LncRNA CTD-3252C9.4抑制人胰腺癌Panc-1細(xì)胞體外侵襲遷移的機(jī)制

尹 馨，史婉月，潘 怡，金 亮

(中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 210009)

胰腺癌是一種常見(jiàn)的消化道腫瘤，由于缺乏早期癥狀和篩查手段，大多數(shù)患者在診斷出胰腺癌時(shí)已經(jīng)處于晚期[1]，胰腺癌患者的預(yù)后和臨床治療結(jié)果極差。盡管包括臨床手術(shù)、化療和放療在內(nèi)的治療手段有了長(zhǎng)足發(fā)展，但胰腺癌患者的5年總生存率仍然非常低(<5%)，造成胰腺癌具有死亡率高、生存期較短、預(yù)后效果極差的特征[2]。胰腺癌是一種極具侵襲性的實(shí)體瘤，常發(fā)生局部浸潤(rùn)和早期轉(zhuǎn)移[3]，而分子生物學(xué)的快速發(fā)展為胰腺癌的診治提供了新的研究方向。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類超過(guò)200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄物，不具有編碼蛋白質(zhì)的功能[4]。LncRNA可以通過(guò)空間結(jié)構(gòu)影響功能基因發(fā)揮作用，也可以在轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄過(guò)程中和轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮調(diào)控功能，主要包括順式調(diào)節(jié)相鄰基因的變化和反式調(diào)節(jié)遠(yuǎn)端基因的表達(dá)[5]。許多研究已經(jīng)闡釋了lncRNA在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中對(duì)腫瘤侵襲、遷移和增殖能力起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，如lncRNA HOTAIR通過(guò)抑制胰腺癌中原癌基因的活力發(fā)揮抑癌功能，lncRNA HOTTIP被證明能抑制胰腺癌侵襲遷移，lncRNA UCA1通過(guò)調(diào)控miR-96/FOXO3軸發(fā)揮抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的能力等[6-8]。

在實(shí)驗(yàn)室前期研究中，本課題組建立并優(yōu)化一種新型的三維半固體培養(yǎng)體系，能夠在體外成功誘導(dǎo)和培養(yǎng)胰腺癌干細(xì)胞樣微球體，該方法能有效的富集得到CD44+CD24+ESA+陽(yáng)性的Panc-1球體細(xì)胞，它比普通胰腺癌細(xì)胞具有更高的惡性程度。表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)是三維半固體培養(yǎng)體系的重要成分之一，它是一個(gè)含53個(gè)氨基酸的單鏈多肽，有研究發(fā)現(xiàn)EGF在胰腺癌等腫瘤的腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)，且在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[9-10]。本研究對(duì)微球體細(xì)胞進(jìn)行高通量測(cè)序，以考察可能具有調(diào)控干細(xì)胞特性的分子。其中，lncRNA CTD-3252C9.4是測(cè)序后發(fā)現(xiàn)在胰腺癌干細(xì)胞中顯著下調(diào)的lncRNA之一，它也被稱作LOC284454、ENST00000587762，它在胰腺癌中還未曾報(bào)道，因此本文將對(duì)lncRNA CTD-3252C9.4在胰腺癌中的表達(dá)和功能進(jìn)行研究，并探討其可能的作用機(jī)制，為胰腺癌的進(jìn)一步研究和治療提供參考依據(jù)。

1 材 料

1.1 試 劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、B27、N2(美國(guó)Gibco公司)；LipofectamineTM2000、Trizol試劑、ITS(美國(guó)Invitrogen公司)；EGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic-fibroblast growth factor，b-FGF)(美國(guó)PeproTech公司)；芐基磺酰氟(PMSF)、RIPA裂解溶液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、胰蛋白酶(上海碧云天生物公司)；兔抗人骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetix protein 7，BMP7)多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，兔抗人E-cadherin單克隆抗體、兔抗人Twist多克隆抗體、兔抗人Slug單克隆抗體(美國(guó)CST公司)；GAPDH單克隆抗體(美國(guó)Santa公司)；LncRNA Smart Silencer(廣州銳博生物科技公司)；All-in-one逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR試劑盒(鎮(zhèn)江愛(ài)必夢(mèng)生物公司)。

1.2 儀 器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Roche公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)；顯微圖象采集系統(tǒng)(日本Olympus公司)；Western blot電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 細(xì) 胞

人胰腺癌細(xì)胞系Panc-1、MIApaca-2、Bxpc-3和正常胰腺細(xì)胞系HPDE，購(gòu)自上海生命科學(xué)院細(xì)胞所。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

