假芝菌絲體多糖ARP的純化、結構及抗氧化活性

伍燕，申利群，朱華*

1(興義民族師范學院，貴州 興義，562400) 2(廣西民族大學 化學化工學院,廣西 南寧，550006) 3(廣西林產化學與工程重點實驗室,廣西 南寧，550006)

假芝(Amaurodermarugosum)屬靈芝科、假芝屬，主要分布在海南省、廣西壯族自治區(qū)、廣東省、云南省和貴州省等熱帶和亞熱帶地區(qū)，其子實體受傷后會呈紅色傷變，故又叫血芝，據文獻報道假芝屬共有22個種[1]。假芝屬中的皺蓋假芝(A.rude)、廈門假芝(A.amoiensis)和假芝(A.rugosum)經現代醫(yī)學研究表明具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎和保肝護肝等功效，其活性成分有多糖、三萜酸、甾醇類、生物堿、有機酸、長鏈烷烴和酚類等[2-5]。

靈芝多糖是靈芝水提物的主要活性成分，被認為具有“生物反應調節(jié)劑”(biological modifier，BRM)的作用，是一種優(yōu)良的抗氧化活性物質[6]，真菌多糖的活性與多糖的溶解度、黏度、分子量、糖苷鍵類型、單糖組成及摩爾比、支化度和重復單元數量等相關。高級結構指多糖的空間結構，如糖鏈間的氫鍵和支鏈間以非共價鍵形成的復雜空間構象，目前研究比較困難；初級結構可采用現代光譜手段進行分析，多糖糖苷鍵主要有α和β構型，相對分子質量從幾萬到幾百萬不等，單糖主要有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖等，支鏈的連接方式復雜，這些結構表征被認為與多糖的生物活性有密切關系[7]。近年來，假芝子實體的人工栽培已有報道[8]，但對其多糖的結構特征和活性研究鮮有報道，了解假芝多糖的初級結構對深入研究其活性是重要的基礎工作。

本研究對產自貴州的野生假芝(A.rugosum)進行了菌絲體的分離和純化，深層發(fā)酵后收集菌絲體，熱水浸提多糖，采取紅外、氣相色譜-質譜、核磁、高效液相凝膠等技術對多糖的結構進行了全面的分析，并對粗多糖和精制多糖的抗氧化活性進行了對比研究，以期促進假芝多糖的深入開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料

野生假芝，采集自貴州省冊亨縣(命名為CHJZ)，海拔約879 m處的野生板栗樹下，子實體樣品及分離純化菌絲保存于廣西民族大學天然產物研究實驗室。

1.2 實驗試劑

氯化717陰離子交換樹脂，索萊寶公司；DEAE-纖維素52、Sephadex G-100，上海瑞永生物科技公司；DPPH和ABTs等抗氧化試劑，麥克林試劑公司；多糖分子量和單糖摩爾比標準品：Dextran，鼠李糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖(AR)，Sigma公司；硫酸、蒽酮、葡萄糖(AR)等，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器和設備

旋轉蒸發(fā)儀RE52-2型，上海亞榮生化儀器公司；安捷倫1200高效液相色譜儀、自動進樣器、G1352A RID檢測器、安捷倫7890A-5975C 氣相色譜-質譜聯用儀、DB-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)和質譜檢測器，安捷倫科技有限公司；真空冷凍干燥機LGJ-10，北京松源華興科技有限公司；VERTEX 70傅里葉變換顯微紅外/拉曼光譜儀，德國Bruker公司；ThermoScientific Multiskan FC酶標儀，美國賽默飛公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌絲體分離和分子生物學鑒定

將新鮮子實體分別用無菌水、75%體積分數酒精清洗，用無菌解剖針在超凈工作臺取菌蓋與菌柄中間米粒大小菌肉放置于PDA平板中，26℃恒溫靜置培養(yǎng)7 d，待長出白色菌絲體，按改良CTAB法提取菌株總DNA[9]，通用引物ITS1和ITS4擴增其ITS序列，將ITS產物送深圳華大基因雙向測序，將測序結果在GenBank里檢索Blast N，并將ITS序列提交GenBank獲取登錄號。

1.4.2 菌絲體粗多糖的提取

菌絲以10%的量接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，26 ℃，靜置培養(yǎng)20 d，取出菌絲體用ddH2O沖洗、烘干后磨成粉待用。取5 g干菌粉以料液比1∶20的比例加入蒸餾水，沸水提取1 h，抽濾，重復1次。合并提取液加入無水乙醇，終濃度調整到75%，4 ℃冰箱過夜沉淀，離心、棄上清經干燥得粗多糖。

