超聲波輔助高效提取辣木籽中的蛋白質

邵婷，劉昕，黎重陽，鐘金鋒，覃小麗

(西南大學 食品科學學院，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶，400715)

辣木是產于北印度的多年生速生樹種。目前，我國已在云南、福建、廣西等省份引進辣木品種并形成種植規(guī)模[1]。辣木的葉、種子及根等部分均可食用，富含多種維生素、礦物質元素且具有藥理活性，是一種兼具優(yōu)良保健和治療作用的藥食同源性植物。辣木籽中含有豐富的油脂(約39%)和蛋白質(約36%)[2]。其中，辣木籽油中油酸含量高達68%[3]，油酸具有降低膽固醇和調節(jié)血脂等作用；辣木籽中蛋白質含量遠高于其在莖、葉、籽殼中的含量，且含有人體所需的全部必需氨基酸[4]，是一種營養(yǎng)價值較高的蛋白質。因此，研究合適的高效提取方法，分離得到辣木籽的蛋白質、油脂等主要營養(yǎng)成分，在功能食品、醫(yī)藥和化妝品等領域的產品開發(fā)方面具有重要意義。

目前，對辣木籽蛋白質的研究主要集中在脫脂辣木籽中蛋白質的分級提取及其在水處理中的效果[3，5]，以及水酶法同時提取辣木籽油和蛋白質等方面[6-8]。

蛋白質的傳統提取法中所需提取時間較長(通常大于1 h)[9]，不利于其提取效率的提高。近年來，超聲波輔助法因其在提取蛋白質過程中具有耗時短、純度高、有利于改善蛋白功能性質等優(yōu)點而被廣泛用于大豆、花生蛋白質的提取[10-11]。目前，已有的報道多集中在利用超聲輔助法提取辣木籽油[3]以及辣木葉多酚[12]、黃酮[13]和蛋白質[14]的工藝研究中。然而，關于辣木籽蛋白質的分離提取的研究報道還很少，尤其是利用超聲輔助提取辣木籽蛋白質的相關研究尚未見報道。

本文以脫脂辣木籽為原料，采用超聲輔助法提取辣木籽蛋白質，考察超聲功率、液料比、NaCl濃度、提取pH和提取時間對蛋白質提取率的影響，以期提高辣木籽蛋白質的提取效率以及為其開發(fā)與利用提供理論依據與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木籽，產于北印度喜馬拉雅區(qū)，購于昆明中藥材市場；石油醚(沸程60～90 ℃)，購于重慶川東化工(集團)有限公司；考馬斯亮藍G-250和牛血清蛋白，購于合肥志宏生物技術有限公司；其他試劑均屬于分析純；超純水，由YSL-RO-T10L/H超純水系統(Ashland公司)制備。

1.2 實驗儀器

GM-K20型加熱破壁料理機，佛山市順德區(qū)格明電器實業(yè)有限公司；Scientz-800CQ型超聲波提取震蕩反應器，寧波新芝生物科技股份有限公司；RW20數顯型混合頂置式機械攪拌器，德國IKA公司；FD-1A-50型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；H4-20KR型臺式高速冷凍離心機，湖南可成儀器設備有限公司；PB-10 pH計，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 辣木籽蛋白的提取方法

將辣木籽粉碎并過40目篩，用沸程為60～90 ℃的石油醚(m(辣木籽粉)∶v(石油醚)=1∶6)在30 ℃下攪拌(500 r/min，40 min)脫脂，重復提取2次。把經過二次脫脂后的辣木籽粉置于通風櫥內至石油醚完全揮發(fā)得到脫脂辣木籽粉(蛋白質含量為54.63%)。將脫脂辣木籽粉與一定濃度的NaCl溶液按一定比例混合，用1.00 mol/L的HCL調節(jié)混合液pH至一定值后在一定溫度下超聲攪拌提取。然后，將提取混合液在4 ℃下離心(4 630×g,15 min)，過濾，收集上清液；對所得沉淀進行第二次超聲提取，最后合并2次超聲提取的上清液。

1.3.2 單因素試驗

以蛋白質提取率為評價指標，分別考察超聲功率(0～240 W)、液料比(10∶1～60∶1，mL∶g)、NaCl濃度(0～1.75 mol/L)、pH(4.00～11.00)及超聲提取時間(5～20 min)對辣木籽蛋白質提取率的影響。

