融合蛋白G3G6和HST1致敏DC疫苗抗黑色素瘤的藥效學(xué)研究

王 睿，王永梅，蔡銘君，柯學(xué)佳，吳 越，崇 軍，曹榮月**

(1中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 211198；2上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司，上海 200444)

惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是一種起源于神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞并由異常黑色素細(xì)胞過(guò)度增生引發(fā)的高度惡性腫瘤[1]，主要見(jiàn)于皮膚，發(fā)病率約占所有惡性腫瘤的1%～3%。因MM對(duì)放療及化療的敏感性差，臨床治療難度大，有效率低，尋求各種治療方法以延長(zhǎng)MM患者的生存期是治療的關(guān)鍵[2]。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，以調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫功能來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療，已被廣泛研究和應(yīng)用于臨床并取得了一定療效，成為繼手術(shù)、放療和化療之后的又一重要的治療手段[3]。

樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是目前發(fā)現(xiàn)功能最強(qiáng)，能激活初始T細(xì)胞的專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞，可以誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)和維持CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)[4-6]。以DC為基礎(chǔ)的免疫療法已被應(yīng)用于惡性腫瘤(如黑色素瘤)的治療[7]。然而，DC的主要功能不是消除病原體，而是在其表面上呈遞其抗原，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)病原體的特異性免疫應(yīng)答[8]。因此，選取合適腫瘤抗原刺激DC，是DC疫苗發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵。

促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)及其受體在多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，作為重要介質(zhì)和其他生物因子一起構(gòu)成復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，可通過(guò)對(duì)性腺軸內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、對(duì)細(xì)胞的自分泌調(diào)節(jié)發(fā)揮腫瘤抑制作用[9]。而胃泌素釋放肽(gastrin releasing peptide，GRP)是一種含有27個(gè)氨基酸的胃腸道神經(jīng)激素。研究證實(shí)GRP與許多惡性腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)，并可以刺激腫瘤的生長(zhǎng)，通過(guò)自分泌或旁分泌途徑參與腫瘤新生血管形成并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[10]。

在許多腫瘤患者體內(nèi)，多因腫瘤抗原無(wú)法識(shí)別或T細(xì)胞無(wú)法活化而發(fā)生免疫逃逸[11]。為避免該現(xiàn)象，選用GnRH與GRP偶聯(lián)的融合蛋白制得雙靶點(diǎn)DC疫苗來(lái)探究其對(duì)黑色素瘤的抑制效果。

相比正常組織，六跨膜前列腺上皮抗原(six transmembrane epithelial antigens of prostate 1，STEAP1)在多種腫瘤類(lèi)型中過(guò)度表達(dá)，包括黑色素瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌和尤文肉瘤[12-17]，可認(rèn)為STEAP1是一個(gè)理想的抗腫瘤疫苗靶點(diǎn)。而研究表明，當(dāng)STEAP1應(yīng)用為單靶點(diǎn)DNA疫苗進(jìn)入體內(nèi)時(shí)，其免疫原性較差[18]。近年來(lái)，已開(kāi)發(fā)出各種免疫佐劑以避免強(qiáng)不良反應(yīng)，載體蛋白如分枝桿菌熱休克蛋65(HSP65)具有這種佐劑特性。研究表明，HSP65抗原不僅可以上調(diào)細(xì)胞免疫反應(yīng)[19]，還可以顯著提高負(fù)荷抗原的免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)[20-21]。因此，本研究選用STEAP1為另一致敏DC抗原，并將其與HSP65偶聯(lián)以增強(qiáng)免疫原性。

1 材 料

1.1 菌種和質(zhì)粒

菌種EscherichiacoliBL21(DE3),pET28a-GnRH3-hinge-MVP-GRP6,pET-28a-His-HSP65-STEAP1186-193質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 動(dòng)物和細(xì)胞株