1.4.3 精制多糖的分離和純化

粗多糖復溶于水，采用717陰離子交換樹脂脫色，sevage法V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1脫蛋白，裝DEAE-52纖維素柱，用不同濃度的NaCl溶液(0.05、0.1、0.2和0.3 mol/L)洗脫，以洗脫管數為橫坐標，蒽酮-硫酸法測定多糖吸光度值為縱坐標，在Excel 2010中作圖，收集吸光度值高的均一組分多糖用Sephadex G-100進一步純化，3 500 Mw的透析袋除鹽后經低溫冷凍干燥，得精制多糖。

1.4.4 紅外和核磁檢測

干燥的精制多糖用常規(guī)方法壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀掃描分析(掃描范圍400～4 000 cm-1)；另取精制多糖10 mg溶于0.5 mL D2O中，內標為TMS，進行1H-NMR和13C-NMR掃描。

1.4.5 分子量測定色譜條件

參照文獻[10]的方法，略作修改。TSKgel?G5000PWXL凝膠色譜柱，柱溫20 ℃，0.002 mol/L NaH2PO4(含質量濃度0.5 g/L NaN3)為流動相，流速0.6 mL/min，進樣量20 μL，運行時間90 min，RI檢測器檢測。

1.4.6 葡聚糖標準曲線及樣品測定

分別稱取適量的Dextran標準品，將其配制成質量濃度約3 mg/mL的對照品溶液，之后逐一進行HPLC檢測，根據標準糖Mw的保留時間(RT)繪制標準曲線，統計線性關系。稱取一定量的精制多糖樣品，加入流動相，將其配制成質量濃度約為1 mg/mL的溶液，Millipore 0.45 μm水系濾膜過濾，進樣檢測。

1.4.7 單糖摩爾比色譜條件及組成檢測

參照文獻[11]的方法，略作修改。以多糖糖醇乙酸酯衍生物的方法對樣品的單糖組成和摩爾比進行測定。色譜柱：HP-5 (30 mm×0.25 mm×0.25 μm)；檢測器：質譜檢測器；進樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：280 ℃；氦氣流速：0.6 mL/min；分流比：20∶1；進樣量：5 μL；升溫程序：200 ℃保持2 min，以3 ℃/min的速率升至245 ℃，再以10 ℃/min的速率升至270 ℃，保持2 min。

準確稱取樣品5 mg，以2 mol/L的TFA溶解，99 ℃水解5 h，旋蒸除酸，加入質量濃度40 g/L的硼氫化鈉溶液0.5 mL，室溫放置1.5 h，滴加乙酸至無氣泡產生，反復濃縮除酸。將濃縮至干的樣品真空干燥，加吡啶及正丙胺各1 mL，55 ℃水浴30 min，真空干燥，加吡啶及乙酸酐各0.5 mL，95 ℃水浴1 h，氮氣吹干，真空干燥后以氯仿溶解，進行GC-MS分析。

1.4.8 抗氧化活性測定

1.4.8.1 總還原力

將抗壞血酸Vc、粗多糖和精制多糖分別配制成質量濃度0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mg/mL樣品待用，取各樣品100 μL，依次加入250 μL的磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH值6.6)，質量濃度10 g/L鐵氰化鉀250 μL，混勻后50 ℃水浴20 min，取出加入體積分數10%三氯乙酸溶液250 μL終止反應，取250 μL上清液加入等體積質量濃度1 g/L氯化鐵，混勻后靜置10 min，反應結束取200 μL于96孔酶標板中，700 nm處測定吸光度值，記為Ai，以ddH2O為空白對照，記為Aj，重復3次[12]。

總還原力=Ai-Aj

(1)

式中：Ai表示不同樣品的吸光度值，Aj表示空白對照的吸光度值。

1.4.8.2 DPPH自由基清除率

將抗壞血酸Vc、粗多糖和精制多糖分別配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mg/mL不同質量濃度樣品待用，精確配制0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液。取各樣品不同濃度樣液100 μL加入300 μL的DPPH乙醇溶液，混勻、避光靜置30 min，反應結束后，取200 μL上清液在517 nm波長處測定吸光度值，記作Ai(樣品吸光度值)；取各樣品不同濃度樣液100 μL，以無水乙醇代替DPPH溶液，同法測定吸光度值，記作Aj(樣品本底吸光度值)；取100 μL的ddH2O加入300 μL的DPPH溶液，同法測定吸光度值，記作A0(陰性對照)，重復3次[13]。