1.3.3 響應面優(yōu)化試驗

在辣木籽蛋白質提取的單因素基礎上進行響應面優(yōu)化試驗。根據Box-Behnken模型，以液料比、NaCl濃度、pH為自變量，辣木籽蛋白質提取兩次的提取率為響應值，設計3因素3水平的響應面分析試驗(表1)。

表1 Box-Benhnken試驗因子水平編碼表Table 1 Factor coding and levels of Box-Benhnkenexperiments

1.3.4 蛋白質的沉淀試驗

以蛋白質沉淀率為評價指標，考察鹽析體系中NaCl濃度(2.56、3.42、4.27 mol/L)對上清液中蛋白質沉淀率的影響。具體操作為：將最佳提取條件下所得的上清液pH調至10.00后加入一定質量的NaCl，在室溫下靜置2 h后離心(8 230×g,15 min)，過濾，收集沉淀，將沉淀透析72 h，透析液冷凍干燥后得到純化后的辣木籽蛋白粉；同時測定離心后上清液的蛋白質濃度以計算蛋白質沉淀率。

1.3.5 蛋白質相關指標的測定方法

采用凱氏定氮法[15]對脫脂辣木籽粉和鹽析純化后辣木籽蛋白粉中總蛋白質的質量進行測定。采用考馬斯亮藍法[16]對蛋白質提取中上清液蛋白質的質量進行測定；牛血清蛋白濃度與吸光度的標準曲線為y=44.54x+0.019 3，標準曲線相關系數R2=0.998 7。蛋白質提取率、蛋白質純度和蛋白質沉淀率分別按公式(1)、(2)和(3)計算。

(1)

(2)

(3)

1.4 數據處理

各實驗重復3次，各樣品的指標平行測定至少2次，以平均值±標準偏差表示結果。采用SPSS 18.0軟件對數據進行單因素方差分析(P<0.05時判斷組間存在顯著差異)。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲功率對辣木籽蛋白質提取率的影響

在液料比為30∶1，pH為6.00，提取溫度為40 ℃，提取時間為15 min，NaCl濃度為0.500 mol/L，提取2次的條件下，超聲功率對辣木籽蛋白質提取率的影響如圖1所示。當超聲功率從0 W增加到120 W時，辣木籽蛋白質的提取率明顯提高了14.54%(P<0.05)。這可能是因為隨著超聲功率在一定范圍內的增加，超聲波振蕩頻率增加，液體中的壓力增大，超聲波的空氣化作用和機械剪切力作用得到增強，脫脂辣木籽細胞壁的破壞速度加快，進而更有利于蛋白質分子展開并與溶劑接觸，最終促進了蛋白質溶解于提取液中[17]。然而，當超聲功率從120 W增加到240 W時，提取率呈現下降的趨勢并趨于平緩。其原因可能是較大超聲功率會使空化氣泡來不及破裂，空氣化作用效率降低，并且會增加散射衰減，形成聲屏障，這使蛋白質分子間的黏滯性增強，提取率降低[18-19]。因此，確定辣木籽蛋白質提取的最佳功率為120 W。

圖1 超聲功率對辣木籽蛋白質提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the extractability of protein from the defatted Moringa oleifera seed flour

2.1.2 液料比對辣木籽蛋白質提取率的影響

在pH為6.00，提取溫度為40 ℃，提取時間15 min，提取功率為120 W，NaCl濃度為0.500 mol/L，提取2次的條件下，液料比對辣木籽蛋白質提取率的影響如圖2所示。當液料比從10∶1增大到40∶1時，蛋白質的提取率提高較快，增加了29.80%，這可能是由于溶劑的適量增加使得辣木籽在溶劑中的接觸面積與分散度增大，擴散作用增強[20]。當液料比大于40∶1后，蛋白質的提取率繼續(xù)增大，但增長趨勢變緩。雖然蛋白質提取率隨著液料比的增大(10∶1～60∶1)而不斷提高，但是上清液中的蛋白質質量濃度從18.35 mg/mL下降到4.022 mg/mL，濃度太小會增加后續(xù)蛋白質濃縮純化的負擔，這在工業(yè)生產中尤為明顯。因此，不再對更大液料比進行試驗探究，選擇液料比40∶1為響應面試驗的中心點。

圖2 液料比對辣木籽蛋白質提取率的影響Fig.2 Effect of the liquid-solid ratio on the extractabilityof protein from the defatted Moringa oleifera seed flour