C57BL/6J雄性小鼠(6周齡，揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK(蘇)2017-0007)；黑色素瘤B16F10細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 融合蛋白的制備

對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存含有目的基因的工程菌pET28a-GnRH3-hinge-MVP-GRP6和pET-28a-His-HSP65-STEAP1186-193進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)蛋白分離提取并純化，真空冷凍干燥后得到融合蛋白GnRH3-GRP6(G3G6)和HSP65-STEAP1(HST1)凍干粉末。

2.2 B16F10黑色素瘤細(xì)胞的培養(yǎng)

從液氮中取出凍存的B16F10黑色素瘤細(xì)胞，37 ℃ 水浴解凍后加入RPMI 1640培養(yǎng)基10 mL混勻，離心棄上清液，加入全培養(yǎng)基重懸，37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，換液傳代培養(yǎng)。

2.3 DC疫苗的制備

脫頸處死小鼠，75%乙醇消毒5 min，無(wú)菌取出小鼠后腿的脛骨和股骨，剪斷兩端骨骺，用不完全培養(yǎng)基沖洗骨腔直至骨變白，將沖洗液離心棄上清液，重復(fù)洗滌沉淀1次，加入紅細(xì)胞裂解液10 mL混勻靜置(室溫、3 min)，離心除去紅細(xì)胞，重懸洗滌調(diào)整細(xì)胞數(shù)為每毫升5×106個(gè)，加入含有20 ng/mL rmGM-CSF，10 ng/mL rmIL-4的完全培養(yǎng)基，隔日半量換液，在第7天分組加入20 μg/mL已純化的G3G6以及HST1融合蛋白以致敏DC，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞的數(shù)量形態(tài)，離心后調(diào)整細(xì)胞數(shù)為每毫升1×106個(gè)，即得DC疫苗。

分組策略如下：(1)G3G6融合蛋白致敏DC(G3G6-DC)組；(2)HST1融合蛋白致敏DC(HST1-DC)組；(3)G3G6及HST1聯(lián)合致敏DC(GH-DC)組；(4)未致敏DC(US-DC)組，加入與融合蛋白等量完全培養(yǎng)基，作為陰性對(duì)照組。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC成熟度

收集未致敏DC和融合蛋白致敏的DC到檢測(cè)管中，離心后用PBS進(jìn)行洗滌，再次離心后用預(yù)冷的PBS 100 μL重懸，采用FITC抗小鼠CD11c，PE抗小鼠CD86和APC抗小鼠CD80標(biāo)記所有細(xì)胞樣品并設(shè)置對(duì)照組，冰浴避光染色30 min，離心用預(yù)冷的PBS 200 μL重懸，以未致敏DC組作為陰性對(duì)照進(jìn)行流式檢測(cè)。

2.5 體內(nèi)藥效為研究

2.5.1 B16F10黑色素瘤細(xì)胞的培養(yǎng)和皮下移植模型的建立 調(diào)整B16F10黑色素瘤細(xì)胞單細(xì)胞懸液密度為每毫升5×106個(gè)，與第0天接種于小鼠腋部皮下。

2.5.2 荷瘤小鼠的分組及免疫方法 將動(dòng)物隨機(jī)分為4組，每組5只，按照未致敏DC(US-DC)組，G3G6融合蛋白致敏DC(G3G6-DC)組，HST1融合蛋白致敏DC(HST1-DC)組和G3G6及HST1聯(lián)合致敏DC(GH-DC)組于第3、10、17天進(jìn)行免疫治療，于第8、12、16、20天對(duì)小鼠進(jìn)行稱(chēng)重，第21天處死小鼠取各組腫瘤、脾臟、胸腺稱(chēng)重，計(jì)算抑瘤率(IR)和臟器指數(shù)，留脾臟培養(yǎng)用于效靶比測(cè)定實(shí)驗(yàn)。給藥方式見(jiàn)表1。

IR=(對(duì)照組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重×100%

(1)

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體重(g)×100%

(2)

