小麥低聚肽固體飲料對小鼠免疫功能的影響

袁 媛，賈福懷，熊菲菲，雷 蕾，王彩霞，許璐云

（寧波御坊堂生物科技有限公司，浙江寧波 315012）

隨著工業(yè)的發(fā)展，現代人的生活環(huán)境發(fā)生了重大的變化，大氣、水體污染加重等因素導致人體免疫力下降，進而導致多種疾病的發(fā)生[1]。通過選擇合適的食品，可以適當提高免疫力。據報道，肽能夠通過刺激淋巴細胞增殖、增強巨噬細胞功能等來增強機體免疫力[2]。小麥低聚肽是以谷朊粉為原料，經酶解制得的小分子肽類的混合物[3]，于2002年由中華人民共和國衛(wèi)生部批準為新食品原料。研究表明，小麥低聚肽具有ACE抑制、嗎啡作用、抗氧化等多種生物活性[4]。目前，對小麥低聚肽類食品抗氧化活性研究較多，而關于此類食品的免疫功能研究較少，通過小鼠試驗研究小麥低聚肽固體飲料與免疫功能的關系，為小麥低聚肽類食品開發(fā)提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為SPF級的體重18～22 g的雌性ICR小鼠，浙江省實驗動物中心提供，生產許可證號為SCXK（浙） 2014-0001，使用許可證號為 SYXK（浙） 2011-0166。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～25℃，相對濕度40%～70%。

1.2 材料與試劑

小麥低聚肽固體飲料（由小麥低聚肽、菊粉、谷物粉等組成），自制；羧甲基纖維素鈉，阿拉丁試劑（上海） 有限公司提供；Hank"s液、ConA液，Sigma公司提供；RPMI1640培養(yǎng)液，Gibco公司提供；噻唑藍（MTT），Solarbio公司提供；綿羊紅細胞（SRBC）、雞血紅細胞，南京森貝伽生物科技有限公司提供；乳酸脫氫酶（LDH）測試盒，南京建成生物工程研究所提供。

1.3 儀器與設備

CP214型精密電子天平，美國OHAUS公司產品；759型紫外可見分光光度計；SZX7型解剖顯微鏡，日本OLYMPUS公司產品；VertA1型相機、AZ100型熒光顯微鏡，尼康公司產品。

1.4 試驗分組

試驗設3個劑量組和1個陰性對照組（質量分數為1%的羧甲基纖維素鈉）。低、中、高3個劑量分別為1.0，2.5， 5.0 g（kg·bw），相當于人體推薦攝入量的2，5，10倍。分別取小麥低聚肽固體飲料10，50，100 g加質量分數為1%的羧甲基纖維素鈉至200 mL，灌胃體積為10 g（kg·bw），對照組給予等體積的質量分數為1%的羧甲基纖維素鈉，每天灌胃1次，連續(xù)30 d。

1.5 試驗方法[5]

1.5.1 臟器/體重比值

各組1次/d灌胃給予小麥低聚肽固體飲料，連續(xù)30 d，頸椎脫臼法處死小鼠，取胸腺、脾臟，稱質量，計算胸腺/體重和脾臟/體重的比值。

1.5.2 細胞免疫功能測定

采用MTT法研究小麥低聚肽固體飲料對ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化的影響，采用足跖增厚法研究其對綿羊紅細胞（SRBC）誘導小鼠遲發(fā)型超敏反應（DTH） 的影響。

1.5.3 體液免疫功能測定

采用Jerne改良玻片法研究小麥低聚肽固體飲料對小鼠抗體生成細胞的影響，采用血凝法研究其對小鼠血清溶血素的影響。

1.5.4 單核-巨噬細胞功能測定

采用碳粒廓清法研究小麥低聚肽固體飲料對小鼠肝、脾吞噬細胞的影響，采用滴片法測定其對小鼠腹腔吞噬細胞的影響。

1.5.5 NK細胞活性測定

采用LDH測定法研究小麥低聚肽固體飲料對小鼠自然殺傷細胞（NK細胞）活性的影響。

1.6 數據處理與結果評定[5-6]

使用SPPS 19.0對試驗結果進行分析，運用LSD法進行單因素方差分析，p＜0.05為顯著差異，p＜0.01為極顯著差異。

增強免疫力功能判定：細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能測定單項中的2個試驗任意2個劑量組結果陽性，判定該項陽性；NK細胞活性測定試驗的1個以上劑量組結果為陽性，可判定該項陽性；以上4個方面評價任意2個方面陽性，可判定該產品具有一定的增強免疫力功能。

2 結果與分析

2.1 小麥低聚肽固體飲料對小鼠臟器/體重比值的影響

小麥低聚肽固體飲料對小鼠臟器/體重比值的影響見表1。

原始數據符合方差齊性要求（p＞0.05）。與陰性對照組比較，3個計量組小鼠胸腺/體重比值與脾臟/體重比值的差異均無顯著性差異。

表1 小麥低聚肽固體飲料對小鼠臟器/體重比值的影響

2.2 小麥低聚肽固體飲料對小鼠體重的影響

小麥低聚肽固體飲料對小鼠體重的影響見表2；小麥低聚肽固體飲料對小鼠體重的影響見表3；小麥低聚肽固體飲料對小鼠體重的影響見表4；小麥低聚肽固體飲料對小鼠體重的影響見表5。