2.1.3 NaCl濃度對辣木籽蛋白質提取率的影響

在液料比為40∶1，pH為6.00，提取溫度為40 ℃，提取時間15 min，提取功率為120 W，提取2次的條件下，NaCl濃度對辣木籽蛋白質提取率的影響如圖3所示。當NaCl濃度從0增大至0.250 mol/L時，辣木籽蛋白質的提取率從7.78%迅速增大至70.68%，這表明了辣木籽蛋白質主要為鹽溶性蛋白質。當NaCl濃度增加至1.00 mol/L時，蛋白質提取率緩慢增加至最大值(80.80%)，這可能由于較低濃度的NaCl溶液(≤1.00 mol/L)中Cl-與蛋白質分子帶電基團發(fā)生微弱結合，促進了蛋白質溶解于溶劑中。然而，繼續(xù)增大NaCl濃度至1.75 mol/L時，辣木籽蛋白質提取率顯著下降了9.43%，這可能是在高濃度鹽溶液中蛋白質發(fā)生了鹽析作用，降低了辣木籽蛋白質的溶解度。因此，確定提取辣木籽蛋白質最佳NaCl濃度為1.00 mol/L。

圖3 NaCl溶液濃度對辣木籽蛋白質提取率的影響Fig.3 Effect of NaCl concentration on the extractability of protein from the defatted Moringa oleifera seed flour

2.1.4 pH對辣木籽蛋白質提取率的影響

在液料比為40∶1，提取溫度為40 ℃，提取時間為15 min，提取功率為120 W，NaCl濃度為1.00 mol/L，提取2次的條件下，pH對辣木籽蛋白質提取率的影響如圖4所示。

圖4 pH對辣木籽蛋白質提取率的影響Fig.4 Effect of pH on the extractability of protein from thedefatted Moringa oleifera seed flour

辣木籽蛋白質在鹽溶體系中性偏酸性條件(pH 6.00)下提取率最高(79.03%)，此現象與汪國威等[6]采用水酶法制備辣木籽蛋白質得到最佳pH的結果一致。當提取液的pH大于6.0時，辣木籽蛋白質提取率開始下降，并在pH 10.0和11.0時，蛋白質提取率最低(63.09%和62.79%)，這與大多數植物蛋白質在弱堿性(pH 7.50～9.00)條件下隨著堿性增強提取率增大的現象[21-22]相反，反映了辣木籽蛋白質中含有較多的堿性蛋白質。在pH為11.00時，提取液開始有腥味產生，這可能是在此強堿性環(huán)境下，蛋白質小部分水解產生氨基酸。因此，確定提取辣木籽蛋白質的最佳pH為6.00。

2.1.5 提取時間對辣木籽蛋白質提取率的影響

在液料比為40∶1(mL∶g)，pH為6.00，提取溫度為40 ℃，提取功率為120 W，NaCl濃度為1.00 mol/L，提取2次的條件下，提取時間對辣木籽蛋白質提取率的影響如圖5所示。當提取時間由5 min延長至15 min時，辣木籽蛋白質的提取率由75.63%顯著提高至79.04%。這可能是因為辣木籽粉末的溶脹需要一定時間，充分溶脹更有利于蛋白質的溶解[23]。然而，當提取時間延長至20 min時，蛋白質提取率呈現下降趨勢，但降低不顯著(P>0.05)。這可能是因為蛋白質的空間結構在長時間超聲波的空化效應下會被破壞而發(fā)生變性沉淀，離心過濾時被去除，所以測出上清液中蛋白質含量偏低[24]。因此，確定提取辣木籽蛋白質的最佳時間為15 min。

圖5 提取時間對辣木籽蛋白質提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extractability of protein from the defatted Moringa oleifera seed flour

2.2 響應面試驗結果與分析

考慮到不同因素之間可能存在協同交互作用，因此基于單因素試驗選擇NaCl濃度、液料比和pH作為Box-Behnken響應面設計的變量，以蛋白質提取率作為響應值進行試驗，結果見表2。通過對表2的數據分析計算各項回歸系數，建立了以蛋白質提取率(Y)對液料比(A)、NaCl溶液濃度(B)和pH(C)二次回歸模型：Y=79.28+9.70A+0.83B+1.29C+0.42AB-1.54AC-1.30BC+0.048A2-5.50B2-7.01C2。