Table1 Dosing regimen of C57BL/6J (n=5)

GroupDosage (Per mouse)AdministrationUS-DC5×105 cellsiHG3G6-dc5×105 cellsiHHST1-DC5×105 cellsiHGH-DC5×105 cellsiH

US-DC:unsensitized DC;G3G6-DC:G3G6 fussion protein sensitized DC;HST1-DC:HST1 fusion protein sensitized DC;GH-DC:G3G6 and HST1 fusion protein sensitized DC

2.5.3 黑色素瘤塊病理分析 將剝?nèi)〉哪[瘤組織浸沒(méi)于10%福爾馬林溶液中固定24 h，送交第三方切片公司，HE染色檢驗(yàn)。

2.6 脾細(xì)胞的培養(yǎng)

剝?nèi)〉男∈笃⑴K稱(chēng)重后研磨過(guò)篩網(wǎng)(100目)，PBS洗滌重懸，加入等量的紅細(xì)胞裂解液，離心取沉淀，經(jīng)PBS洗滌后離心取沉淀，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為每毫升1×107個(gè)，加入完全培養(yǎng)基5 mL，37 ℃，5%CO2下按原分組進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)同時(shí)給細(xì)胞換液傳代。

2.7 最佳效靶比的確定

調(diào)整培養(yǎng)脾臟細(xì)胞數(shù)為每毫升2×106個(gè)，按每孔100 μL接種于96孔板中。以DC疫苗與細(xì)胞懸液分別作為效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，按1∶5，1∶10以及1∶15的比例加入靶細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞分組∶未致敏DC組，G3G6融合蛋白致敏DC組，HST1融合蛋白致敏DC組和聯(lián)合致敏DC組。培養(yǎng)48 h后按CCK-8檢測(cè)試劑盒測(cè)定吸收度并計(jì)算增殖指數(shù)(SI)。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)中采用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用方差檢驗(yàn)分析組間差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。整體實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。

Figure1 Experimental flow chart

3 結(jié) 果

3.1 DC細(xì)胞的培養(yǎng)與成熟分化

如圖2所示，在培養(yǎng)初期，DC細(xì)胞均呈圓形且直徑較小(圖2-A)。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，DC細(xì)胞直徑逐漸增大并且有堆疊生長(zhǎng)的趨勢(shì)(圖2-B)。培養(yǎng)第6天可觀察到部分DC細(xì)胞表面伸出偽足，融合蛋白致敏后則大部分DC細(xì)胞表現(xiàn)出樹(shù)突狀(圖2-D)，即成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的特征。

Figure2 Morphology of dendritic cells (DC) under microscope (200×)
A-D:DC training photos of the second day,the fourth day,the sixth day and the eighth day,respectively

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果用BD Accuri C6進(jìn)行分析，如圖3，所有細(xì)胞都處于CD11c陽(yáng)性范圍中。相同培養(yǎng)時(shí)間，未經(jīng)蛋白致敏的DC細(xì)胞中表達(dá)成熟信號(hào)分子的細(xì)胞占比3.2%，經(jīng)G3G6融合蛋白致敏成熟的細(xì)胞占比8.9%，經(jīng)HST1融合蛋白致敏的成熟細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志分子的強(qiáng)度則為7.6%，而經(jīng)G3G6和HST1兩融合蛋白聯(lián)合致敏的DC細(xì)胞成熟率高達(dá)15.6%。由此說(shuō)明，DC細(xì)胞在G3G6和HST1兩融合蛋白聯(lián)合刺激后能夠顯著上調(diào)CD11c，CD86和CD80的表達(dá)量(P<0.05)，而融合蛋白G3G6與HST1的致敏效果引起的表達(dá)上調(diào)之間并無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3.2 DC疫苗的體內(nèi)藥效探究