胰腺癌細(xì)胞Panc-1于含10%FBS和1%青霉素鏈霉素溶液的DMEM高糖完全培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)，常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2/95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞密度為80%～90%時(shí)，用PBS清洗一遍，再用胰酶細(xì)胞消化液進(jìn)行消化1 min，按照1∶2比例傳代。在6孔板中加入細(xì)胞懸液，每孔2×105個(gè)的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 三維半固體培養(yǎng)Panc-1成球細(xì)胞

配制三維半固體培養(yǎng)體系:DMEM/F12培養(yǎng)基26 mL中加入血清260 μL并添加2% B27，1% ITS，1% N2，0.1% 20 μg/mL EGF溶液，0.1% 20 μg/mL b-FGF溶液和0.1%青霉素鏈霉素溶液，加入Panc-1細(xì)胞懸液，之后再將3.3%甲基纖維素溶液6 mL加入并搖晃混勻，將細(xì)胞與黏稠的半固體培養(yǎng)基按每孔1 mL的量加入到24孔低黏附板中培養(yǎng)。培養(yǎng)11 d后可見(jiàn)較大球形細(xì)胞微球體，將微球體細(xì)胞收集于離心管中，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 EGF刺激胰腺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

待6孔板中細(xì)胞密度長(zhǎng)到70%匯合度時(shí)，將完全培養(yǎng)基換成不含雙抗和血清的培養(yǎng)基，“饑餓”24 h后，分別使用含有EGF或不含EGF的培養(yǎng)成分刺激胰腺癌細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞備用。

2.4 RNA的提取和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

用Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，然后檢測(cè)其中l(wèi)ncRNA CTD-3252C9.4的mRNA水平的表達(dá)，RT-qPCR反應(yīng)數(shù)據(jù)以循環(huán)閾值(Ct)記錄，實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算，用GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照(lncRNA CTD-3252C9.4和GAPDH引物序列見(jiàn)表1)。

Table1 Primers used for qRT-PCR of lncRNA CTD-3252C9.4 and GAPDH genes

2.5 質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

LncRNA CTD-3252C9.4全長(zhǎng)1774 bp，定位于細(xì)胞核。構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體時(shí)，使用PCR將lncRNA CTD-3252C9.4片段克隆進(jìn)以XhoⅠ和BamH Ⅰ為酶切位點(diǎn)的pcDNA3.1(+)真核生物表達(dá)質(zhì)粒(PCR引物見(jiàn)表2)，命名pcDNA-CTD-3252C9.4，其空載對(duì)照命名pcDNA-control。使用小干擾RNA(LncRNA Smart Silencer)敲降lncRNA CTD-3252C9.4的表達(dá)，命名si-CTD-3252C9.4，其對(duì)照命名si-control，使用ddH2O溶解小干擾RNA干粉至終濃度為20 μmol/L的工作液。取“2.1”項(xiàng)中所述培養(yǎng)于6孔板的細(xì)胞，根據(jù)LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明書操作轉(zhuǎn)染，在無(wú)血清培養(yǎng)6 h后將上清液換為DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Table2 Primers used for PCR of lncRNA CTD-3252C9.4

Primer Sequence (5' to 3')LncRNA CTD-3252C9.4-FCGCGGATCCGGGGTCAAGCCCCCTTGGALncRNA CTD-3252C9.4-RCCGCTCGAGTGAAGTCAGGGCAACTTTTATTTAC

2.6 劃痕-愈合實(shí)驗(yàn)

將種植于6孔板中的細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，細(xì)胞長(zhǎng)滿單細(xì)胞層。使用10 μL槍頭在細(xì)胞層中垂直作十字劃痕處理，分別于0，48 h時(shí)在顯微鏡下觀察劃痕位置細(xì)胞遷移情況并拍照，每組設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，并按照以公式(1)計(jì)算細(xì)胞遷移率。

(1)

2.7 Transwell小室法實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，消化并離心，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基吹打混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞的濃度為每毫升5×105個(gè)細(xì)胞，在Transwell小室的下室加入含5% FBS的DMEM培養(yǎng)基800 μL，在上室加入混勻的細(xì)胞懸液200 μL。侵襲實(shí)驗(yàn)中，在實(shí)驗(yàn)前4 h在冰上操作加入Matrigel膠稀釋液，每孔50 μL，并于37 ℃培養(yǎng)箱靜置備用。細(xì)胞在培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，用PBS小心清洗，在4%多聚甲醛固定30 min后，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，將小室在PBS中清洗后，用棉簽小心擦去膜上層細(xì)胞，用顯微鏡觀察并拍照，隨機(jī)選取3個(gè)視野計(jì)算細(xì)胞穿膜數(shù)。

