萊菔硫烷對常氧條件下成骨細(xì)胞活性的影響

陳巧鳳 聞博 謝俊杰 曾冰

福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院骨科，福建 泉州 362000

萊菔硫烷(sulforaphane, SFN)是一種含硫化合物(異硫氰酸酯，ITC)，來自十字花科蔬菜，如西蘭花和西蘭花芽[1]，幾項(xiàng)研究報(bào)道[2]指出，ITC具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化活性的作用。SFN的抗氧化功能是由增強(qiáng)核因子2(Nrf2)依賴性誘導(dǎo)的血紅素加氧酶1(HO-1)介導(dǎo)的，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷[3-4]。SFN由于具有能夠通過激活Nrf2信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生一定濃度的抗氧化酶的能力，已經(jīng)受到了大量的關(guān)注，是Nrf2-ARE信號通路最有效的誘導(dǎo)劑之一[5]。

但是在2000年，即SFN出現(xiàn)后8年，Gamet等[6]第一次報(bào)道了SFN參與線粒體的變化。SFN似乎存在著相互矛盾的行為：SFN可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞線粒體的有害變化，最終會(huì)通過細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但是它也可以保護(hù)非癌細(xì)胞線粒體免受氧化攻擊，從而阻止了細(xì)胞死亡[7]，萊菔硫烷的這些作用與其調(diào)節(jié)線粒體活性變化有關(guān)。以往的文獻(xiàn)都集中在SFN對氧化應(yīng)激條件下細(xì)胞的作用，筆者將探索在常氧條件下SFN對成骨細(xì)胞的作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源：成骨細(xì)胞hfob1.19購于吉妮歐生物有限公司(中國)。

1.1.2 主要試劑及耗材：RPMI-1640(SH30809.01B/500 mL，Hyclone，美國); 胎牛血清(SV30087.03/500 mL，Hyclone，美國); 雙抗(SV30010/100 mL，Hyclone，美國); 胰酶(SH30042.01/100 mL，Hyclone，美國); PBS(SN331，南京生興生物技術(shù)有限公司，中國); DMSO(C6295-50 mL，Sigma，中國); 萊菔硫烷(SFN)(sbj-i0631/20 mg，南京森貝伽生物科技有限公司，中國); MTT(5 g，Bisharp，中國); PI-AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(EMS500FI/300 T，eBioscience，中國); 活性氧檢測試劑盒(DCFH-DA, S0033，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國)。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備：CO2細(xì)胞孵育箱(Thermo公司，美國); 厭氧培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國);多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax M5,MD公司，美國); 流式細(xì)胞儀(FACSCaliburBD Biosciences，美國); 高速離心機(jī)(Thermo公司，美國); 熒光分光光度計(jì)(上海棱光，中國)。

1.1.3 藥液配制：萊菔硫烷(SFN)用二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成100 mmol/L的儲(chǔ)存液，分裝后儲(chǔ)存于-20 ℃。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，使用時(shí)用1640完全培養(yǎng)液分別按照1∶20 000、1∶10 000、1∶5 000的比例稀釋成最終濃度為5、10、20 μmol/L，直接加入到培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：hfob1.19細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)在含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，置于34 ℃，含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。當(dāng)hfob1.19細(xì)胞長至80%～90%時(shí)，去除培養(yǎng)基，加入PBS沖洗1～2次。去除PBS后，加入1 mL胰酶消化1～3 min，加入3 mL完全培養(yǎng)基中和胰酶終止消化，將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 000 r/min, 離心5 min。倒掉上清后，加入3 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，1∶3傳代至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。當(dāng)hfob1.19細(xì)胞長至80%～90%時(shí)，去除培養(yǎng)基，加入PBS沖洗1～2次，去除PBS后，加入1 mL胰酶消化1～3 min，加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，六孔板每孔種2×106個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞搖晃均勻，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。常氧培養(yǎng)過夜后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別加入SFN 0、5、10、20 μmol/L，分別培養(yǎng)24 h和48 h。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞增殖：用血球計(jì)數(shù)板計(jì)5 000個(gè)細(xì)胞分別加入96孔板中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別加入SFN 0、5、10、20 μmol/L，分別培養(yǎng)24 h和48 h 后，去掉培養(yǎng)基，每孔加入50 μL MTT，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)約3 h。每孔加入150 μL DMSO，搖晃均勻，在570 nm處測定吸光度。

