1，25-（OH）2-D3對腦梗死大鼠神經(jīng)功能、腦組織內(nèi)細(xì)胞凋亡及Wnt/β-catenin通路的調(diào)節(jié)作用

楊國防，劉向哲，王彥華，王新志，彭珂

（1．河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病一區(qū)，河南鄭州450000；2．河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州450000）

腦梗死是臨床上常見的腦血管疾病，顱內(nèi)動脈的閉塞會引起腦組織發(fā)生不可逆的缺血缺氧性損害[1]。近年來溶栓治療、介入治療等再灌注治療手段發(fā)展迅速，雖然腦梗死發(fā)生后盡早進(jìn)行再灌注治療能夠有效恢復(fù)缺血腦組織的血供，但神經(jīng)細(xì)胞對缺血缺氧的耐受性差，再灌注治療時已經(jīng)發(fā)生了不同程度的缺血缺氧損害，容易在治療后遺留神經(jīng)功能缺損[2]。1，25-（OH）2-D3是體內(nèi)維生素D的活性形式，由維生素D經(jīng)兩次羥基化反應(yīng)合成，不僅參與鈣磷代謝的調(diào)控，還被證實能夠在多種組織和細(xì)胞中通過抗炎、抗凋亡等途徑發(fā)揮保護作用[3]。Wnt/β-catenin通路是細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮促增殖、抗凋亡作用的信號通路，研究證實激活該通路能夠減輕大腦的缺血缺氧損傷及缺血再灌注損傷[4]。為了明確1，25-（OH）2-D3在腦梗死過程中的神經(jīng)保護作用及分子機制，本研究具體分析了1，25-（OH）2-D3對腦梗死大鼠神經(jīng)功能、腦組織內(nèi)細(xì)胞凋亡及Wnt/β-catenin通路的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

SPF級別的成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量240～280g，購自廣東省實驗動物中心，合格證號SCXK（豫）2019-0035。1,25-（OH）2-D3購自Sigma公司，TUNEL染色試劑盒購自上海碧云天公司，Bcl-2、Bax、β-catenin的單克隆抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥方法 SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、腦梗死組、干預(yù)組，腦梗死組、干預(yù)組采用線栓法建立腦梗死大鼠模型：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后擺放仰臥位，做頸正中切口后分離左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，用縫線結(jié)扎頸外動脈并離斷，用動脈夾暫時夾閉頸總動脈，在頸外動脈末端處剪一小口，將線栓伸入至大腦中動脈，深度約1.8～2.0 cm，遇到阻力后停止并固定線栓，縫合切口完成造模。假手術(shù)組僅進(jìn)行腹腔麻醉及分離左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈的操作。干預(yù)組在造模前8天每天給予1.0 μg/kg的1，25-（OH）2-D3腹腔注射，同時在造模后即刻給予 1.0 μg/kg的1，25-（OH）2-D3腹腔注射。

1.2.2 神經(jīng)功能評估 建模成功后24小時，按照5分法評估各組大鼠神經(jīng)功能：無神經(jīng)損害癥狀為0分，對側(cè)前爪不能完全伸展為1分，行走時向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)為2分，行走時向?qū)?cè)傾倒為3分，不能自發(fā)行走或意識喪失為4分。

1.2.3 腦梗死體積測定 完成神經(jīng)功能評估后，各組隨機取6只大鼠用于腦梗死體積的測定，解剖腦組織后在腦磨具中切為厚度2 mm的腦片，用2%四唑紅（TTC）溶液染色30分鐘后拍照記錄，紅色染色部分為正常腦組織、白色染色部分為腦梗死組織，以腦梗死組織體積/（腦梗死組織體積+正常腦組織體積）的比值作為腦梗死體積。

1.2.4 TUNEL染色 完成神經(jīng)功能評估后，各組隨機取6只大鼠，處死后解剖得到梗死部位的腦組織，一半用于多聚甲醛固定后制作切片，用TUNEL試劑盒進(jìn)行染色后在顯微鏡下觀察，隨機計數(shù)5個高倍視野下TUNEL陽性染色細(xì)胞所占比例。

1.2.5 基因表達(dá)的Western blot測定 取用于TUNEL染色后剩余的另一半腦組織，加入蛋白裂解液提取總蛋白后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠的點樣槽內(nèi)加入蛋白樣本，垂直電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將蛋白樣本從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜，NC膜放置在5%脫脂牛奶封閉2小時，而后在4℃孵育1:1 000稀釋的Bax、Bcl-2、Caspase-3、β-catenin、GSK-3β及β-actin的抗體過夜，第二天取出用TBST緩沖液洗滌三遍后孵育第二抗體1小時，再用TBST緩沖液洗滌三遍后加入顯影液，在顯影系統(tǒng)內(nèi)顯影得到蛋白條帶，用Image-J軟件掃描蛋白條帶灰度值，計算 Bax/β-actin、Bcl-2/β-actin、Caspase-3/β-actin、β-catenin/β-actin、GSK-3β/β-actin 的比值作為 Bax、Bcl-2、Caspase-3、β-catenin、GSK-3β 的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能評分及腦梗死體積比較

腦梗死組大鼠的神經(jīng)功能評分明顯高于假手術(shù)組及干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組大鼠的腦梗死體積明顯低于腦梗死組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組間腦組織中β-catenin、GSK-3β表達(dá)量的比較

