yùn)用了國標(biāo)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品微生物學(xué)檢驗-蠟樣芽胞桿菌檢驗》(GB 4789.14-2014)[20]的方法，對該菌株的分類地位進(jìn)行了重新確定，在此基礎(chǔ)上，還運(yùn)用了16S rRNA基因分析技術(shù)進(jìn)行再次鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌株的某些特征與典型的蠟樣芽孢桿菌并不匹配，而與B.mycoides完全吻合。將16S rRNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，結(jié)果序列與B.mycoides和B.cereus的相似度都很高，結(jié)合表型特征和生理生化實驗特征，認(rèn)為該菌株歸屬到B.mycoides更為適合。B.mycoides和B.cereus均為B.cereusgroup的菌株，表型和16S rRNA基因序列的相似度均很高，因此鑒別存在困難，本研究采用了多種鑒定方法相結(jié)合的手段，將其分類地位確定為Bacillusmycoides。

4 結(jié)論

本研究以課題組前期研究中獲得的優(yōu)良菌株Gnyt1為研究對象，從菌株特性和全基因組序列信息兩個角度入手，對Gnyt1菌株進(jìn)行了較為深入的研究，得到以下結(jié)論：1)Gnyt1菌株具有較強(qiáng)的固氮、溶磷以及分泌植物激素的能力；2)Gnyt1菌株具有生長速度快、穩(wěn)定期活菌濃度高，適合高密度發(fā)酵，對溫度和pH的適應(yīng)范圍較寬的特點；此外，其沒有耐藥性和致病性。但在純培養(yǎng)條件下，隨傳代次數(shù)增加，促生特性下降，傳代至第30代以后，促生特性下降明顯；3)盆栽實驗顯示Gnyt1菌株可以促進(jìn)植物(青稞)的生長，增加農(nóng)作物子實體和營養(yǎng)體的產(chǎn)量，提高有效成分的含量；4)結(jié)合表型特征、生理生化特征、16S rRNA基因序列特征等方面，將Gnyt1菌株鑒定為蕈狀芽孢桿菌Bacillusmycoides。