1.2.3 流式檢測細(xì)胞凋亡：在六孔板中分別種2×106個(gè)細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別加入SFN 0、5、10、20 μmol/L，分別培養(yǎng)24 h和48 h 后，用胰酶消化收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗三次細(xì)胞，4 ℃，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入1 mL binding buffer洗細(xì)胞，4 ℃，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入100 μL binding buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL PI和5 μL FITC-Annexin V，混合均勻，常溫避光孵育15 min，加入400 μL binding buffer混勻，立刻用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 檢測細(xì)胞內(nèi)ROS形成：hfob1.19細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)過夜后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別加入SFN 0、5、10、20 μmol/L，分別培養(yǎng)24 h和48 h，常規(guī)消化細(xì)胞，收集細(xì)胞沉淀，制備細(xì)胞懸液。按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。收集細(xì)胞后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為100萬～2 000 萬/mL，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。使用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，在熒光分光光度計(jì)檢測熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測細(xì)胞增殖

圖2 常氧條件下不同濃度SFN作用hfob1.19細(xì)胞24 h細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果(與0 μmol/L SFN組相比，***P<0.001)Fig.2 Results of different concentrations of SFN on hfob1.19 cells for 24 h by flow cytometry

24 h組的OD值分別為0.63±0.02，0.77±0.04，0.91±0.04，0.85±0.01，而48 h組的OD值分別為0.53±0.04，0.65±0.04，0.82±0.02，0.76±0.04。結(jié)果表明，在常氧條件下，當(dāng)SFN作用濃度為5 μmol/L 和10 μmol/L 時(shí)細(xì)胞的OD值增加明顯，當(dāng)濃度為20 μmol/L 時(shí)曲線趨于平緩甚至下降(圖1)。實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

圖1 常氧下不同濃度SFN作用hfob1.19的OD值Fig.1 OD values of hfob1.19 cultivated under normoxia conditions with different concentrations of SFN addition

2.2 流式檢測細(xì)胞凋亡

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡后發(fā)現(xiàn)24 h組的細(xì)胞凋亡率分別為3.76%、3.71%、3.38%、3.33%，與0 μmol/L SFN組對比，10 μmol/L、20 μmol/L 組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 在常氧條件下SFN濃度為10 μmol/L、20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡減少明顯。與0 μmol/L SFN組對比，實(shí)驗(yàn)組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖2; 48 h組的細(xì)胞凋亡率分別為4.02%、3.49%，3.33%，3.09%，結(jié)果顯示與0 μmol/L SFN組對比，各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖3; 在常氧條件下，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L SFN分別作用于成骨細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞凋亡減少。實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2.3 檢測細(xì)胞內(nèi)ROS形成

24 h組的細(xì)胞ROS值分別為3 152.67±118.73，2 762.33±75.25，2 384.67±100.52， 2 165.67±196.02; 48 h組的細(xì)胞ROS值分別為3 762.33±74.65，3 291±90.02，2 956.67±78.27，2 746.33±82.08。結(jié)果顯示，不同濃度的SFN會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平，在濃度為10 μmol/L、20 μmol/L 時(shí)，降低更為明顯。實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。見圖4。

圖3 常氧條件下不同濃度SFN作用hfob1.19細(xì)胞48 h細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果(與0 μmol/L SFN組相比，***P<0.001)Fig.3 Results of different concentrations of SFN on hfob1.19 Cells for 48 h by flow cytometry

圖4 常氧條件下不同濃度SFN作用成骨細(xì)胞24 h和48 h后hfob1.19細(xì)胞內(nèi)活性氧水平(A：24 h組;B：48 h組。與0 μmol/L SFN組相比，**P<0.01，***P<0.001)Fig.4 The intracellular levels of reactive oxygen species of hfob1.19 cells were detected after different concentrations of SFN acted for 24 h and 48 h on normoxic conditions

3 討論

氧化應(yīng)激的概念最早源于人類對衰老的認(rèn)識(shí)。1956年英國學(xué)者Harmna首次提出自由基衰老學(xué)說，該學(xué)說認(rèn)為自由基(free radical)攻擊生命大分子造成組織細(xì)胞損傷，是引起機(jī)體衰老的根本原因，也是誘發(fā)腫瘤等惡性疾病的重要起因。缺血再灌注損傷是許多疾病(急性心肌梗塞，中風(fēng))或手術(shù)環(huán)境(移植，止血帶相關(guān)手術(shù))的常見并發(fā)癥，其會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，有潛在的有害和致殘后果。缺血再灌注在骨科各種臨床操作中都能遇到，比如骨折愈合期間損傷血管的修復(fù)及新生血管的形成和生長，其產(chǎn)生的作用將影響成骨細(xì)胞的增殖和礦化。實(shí)驗(yàn)[8]表明，缺氧及缺氧再復(fù)氧環(huán)境會(huì)降低成骨細(xì)胞活性，增加細(xì)胞凋亡率，而且缺氧再復(fù)氧環(huán)境會(huì)加重缺氧狀態(tài)下成骨細(xì)胞損傷。

目前對于成骨細(xì)胞缺氧的機(jī)制及治療研究較多，萊菔硫烷在實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)具有抗氧化還原的作用，在骨折愈合及骨質(zhì)疏松的治療中有作用，但其對常氧下成骨細(xì)胞作用未見報(bào)道。