為探究融合蛋白致敏DC疫苗的抗腫瘤效果，本研究選擇在C57BL/6J雄性小鼠體內(nèi)構(gòu)建黑色素瘤模型進(jìn)行探究。在第0天將培養(yǎng)適當(dāng)?shù)腂16F10黑色素瘤細(xì)胞懸液接種于小鼠腋下，并在第3、10、17天分組向小鼠體內(nèi)注射融合蛋白致敏DC疫苗進(jìn)行治療。在第8、12、16、20天分別測(cè)定并計(jì)算各組小鼠負(fù)荷腫瘤面積和面積并繪制生長(zhǎng)曲線如圖4。由生長(zhǎng)曲線，各融合蛋白致敏DC組的腫瘤面積和腫瘤體積均小于注射未致敏DC組，可認(rèn)為各實(shí)驗(yàn)組均有抑瘤效果，其中聯(lián)合致敏組即GH-DC組抑瘤效果最佳。

US-DC:Unsensitized DC;G3G6-DC:GnRH-GRP fusion protein senditized DC；HST1-DC:HSP65-STEAP1 fusion protein sensitized DC;GH-DC:G3G6 and HST1 combined sensitized DC

腫瘤面積計(jì)算公式：

A=L×W

(3)

其中:A為腫瘤面積，L為長(zhǎng)度，W為寬度。

腫瘤體積計(jì)算公式：

V=L×W2/2

(4)

其中:V為腫瘤體積，L為長(zhǎng)度，W為寬度。

于第24天結(jié)束治療，處死小鼠并分組剝?nèi)ツ[瘤組織、脾臟和胸腺稱(chēng)重并拍照如圖5。由腫瘤組織照片，可觀察出各融合蛋白致敏DC組瘤塊均小于未致敏DC組。數(shù)據(jù)處理得：G3G6-DC組的抑瘤率為35.75%，HST1-DC組的抑瘤率為34.03%，而GH-DC的抑瘤率為55.74%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

由公式(2)得脾臟臟器指數(shù)和胸腺臟器指數(shù)。如圖6，相比未致敏組，各融合蛋白致敏DC組小鼠的脾臟和胸腺均有增大，其中聯(lián)合致敏組的增大最為顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由此可證明，融合蛋白致敏DC可有效激發(fā)小鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)，從而發(fā)揮抗腫瘤效果。

3.3 腫瘤組織切片分析

為進(jìn)一步研究融合蛋白致敏DC疫苗抑制腫瘤的藥效，光學(xué)顯微鏡觀察組織染色切片。如圖7顯示，US-DC組中少見(jiàn)腫瘤組織壞死，核固縮、核碎裂或溶解；可見(jiàn)病理性核分裂象，如黃色箭頭所示；多見(jiàn)腫瘤細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松或呈空泡化，如紅色箭頭所示；少量腫瘤細(xì)胞凋亡，如藍(lán)色箭頭所示；無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。G3G6-DC組可見(jiàn)較大面積組織細(xì)胞壞死，核固縮、核碎裂或溶解，并伴有大量出血，如黑色箭頭所示；部分腫瘤細(xì)胞凋亡，如藍(lán)色箭頭所示。HST1-DC組中腫瘤組織局部出血，細(xì)胞紅染，無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如黑色箭頭所示；多見(jiàn)腫瘤細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松或呈空泡化，如紅色箭頭所示；局部出現(xiàn)小型鈣化灶，如綠色箭頭所示；少量腫瘤細(xì)胞凋亡，如藍(lán)色箭頭所示。GH-DC組腫瘤組織較松散，一處被膜處大面積出血，局部少量出血；少量腫瘤組織壞死，核固縮、核碎裂或溶解如黑色箭頭所示；部分腫瘤細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松或呈空泡化，如紅色箭頭所示；少量腫瘤細(xì)胞凋亡，如藍(lán)色箭頭所示。由此可見(jiàn)，相比未致敏組，各融合蛋白致敏DC組均可誘導(dǎo)機(jī)體殺傷腫瘤細(xì)胞，其中GH-DC組即聯(lián)合致敏組效果優(yōu)于單一致敏組。