2.8 Western blot檢測(cè)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，使用RIPA(加1% PMSF)裂解液收提取細(xì)胞蛋白，加入變性上樣緩沖液，于100 ℃煮沸10 min。按照每孔蛋白上樣量30 μg，使用濃度為10%的SDS-PAGE分離不同的蛋白質(zhì)，再使用半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，使用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h；TBST清洗3次后，再按照條帶加入1∶1 000稀釋的的兔抗人BMP7抗體、E-cadherin抗體、Twist抗體、Slug抗體及GAPDH抗體，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，次日吸出抗體，以TBST洗滌3次，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，使用ECL顯色系統(tǒng)定影顯色，以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié) 果

3.1 LncRNA CTD-3252C9.4在胰腺癌細(xì)胞中低表達(dá)

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在胰腺癌干細(xì)胞中存在35個(gè)顯著變化的lncRNA，其中l(wèi)ncRNA CTD-3252C9.4顯著降低至40%[11]。為了驗(yàn)證該結(jié)果，本研究使用三維半固體培養(yǎng)體系進(jìn)行Panc-1干樣細(xì)胞微球體的培養(yǎng)，并提取RNA進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果如圖1-A所示，與普通Panc-1細(xì)胞相比，lncRNA CTD-3252C9.4在Panc-1成球細(xì)胞中的表達(dá)降低至11%，具有顯著差異。此外，本研究檢測(cè)了lncRNA CTD-3252C9.4在3種不同的胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)量高低，根據(jù)惡性程度的強(qiáng)度大小依次為Panc-1，MIApaca-2和Bxpc-3，RT-qPCR的結(jié)果顯示(圖1-B)，以正常胰腺細(xì)胞HPDE為對(duì)照，lncRNA CTD-3252C9.4在惡性程度最高的Panc-1中其表達(dá)量最低，其表達(dá)量與細(xì)胞系惡性程度成負(fù)相關(guān)。因此結(jié)果提示，lncRNA CTD-3252C9.4可能參與胰腺癌的發(fā)展過(guò)程，本研究選擇Panc-1細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

3.2 EGF能特異調(diào)控lncRNA CTD-3252C9.4在Panc-1細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)

在胰腺癌干細(xì)胞微球體培養(yǎng)中，本研究添加了多種成分對(duì)Panc-1細(xì)胞進(jìn)行干性誘導(dǎo)和維持。有文獻(xiàn)指出，表皮生長(zhǎng)因子EGF對(duì)胰腺癌的生長(zhǎng)浸潤(rùn)功能具有重要作用[12]，因此猜想是否培養(yǎng)體系中的EGF能夠調(diào)控lncRNA CTD-3252C9.4的表達(dá)。本研究設(shè)置了使用普通DMEM培養(yǎng)的陰性對(duì)照組、含全部刺激成分的陽(yáng)性對(duì)照組、僅不含EGF的EGF(-)組和僅含0.1% EGF的EGF(+)組，將各成分加入到Panc-1細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)48 h后，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)lncRNA CTD-3252C9.4的mRNA水平。結(jié)果顯示，比于陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照組中l(wèi)ncRNA CTD-3252C9.4的表達(dá)量相組發(fā)生顯著下調(diào)，EGF(-)組的表達(dá)量沒(méi)有發(fā)生改變，而EGF(+)組的lncRNA CTD-3252C9.4發(fā)生顯著下調(diào)。

3.3 LncRNA CTD-3252C9.4抑制Panc-1細(xì)胞侵襲和遷移

首先構(gòu)建過(guò)表達(dá)和敲降載體，并檢驗(yàn)其轉(zhuǎn)染表達(dá)量分別為過(guò)表達(dá)上調(diào)約400倍、敲降下調(diào)至43%，具有顯著性差異(圖3-A)。劃痕-愈合實(shí)驗(yàn)證明，與對(duì)照組相比，在Panc-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)lncRNA CTD-3252C9.4后，細(xì)胞劃痕的間隙變化水平顯著降低，相反，敲降之后細(xì)胞劃痕間隙變化水平顯著增高(圖3-B)。此外，Transwell小室結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)lncRNA-CTD-3252C9.4的細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)量顯著減少，而敲降lncRNA CTD-3252C9.4后，侵襲和遷移數(shù)量顯著增高(圖3-C)，表明該lncRNA具有抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。