表2 小麥低聚肽固體飲料對小鼠體重的影響

表3 小麥低聚肽固體飲料對小鼠體重的影響

表4 小麥低聚肽固體飲料對小鼠體重的影響

表5 小麥低聚肽固體飲料對小鼠體重的影響

與陰性對照組比較，3劑量組小鼠體重在試驗的初期、中期及終期，均無顯著性差異。

2.3 小麥低聚肽固體飲料對小鼠細胞免疫功能的影響

小麥低聚肽固體飲料對ConA誘導的小鼠淋巴細胞增殖能力的影響見表6，小麥低聚肽固體飲料對綿羊紅細胞（SRBC）誘導小鼠DTH的影響見表7。

用光密度值代表小鼠淋巴細胞的增殖能力，與陰性對照組比較，低、中、高劑量組ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖能力試驗光密度值均有增加，且中、高劑量組具有顯著性差異。SRBC可刺激T淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞，免疫4 d后，再以SRBC攻擊時，攻擊部位會出現遲發(fā)型變態(tài)反應。通過表7可以看出，各劑量組小鼠后足跖部24 h和0 h厚度差值均有一定程度的增加，與陰性對照組比較，無顯著差異（p＞0.05）。以上結果表明，小麥低聚肽細胞免疫功能測定為陽性。

表6 小麥低聚肽固體飲料對ConA誘導的小鼠淋巴細胞增殖能力的影響

表7 小麥低聚肽固體飲料對綿羊紅細胞（SRBC）誘導小鼠DTH的影響

2.4 小麥低聚肽固體飲料小鼠體液免疫功能的影響

小麥低聚肽固體飲料對小鼠抗體生成細胞的影響見表8，小麥低聚肽固體飲料對小鼠血清溶血素的影響見表9。

表8 小麥低聚肽固體飲料對小鼠抗體生成細胞的影響

表9 小麥低聚肽固體飲料對小鼠血清溶血素的影響

通過表8可以發(fā)現，與陰性對照組比較，低、中、高劑量組的溶血空斑數均有增多，低、中劑量組無顯著性差異，高劑量組具有極顯著性差異（p＜0.01）。由表9可知，原始數據符合方差齊性要求（p＞0.05）。與陰性對照組比較，中、高劑量組小鼠血清溶血素抗體積數值升高，具有顯著性差異（p＜0.01）。以上結果表明，小麥低聚肽固體飲料體液免疫功能結果為陽性。

2.5 小麥低聚肽固體飲料對小鼠單核-巨噬細胞功能的影響

小麥低聚肽固體飲料對小鼠碳廓清試驗吞噬指數的影響見表10，小麥低聚肽固體飲料對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞的影響見表11。

表10 小麥低聚肽固體飲料對小鼠碳廓清試驗吞噬指數的影響

表11 小麥低聚肽固體飲料對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞的影響

由表10可知，與陰性對照組比較，無顯著性差異。由表11可知，吞噬百分率通過X=Sin-1P1/2進行數據轉換，與陰性對照組比較，低、中、高劑量組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬率高于陰性對照組，僅高劑量組的吞噬率和吞噬指數高于陰性對照組，與陰性對照組比較，具有顯著性差異。以上結果表明，小麥低聚肽固體飲料對小鼠單核-巨噬細胞功能測定結果為陰性。

2.6 小麥低聚肽固體飲料對小鼠NK細胞活性的影響

小麥低聚肽固體飲料對小鼠NK細胞活性的影響見表12。

表12 小麥低聚肽固體飲料對小鼠NK細胞活性的影響

由表12可知，NK細胞活性通過X=Sin-1P1/2進行數據轉換，與陰性對照組比較，3個劑量組小鼠NK細胞活性明顯升高，具有極顯著性差異，說明NK細胞活性試驗結果陽性。

3 結論

試驗設置低、中、高3個劑量組，分別相當于人體推薦攝入量的2，5，10倍，同時設陰性對照組（質量分數為1%的羧甲基纖維素鈉），連續(xù)1個月經口給予小鼠不同劑量的小麥低聚肽固體飲料，各試驗組小鼠的初期體重、中期體重、終期體重、臟器/體重比值與陰性對照組相比均無顯著性差異。通過試驗證實，小麥低聚肽固體飲料細胞免疫功能、體液免疫功能、NK細胞活性試驗結果為陽性，小鼠單核-巨噬細胞功能試驗結果為陰性，說明小麥低聚肽固體飲料對小鼠無不良影響，且具有一定增強免疫力功能。

機體通過激活巨噬細胞、促進T細胞轉化、提高B淋巴細胞和NK細胞的活性來完成免疫反應[7]。Alberto M等人[8]研究發(fā)現，巨噬細胞通過分泌促炎性細胞因子和趨化因子來參加免疫應答，發(fā)揮免疫作用，還可通過抑制細胞因子IL-10/TGF-B等下調免疫應答，從而進行免疫調節(jié)。試驗中各劑量組的小麥低聚肽固體飲料對小鼠碳廓清試驗吞噬指數與陰性對照組比無顯著差異。在對小鼠腹腔巨噬細胞雞紅細胞影響的試驗中，低、中劑量組的吞噬率和吞噬指數與陰性對照組相比無顯著差異，高劑量組極顯著高于陰性對照組，說明一定劑量的小麥低聚肽固體飲料才能激活巨噬細胞。在機體中，參與免疫應答的主要免疫效應細胞為T，B淋巴細胞，這些細胞的體外增殖轉化能力可以反映細胞免疫功能，而脾臟中有一定數量的T，B淋巴細胞定居[9]。自然殺傷細胞（NK細胞） 獨立于T，B淋巴細胞，屬于固有的免疫細胞，是機體防御的第一道防線[10]。經研究證實NK細胞對半抗原具有記憶功能，當機體再次出現抗原刺激時，免疫應答會針對預先致敏宿主發(fā)生[11-12]。研究中，小麥低聚肽固體飲料對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖能力增加、提高NK細胞活性、小麥低聚肽類產品的開發(fā)提供依據。