Figure7 Histopathology change of tumor tissues

3.4 最佳效靶比的確定

如圖8，CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明各實(shí)驗(yàn)組均可刺激T細(xì)胞的增殖，其中效靶比為1∶5和1∶10的增殖指數(shù)均高于1∶15，可認(rèn)為較高濃度的DC可以對(duì)刺激T淋巴細(xì)胞增殖產(chǎn)生更顯著的效果；與未致敏DC組相比，G3G6-HST1聯(lián)合致敏DC組可以形成較高的增殖效應(yīng)(P<0.01)，其增殖指數(shù)高于G3G6融合蛋白致敏DC組與HST1融合蛋白致敏DC組(P<0.05)。

4 討 論

免疫治療在提高腫瘤治療率、改善患者生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期方面起重要作用[8]。DC疫苗可以通過(guò)負(fù)荷腫瘤抗原回輸體內(nèi)對(duì)腫瘤進(jìn)行靶向治療[22]。本研究以黑色素瘤的免疫治療為主題，先后研究了單、雙靶點(diǎn)的蛋白疫苗和DC疫苗[23-29]，順延實(shí)驗(yàn)室研究思路，選取偶聯(lián)雙抗原的融合蛋白、偶聯(lián)免疫佐劑的抗原融合蛋白致敏DC疫苗，探究提高抗腫瘤藥效的途徑。

DC是目前認(rèn)為功能最強(qiáng)的專(zhuān)職APC，未成熟DC接觸抗原后可通過(guò)巨胞飲、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞及吞噬3種方式捕獲抗原，幼稚DC在攝取抗原后即可自發(fā)成熟[30]，而DC成熟之后傾向于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[31]，利用DC疫苗進(jìn)行治療的第一步應(yīng)考慮提高DC的成熟率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比陰性對(duì)照組，G3G6融合蛋白和HST1融合蛋白均具有足以提高DC的成熟率強(qiáng)度的免疫原性，大大增加了DC誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的潛力。其中兩種融合蛋白的免疫原性之間并無(wú)顯著差異(P>0.05)，聯(lián)用組效果顯著增強(qiáng)(P<0.01，vsUS-DC)則可歸因于免疫原性的疊加性。另有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，G3G6和HST1致敏DC疫苗均可有效激活免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞，且融合蛋白致敏DC抗腫瘤疫苗具備靶向性可達(dá)到精準(zhǔn)治療，推測(cè)原因?yàn)镚3G6-DC疫苗的雙抗原選擇有效避免了腫瘤的免疫逃逸；而HST1-DC疫苗則因免疫佐劑的偶聯(lián)，同樣提高了免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。后續(xù)將就融合蛋白致敏DC疫苗的作用機(jī)制展開(kāi)實(shí)驗(yàn)，確定免疫途徑進(jìn)一步完善治療策略。

為防止過(guò)度免疫而導(dǎo)致自身免疫紊亂等問(wèn)題的發(fā)生，本研究繼續(xù)探究了DC疫苗治療的最適效靶比，結(jié)果得當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞(即DC)與靶細(xì)胞(即脾細(xì)胞)的比例為1∶5時(shí)，細(xì)胞增殖效果最佳(P<0.01，vsUS-DC)。目前有報(bào)道，靶細(xì)胞對(duì)于DC的依賴并非線性關(guān)系[22,32]，可考慮進(jìn)一步細(xì)化探究效靶比，尋找DC疫苗的最低有效劑量，為后期臨床使用創(chuàng)造便利。

綜上所述，融合蛋白致敏DC疫苗G3G6-DC和HST1-DC均可增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫應(yīng)答，提高對(duì)黑色素瘤B16F10細(xì)胞小鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制，且聯(lián)合用藥效果優(yōu)于單獨(dú)用藥，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。