(2)

1.4.8.3 ABTs自由基清除率

將抗壞血酸Vc、粗多糖和精制多糖分別配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mg/mL不同質量濃度樣品待用，配制7 mmol/L的ABTs水溶液和2.45 mol/L的過硫酸鉀水溶液，使用時等體積混合，將工作液濃度的吸光度值調整為0.70±0.05(λ=734 nm)。取各樣品不同濃度樣液100 μL，加入300 μL的ABTs溶液，混勻、避光靜置20 min，反應結束后，取200 μL上清液在734 nm波長處測定吸光度值，記作Ai(樣品吸光度值)；取各樣品不同濃度樣液100 μL，以ddH2O代替ABTs溶液，同法測定吸光度值，記作Aj(樣品本底吸光度值)；取100 μL的ddH2O加入300 μL的ABTs溶液，同法測定吸光度值，記作A0(陰性對照)，重復3次[14]。

(3)

2 結果和分析

2.1 菌株的分子生物學鑒定

測定的ITS序列提交到GenBank， Blast N表明冊亨假芝(CHJZ)以100%的支持率與假芝(KJ654362.1)處于同一個分支，分子生物學鑒定結果表明,該菌屬于假芝屬的假芝(A.rugosum)，獲基因登錄號MG021113。

2.2 菌絲體多糖的純化

如圖1所示，0.05 mol/mL NaCl洗脫后得到均一組分多糖，命名為ARP，收集這一組分的洗脫液，減壓濃縮、透析袋(Mw 3500)除鹽、冷凍干燥得棕色粗多糖。120 mg粗多糖用ddH2O復溶，過葡聚糖凝膠柱G-100，進一步純化后，冷凍干燥得到白色精制多糖40 mg。

圖1 ARP的DEAE-纖維素52離子交換柱層析洗脫曲線Fig.1 The profile of DEAE-cellulose 52 ion exchange column chromatography by ARP

2.3 菌絲體多糖ARP的紅外圖譜

圖2 ARP菌絲體多糖的紅外圖譜Fig.2 FT-IR spectrum of A.rugosum polysaccharide(ARP)

2.4 假芝菌絲體精制多糖ARP的核磁圖譜

核磁分析1H譜和13C譜如圖3所示。1H NMR質子信號在δ(3.4～4.1)ppm區(qū)間內，是不同糖殘基非異頭質子的亞甲基和次甲基上的質子共振峰交互重疊產生的多糖信號峰；在異頭氫質子區(qū)域δ 4.5～δ5.0有3個氫信號，說明有3種單糖，這與ARP的單糖組成分析一致[16]；δ 4.65 ppm信號峰為氘代試劑重水質子氫的共振信號峰[17]，在δ 5.29 ppm出現信號峰，說明存在α糖苷鍵，這與紅外數據一致。13C NMR信號在異頭碳區(qū)存在3個δ 102.31、101.32、97.82 ppm峰，說明有3種不同糖基單元的存在，δ102.31 ppm信號屬甘露糖，δ101.32 ppm信號屬鼠李糖，δ97.82 ppm信號屬半乳糖[18-21]，這與氣相色譜檢出ARP單糖組成一致，信號峰在δ 77.36 ppm確證多糖以(1→4)-α-吡喃糖苷鍵為主鏈，1H NMR信號δ 1.08 ppm和13C NMR信號δ15.62 ppm說明有(1→6)糖苷鍵[22]，δ15.62 ppm為鼠李糖的C6。

圖3 ARP多糖核磁氫譜圖(A)和核磁碳譜圖(B) Fig.3 1H NMR spectrum(A)and 13C NMRspectrum(B)of ARP

2.5 假芝菌絲體精制多糖分子量及單糖摩爾比

如圖4-A所示，HPLC-GPC呈單一對稱峰，保留時間與分子量對數的回歸方程為lgMw=-0.42x+10.48，R2=0.998 4，將保留時間t=14.72代入方程，計算得到ARP的平均分子量為1.86×104Da。

圖4 ARP的HPGPC色譜圖(A)和ARP的GC-MS色譜圖(B) Fig.4 HPGPC of ARP(A)and GC-MS chromatograph of ARP(B)