3.4 預(yù)測(cè)靶基因BMP7及驗(yàn)證

高通量測(cè)序結(jié)果顯示lncRNA CTD-3252C9.4有4個(gè)潛在的靶點(diǎn)，且預(yù)測(cè)它們均為lncRNA CTD-3252C9.4的反式調(diào)控基因，分別是AP1S3、PQLC2、ZBED1和BMP7(圖4-A)。因此，本研究檢測(cè)了過(guò)表達(dá)lncRNA CTD-3252C9.4后，Panc-1細(xì)胞中4個(gè)靶基因的mRNA表達(dá)量，結(jié)果如圖4-B所示，AP1S3、PQLC2、ZBED1的mRNA水平未發(fā)生顯著變化，而B(niǎo)MP7的含量顯著降低。通過(guò)分別過(guò)表達(dá)和敲降lncRNA CTD-3252C9.4的表達(dá)，證明lncRNA CTD-3252C9.4對(duì)BMP7的mRNA水平(圖4-C)和蛋白水平(圖4-D)均發(fā)揮負(fù)向調(diào)控的作用，說(shuō)明BMP7是lncRNA CTD-3252C9.4的靶基因。此外，本研究通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn)分析發(fā)現(xiàn)(圖4-E)，BMP7在胰腺癌組織中高表達(dá)，表示其可能具有促癌功能。

3.5 LncRNA CTD-3252C9.4影響B(tài)MP7調(diào)控的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程

骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetix protein 7，BMP7)具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲遷移能力的作用，并能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Twist和Slug的表達(dá)，從而影響上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的過(guò)程[13]。本研究構(gòu)建了BMP7的過(guò)表達(dá)和敲降載體(方法同2.5)，將其轉(zhuǎn)染至Panc-1細(xì)胞中，驗(yàn)證其能否影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，且能否通過(guò)影響lncNRA CTD-3252C9.4將其功能回復(fù)。結(jié)果如圖5-A所示，劃痕-愈合實(shí)驗(yàn)證明過(guò)表達(dá)BMP7后細(xì)胞遷移的比例增加，且能夠反轉(zhuǎn)由于過(guò)表達(dá)lncRNA CTD-3252C9.4后造成的細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力降低的效果。此外，敲降實(shí)驗(yàn)及其回復(fù)實(shí)驗(yàn)也顯示證明了以上結(jié)果。

隨后，本研究利用Western blot法檢測(cè)了轉(zhuǎn)染BMP7和lncRNA CTD-3252C9.4后，Panc-1細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志物Twist、Slug 3個(gè)EMT 相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果如圖5-B顯示，過(guò)表達(dá)lncRNA CTD-3252C9.4能夠促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)，抑制Twist和Slug的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)BMP7可以使E-cadherin的表達(dá)減少，Twist和Slug蛋白表達(dá)增多，同時(shí)回復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示BMP7能夠反轉(zhuǎn)lncRNA CTD-3252C9.4對(duì)蛋白的影響。此外，敲降實(shí)驗(yàn)及其回復(fù)實(shí)驗(yàn)也顯示證明了以上結(jié)果。這表明lncRNA CTD-3252C9.4能夠抑制BMP7調(diào)控的EMT過(guò)程。

4 討 論

目前，隨著對(duì)腫瘤的深入研究，腫瘤干細(xì)胞逐漸被發(fā)現(xiàn)具有重要研究?jī)r(jià)值。胰腺癌干細(xì)胞是被認(rèn)為是具有自我更新、多向分化和高致癌性的多潛能細(xì)胞[14-15]，它的惡性程度要遠(yuǎn)高于普通的胰腺癌細(xì)胞。為了尋找與胰腺癌發(fā)生相關(guān)的變化因子，前期本課題組使用三維半固體培養(yǎng)體系，培養(yǎng)出具有干性特性的胰腺癌干細(xì)胞微球體，并將其進(jìn)行了高通量測(cè)序，在測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的明顯差異表達(dá)并且可能與干性維持及腫瘤惡性程度相關(guān)的分子，越來(lái)越多證據(jù)表示lncRNA在腫瘤發(fā)生相關(guān)發(fā)展中發(fā)揮重要作用，因此本研究對(duì)其中明顯下調(diào)的lncRNA CTD-3252C9.4進(jìn)行了研究。腫瘤的侵襲和遷移是大多數(shù)胰腺癌患者死亡的原因，表皮生長(zhǎng)因子是實(shí)驗(yàn)室前期用作三維半固體培養(yǎng)體系的重要成分之一，EGF是一種作用廣泛的生長(zhǎng)因子，能夠在多種細(xì)胞和組織中發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)分裂、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝周期、刺激組織再生與修復(fù)等作用[16]，此外EGF在腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和血管生成等功能[17-18]。因此為了探究EGF對(duì)lncRNA CTD-3252C9.4是否存在調(diào)控作用，本研究設(shè)計(jì)了4種不同成分的培養(yǎng)基對(duì)Panc-1細(xì)胞進(jìn)行刺激培養(yǎng)，結(jié)果表明，相比于普通培養(yǎng)環(huán)境，添加了EGF的培養(yǎng)基能夠使Panc-1中的lncRNA CTD-3252C9.4含量顯著降低，因此本研究推測(cè)，EGF是誘導(dǎo)lncRNA CTD-3252C9.4下調(diào)的主要因素之一。