對回歸模型進行方差分析，結果見表3?；貧w模型F=58.30，P<0.000 1，說明回歸模型具有高度顯著性，表明試驗設計可靠。失擬項F=5.72，P=0.063 5>0.05，說明回歸模型失擬項不顯著，試驗點均能用模型描述。模型相關系數R2=0.986 8，說明模型的擬合度較好，回歸方程是可靠的。決定系數為0.969 9，說明該模型能夠解釋96.99%響應值的變化，可以對辣木籽蛋白質提取率進行分析預測。從回歸模型顯著性系數檢驗可以看出模型一次項A、二次項B2和C2極顯著(P<0.01)，一次項C顯著(0.010.05)，說明NaCl濃度對辣木籽蛋白質提取率的影響不大，及各因素之間的交互作用不明顯。以此判斷出各因素對辣木籽蛋白質提取率的影響程度依次為：液料比>pH>NaCl濃度。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

因素交互作用對辣木籽蛋白質提取率影響的等高線與響應面圖如圖6所示。曲面越陡峭說明該因素對辣木籽蛋白質提取率的影響越顯著[25]。由圖6-a可知，pH為6.00時，相對于NaCl濃度的變化曲面，液料比的變化曲面更陡峭，說明了液料比對辣木籽蛋白質提取率的影響比NaCl濃度影響更顯著，這與方差分析的結果(表3)一致。由圖6-b可知，當NaCl濃度為1.00 mol/L時，與液料比的變化曲面相比，pH的變化曲面更平緩，說明液料比較pH對辣木籽蛋白質提取率的影響更顯著，這與方差分析結果(表3)一致；在pH 4.00～6.00范圍內液料比的響應曲面比pH 6.00～8.00的范圍內液料比的響應曲面更陡峭，說明在pH 4.00～6.00范圍內，液料比對辣木籽蛋白質提取率的影響更為明顯。等高線圖可以看出兩因素間交互作用的顯著程度，等高線呈圓形表示兩因素間交互作用不顯著，呈橢圓形則表明兩因素間交互作用顯著[26]。

由圖6-c可知，液料比為40∶1時，pH與NaCl溶液濃度的等高線呈圓形，說明pH與NaCl濃度間交互作用不顯著，這與方差分析的結果(表3)一致。

圖6 因素交互作用對辣木籽蛋白提取率的等高線和響應面圖Fig.6 Contour plots and response surface for the effectof operating parameters on the extractability of protein fromthe defatted Moringa oleifera seed flour

2.3 驗證試驗

根據軟件分析情況與實際操作情況確定最終優(yōu)化反應條件如下：NaCl濃度為1.10 mol/L，pH為6.30，液料比為60∶1，超聲功率和超聲時間分別為120 W和15 min，重復提取2次。為檢驗回歸模型方程的可靠性，用上述優(yōu)化條件進行驗證試驗。驗證得該條件下辣木籽蛋白質的提取率為88.09%，與預測值88.89%間的相對誤差為0.90%，說明由響應面法得到辣木籽蛋白質最佳提取工藝是可行的。

2.4 蛋白質的純化

NaCl濃度對辣木籽蛋白質的沉淀率及純度的影響如表4所示。鹽析體系中NaCl濃度從2.56 mol/L增大到4.27 mol/L時，蛋白質沉淀率提高了29.31%，且蛋白質純度均高達90.00%以上。在NaCl濃度為4.27 mol/L時，蛋白質沉淀率最大(86.80%)，該條件下所得的凍干粉中蛋白質純度為96.22%，這說明4.27 mol/L的NaCl能沉淀上清液中的大部分蛋白質，并且得到的辣木籽蛋白質純度較高。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

表4 NaCl濃度對辣木籽蛋白質沉淀率及純度的影響Table 4 Effect of NaCl concentration on the precipitationrate and purity of Moringa oleifera protein

3 結論

采用超聲輔助法提取辣木籽蛋白質，單因素試驗結果顯示辣木籽蛋白質主要為鹽溶蛋白質，且在弱酸性(pH 6.00)條件下更容易被提取。通過響應面分析得到各因素對辣木籽蛋白質提取率的影響作用依次為：液料比>pH>NaCl濃度。在超聲功率為120 W、超聲時間為15 min時，液料比為60∶1(mL∶g)、pH為6.30、NaCl濃度為1.10 mol/L條件下重復提取2次，辣木籽蛋白質的最高提取率可達88.09%。將此條件下所得的上清液在pH為10.00，NaCl濃度為4.27 mol/L的鹽析體系下進行鹽析，沉淀率達86.80%，透析純化后蛋白質純度為96.22%。這一系列試驗均表明超聲波輔助提取法能夠提高辣木籽蛋白質的提取效率。