如圖4-B所示，與標樣的保留時間對照后得出ARP含有鼠李糖、甘露糖和半乳糖，3種單糖的摩爾比為1∶1.24∶3.51，ARP是一種以半乳糖為主的多聚糖，一個重復單元約含有21n，鼠李糖、甘露糖及半乳糖的個數分別是4，5和14 n，進一步說明ARP是吡喃糖，其糖苷鍵為α型，鍵型為1→4、1→6。

2.6 粗多糖和精制多糖的抗氧化活性比較

2.6.1 總還原力測定

還原能力用于評價抗氧化能力的大小，所測吸光度越大表明該物質抗氧化能力越強。如圖5所示，假芝新鮮菌絲體提取的粗多糖和精制后多糖隨著質量濃度的增大，吸光度值也增大，吸光度值和質量濃度呈量效關系；在1 mg/mL時，粗多糖的吸光度值是0.70，精制多糖是0.41，粗多糖是精制多糖的1.72倍，粗多糖的吸光度值在假芝菌絲體相同質量濃度下比精制多糖的高，表明粗多糖的抗氧化活性比精制后多糖的活性好。

圖5 假芝菌絲體粗多糖和精制多糖的總還原力Fig.5 The total antioxidant capacity of the crude polysac-charide and the fine polysaccharide from strain CHJZ

2.6.2 DPPH抗氧化活性比較

圖6所示，假芝菌絲體粗多糖和精制多糖對DPPH自由基清除率均隨質量濃度的增加而升高。

圖6 假芝菌絲體粗多糖和精制多糖對DPPH自由基清除能力Fig.6 The scavenging capacity on DPPH radical of the crude polysaccharide and the fine polysaccharide from strain CHJZ

粗多糖質量濃度在1 mg/mL時，清除率為95.59%，接近于Vc，經各自的擬合曲線計算，粗多糖EC50是0.05 mg/mL，精制多糖EC50是1.15 mg/mL，半濃度值越低，則抗氧化活性越強，表明菌絲粗多糖對DPPH自由基清除效果優(yōu)于精制多糖。

2.6.3 ABTS自由基清除率測定

如圖7所示，假芝菌絲體多糖對ABTS自由基清除率隨質量濃度增加而升高，粗多糖的變化明顯，在質量濃度0.1～0.4 mg/mL，ABTS自由基清除率上升較快，0.6 mg/mL后放緩，在質量濃度為1 mg/mL時，ABTS自由基清除率接近于Vc。經各自的擬合曲線計算，粗多糖EC50是0.15 mg/mL，精制多糖EC50是1.49 mg/mL，菌絲粗多糖對ABTS自由基清除效果強于精制多糖。

圖7 假芝菌絲體粗多糖和精制多糖對ABTS自由基清除能力Fig.7 The scavenging capacity on ABTS radical of the crude polysaccharide and the fine polysaccharide from strain CHJZ

3 結論與討論

從野生假芝的深層發(fā)酵菌絲體中提取得到胞內多糖，純化后采用多種色譜手段分析，實驗可知ARP含α-糖苷鍵，鍵型有1→4，1→6兩種，單糖間連接方式是確定多糖一級結構的重要特征；ARP平均分子量為1.86×104Da，一般認為分子量的大小與多糖活性有關，大分子量多糖和側鏈的連接方式對多糖的生物活性有重要的影響，這可確保高級結構的空間構象；ARP單糖組成為鼠李糖、甘露糖和半乳糖，3種單糖的摩爾比為1∶1.24∶3.51，一個重復單元約含有21n個單糖，了解單糖組成有助于對后續(xù)分子改性后生物活性的變化進行研究。ARP初級結構的確定，為假芝菌絲體多糖樣本庫的建立提供了相關數據，也為后續(xù)假芝多糖活性與構效關系的深入研究提供參考。

假芝多糖有良好的抗氧化活性，粗多糖具有比精制多糖更好的抗氧化活性，質量濃度為1 mg/mL時，粗多糖總還原力是精制多糖的1.72倍，粗多糖的DPPH和ABTs自由基清除率EC50值均顯著小于精制多糖，推測粗多糖中某些小分子物質或多肽可以與多糖起協同作用，有效增強粗多糖的體外抗氧化活性。研究還發(fā)現，菌絲越新鮮，提取的多糖抗氧化活性越強，通過對假芝多糖抗氧化活性和初級結構的研究，為進一步全面了解和開發(fā)來自假芝的真菌多糖提供了理論依據。