萊菔硫烷的抗氧化作用主要是通過Nrf2-ARE 信號通路發(fā)揮重要作用。Nrf2 核轉(zhuǎn)位并且結(jié)合核酸序列上的抗氧化反應(yīng)元件ARE，活化 Nrf2-ARE信號通路并啟動(dòng)下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶系等的轉(zhuǎn)錄，從而減輕活性氧和親電子物質(zhì)引起的細(xì)胞損傷，使細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)，維持機(jī)體氧化還原動(dòng)態(tài)平衡[9]。萊菔硫烷的最大特點(diǎn)是其由于中心碳的親電性而引起化學(xué)反應(yīng)性的異硫氰酸酯基團(tuán)，異硫氰酸酯基團(tuán)與含硫、氮和氧的親核試劑容易發(fā)生反應(yīng)[10]。細(xì)胞中最常見的是異硫氰酸鹽與蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基和谷胱甘酸結(jié)合的可逆反應(yīng)[11]，它可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，細(xì)胞核隨后與抗氧化劑反應(yīng)元件結(jié)合，導(dǎo)致抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，包括血紅素加氧酶1，NAD(P)H醌氧化還原酶1，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和谷氨酸半胱氨酸連接酶[12]。萊菔硫烷是Ntf2途徑的有效激活劑，可以調(diào)節(jié)許多抗氧化酶，防止氧化損傷。

線粒體是有氧細(xì)胞體內(nèi)的能量發(fā)生器，為細(xì)胞提供大部分的ATP。當(dāng)ATP充足時(shí)，體內(nèi)需求/產(chǎn)生與電子傳遞鏈的最佳能力相結(jié)合。當(dāng)體內(nèi)處于低氧或者受到外部條件刺激時(shí)(比如氧化應(yīng)激狀態(tài))，需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生一系列活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，包括：過氧化氫(H2O2)、氧自由基(02-)、羥自由基(0H-)等[14]。ROS產(chǎn)生增加，糖酵解和ROS形成之間存在正反饋[13]，消耗大量的ATP[15]。在生理?xiàng)l件下，ROS形成和抗氧化系統(tǒng)消除之間有一個(gè)平衡[16]，常氧培養(yǎng)下成骨細(xì)胞內(nèi)的活性氧隨時(shí)間變化不大，細(xì)胞凋亡比例也少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在常氧培養(yǎng)條件下，不同濃度的萊菔硫烷均有降低體內(nèi)活性氧，減少細(xì)胞凋亡的作用。但筆者認(rèn)為在常氧條件下培養(yǎng)的成骨細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧對機(jī)體影響并不大，常氧下萊菔硫烷的抗氧化還原臨床意義不大。

在細(xì)胞增殖方面，SFN濃度為5 μmol/L、10 μmol/L 時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，但當(dāng)濃度提升到20 μmol/L，細(xì)胞增殖曲線趨于平緩甚至有所下降?？紤]其原因，可能此時(shí)萊菔硫烷的應(yīng)用改變了線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，影響了成骨細(xì)胞的活性。大量文獻(xiàn)報(bào)道，萊菔硫烷通過參與線粒體復(fù)合物氧化損傷、細(xì)胞凋亡的線粒體途徑、線粒體膜電位改變、線粒體生物合成以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體紊亂等途徑調(diào)控線粒體代謝。Sohel 等[17]在不同濃度的SFN誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞(GC)中的抗氧化和凋亡作用的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)SFN 濃度為2 μmol/L 和10 μmol/L 時(shí)沒有觀察到線粒體活性的變化；然而，在高濃度(20 μmol/L)下顯著降低了線粒體的活性。低濃度的SFN激活與細(xì)胞存活途徑相關(guān)的基因，而高濃度誘導(dǎo)參與抗增殖和凋亡途徑的基因的表達(dá)。Zanichelli等[18]證明低濃度的SFN(0.25～5 μmol/L)促進(jìn)了人類間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖并保護(hù)它們免于細(xì)胞凋亡和衰老，而較高濃度(20 μmol/L)具有細(xì)胞毒性作用，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期停滯，程序性細(xì)胞死亡和衰老。

因此，SFN是否在不同的細(xì)胞生存條件下發(fā)揮不同的藥物作用，還是直接與細(xì)胞結(jié)合，發(fā)生代謝調(diào)控作用，這些都是未來進(jìn)一步研究的熱點(diǎn)，也將為臨床在常氧條件下是否需要使用抗氧化劑及抗氧化劑使用劑量等提供參考。

4 結(jié)論

在常氧培養(yǎng)條件下，低濃度的萊菔硫烷可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，濃度升高反而會(huì)抑制細(xì)胞增殖；萊菔硫烷對成骨細(xì)胞可以起到抗氧化作用。