研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在不同的腫瘤類型中有獨(dú)特的表達(dá)，其表達(dá)的變化是影響腫瘤等疾病的重要影響因素[19]。LncRNA CTD-3252C9.4是一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA，定位在細(xì)胞核內(nèi)，且已被證明無(wú)編碼能力，它在乳腺癌、前列腺癌、子宮癌和腎癌中具有抑癌作用，但其作用機(jī)制尚不明確[20]。在NCBI中l(wèi)ncRNA CTD-3252C9.4的Gene Accession為NR_036515.2，根據(jù)hg38基因組注釋，它定位于chr19:13945330-13947473。為進(jìn)一步揭示lncRNA CTD-3252C9.4的可能作用機(jī)制，本研究構(gòu)建了過(guò)表達(dá)和敲降載體，并轉(zhuǎn)染到胰腺癌細(xì)胞Panc-1中進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于其對(duì)照組，過(guò)表達(dá)和敲降lncRNA CTD-3252C9.4后能夠分別顯著抑制和促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移能力，說(shuō)明lncRNA CTD-3252C9.4具有能夠參與胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程的能力。

為進(jìn)一步研究lncRNA CTD-3252C9.4的作用機(jī)制，本研究尋找了其可能作用的靶點(diǎn)。在測(cè)序結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了BMP7是其下游的潛在反式調(diào)控基因。據(jù)報(bào)道，某些lncRNA可以直接結(jié)合染色體中鄰近位置的DNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)，發(fā)揮順式調(diào)控作用[21]，而一些lncRNA也可以與遠(yuǎn)端蛋白(通常是轉(zhuǎn)錄因子)結(jié)合，形成DNA-蛋白復(fù)合物，從而調(diào)控下游分子的轉(zhuǎn)錄，也稱為反式調(diào)控[22]。BMP7是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族的成員之一，位于20號(hào)染色體，其主要功能是參與骨骼的發(fā)育和誘導(dǎo)異位骨的形成，且被廣泛報(bào)道與腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程密切相關(guān)，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲的遷移的能力[23-24]。BMP7刺激激活TGF-β，調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞周期途徑，在經(jīng)典的BMPs/Smad信號(hào)通路中，BMPs配體與BMPs受體結(jié)合，從而導(dǎo)致Smad 1/5/8磷酸化，聚合Smad 4，進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)下游靶基因[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌細(xì)胞Panc-1中過(guò)表達(dá)lncRNA CTD-3252C9.4能夠顯著抑制BMP7的mRNA和蛋白水平，然而敲降lncRNA CTD-3252C9.4后，BMP7的表達(dá)量增加，表明BMP7受到lncRNA的負(fù)向調(diào)控作用。在BMP7功能實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移能力，并且逆轉(zhuǎn)lncRNA CTD-3252C9.4造成的抑制效果，達(dá)到回復(fù)的目的。此外，通過(guò)Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白的變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)BMP7能夠促進(jìn)EMT的過(guò)程，而lncRNA CTD-3252C9.4發(fā)揮相反的作用，回復(fù)實(shí)驗(yàn)?zāi)苁蛊浔磉_(dá)水平改變。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明lncRNA CTD-3252C9.4可能通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平上抑制BMP7的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)BMP7所調(diào)控的通路，發(fā)揮抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的能力。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)EGF作為腫瘤微環(huán)境中豐富表達(dá)的促腫瘤細(xì)胞因子，可以抑制胰腺癌細(xì)胞Panc-1中的lncRNA CTD-3252C9.4表達(dá)，并且證明了lncRNA CTD-3252C9.4具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的能力。在機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)促癌基因BMP7是其潛在的作用靶點(diǎn)，且lncRNA CTD-3252C9.4能夠通過(guò)BMP7參與到調(diào)控腫瘤EMT的過(guò)程。LncRNA CTD-3252C9.4作為胰腺癌中一個(gè)新的具有調(diào)控功能的lncRNA，將為胰腺癌的診斷和治療提供新的研究參考依據(jù)。