2.2 各組腦組織TUNEL陽性率比較

TUNEL染色檢測腦組織中的細(xì)胞凋亡，染色圖如圖1所示。計數(shù)各組大鼠腦組織中TUNEL陽性染色細(xì)胞所占比例，腦梗死組大鼠腦組織的TUNEL陽性率明顯高于假手術(shù)組及干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

圖1 各組大鼠腦組織的TUNEL染色圖

表2 各組腦組織中TUNEL陽性率比較

2.3 各組腦組織中凋亡基因表達(dá)比較

Western blot檢測腦組織中凋亡基因Bax、Bcl-2、Caspase-3的蛋白表達(dá)，蛋白電泳圖如圖2所示。計算各組大鼠腦組織中凋亡基因的表達(dá)量，腦梗死組大鼠腦組織中Bax及Caspase-3的表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組及干預(yù)組，Bcl-2的表達(dá)量明顯低于假手術(shù)組及干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3

圖2 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3的蛋白電泳圖

表3 各組腦組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)量的比較

2.4 各組間腦組織中β-catenin、GSK-3β表達(dá)的比較

Western blot檢測腦組織中凋亡基因β-catenin、GSK-3β的蛋白表達(dá)，蛋白電泳圖如圖3所示。計算各組大鼠腦組織中凋亡基因的表達(dá)量，如表4所示，腦梗死組大鼠腦組織中β-catenin的表達(dá)量均明顯低于假手術(shù)組、GSK-3β的表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組，干預(yù)組大鼠腦組織中β-catenin的表達(dá)量均明顯高于腦梗死組、GSK-3β的表達(dá)量明顯低于腦梗死組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠腦組織中β-catenin、GSK-3β的蛋白電泳圖

表4 各組腦組織中β-catenin、GSK-3β表達(dá)量比較

3 討論

腦梗死是具有較高致殘率和致死率的腦血管疾病[5]。近年來隨著糖尿病、高血壓等代謝性疾病發(fā)生的增多，腦梗死的發(fā)病率也呈逐年升高趨勢，針對腦梗死的治療也取得了長足進(jìn)步，靜脈溶栓及介入取栓等治療手段能夠使缺血腦組織及時獲得血流再灌注[6]。盡管如此，腦組織中神經(jīng)細(xì)胞對缺血缺氧的耐受能力較差，在接受再灌注治療時已經(jīng)發(fā)生了不可逆損害，治療后遺留神經(jīng)功能缺失[7]。此外，再灌注治療對時間窗的要求嚴(yán)格，大多數(shù)錯過再灌注治療時間窗的腦梗死患者會遺留更為嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損[8]。因此，如何在腦梗死發(fā)生后有效的保護神經(jīng)功能是臨床研究的熱點。

1，25-（OH）2-D3是維生素D的活性形式，由維生素D經(jīng)過連續(xù)兩次羥基化反應(yīng)生成，具有調(diào)節(jié)鈣磷代謝、增加血漿中鈣磷水平以滿足骨代謝需求的作用[9]。近年來相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)1，25-（OH）2-D3具有除調(diào)節(jié)鈣磷代謝外的其他多種生物學(xué)活性，其中由1，25-（OH）2-D3介導(dǎo)的細(xì)胞保護作用受到越來越多的關(guān)注。心肌、肝臟、牙齦等多個組織的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，1，25-（OH）2-D3能夠通過抗凋亡、抗炎、抗氧化等機制來減輕不同病理因素引起的組織和細(xì)胞損傷[10]。為了明確1，25-（OH）2-D3在腦梗死中的治療價值，本研究首先通過線栓法建立了腦梗死大鼠模型，通過觀察神經(jīng)功能評分及腦梗死面積發(fā)現(xiàn)：腦梗死組大鼠的神經(jīng)功能評分明顯升高、梗死腦體積達(dá)到（55.41±8.72）%。在成功建立腦梗死大鼠模型的基礎(chǔ)上給予1，25-（OH）2-D3干預(yù)并觀察到：干預(yù)組大鼠的神經(jīng)功能評分及腦梗死體積均明顯低于腦梗死組，提示1，25-（OH）2-D3能夠在腦梗死大鼠模型中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

線粒體途徑細(xì)胞凋亡的激活是腦梗死過程中介導(dǎo)神經(jīng)功能損害的重要病理環(huán)節(jié)[11]。Bax和Bcl-2是線粒體膜上調(diào)控線粒體途徑凋亡的分子，前者能夠形成細(xì)胞色素C的孔道，促進(jìn)線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C進(jìn)入胞漿并激活Caspase介導(dǎo)的級聯(lián)放大反應(yīng)，最終通過激活Caspase-3來引起細(xì)胞凋亡；后者能夠與Bax形成異源二聚體并阻礙細(xì)胞色素C的釋放，最終通過拮抗Caspase的級聯(lián)激活來抑制細(xì)胞凋亡[12]。本研究對腦梗死大鼠腦組織中線粒體途徑凋亡基因表達(dá)的分析顯示：腦梗死組大鼠腦組織中Bcl-2的表達(dá)量明顯降低，而Bax、Caspase-3的表達(dá)量明顯增多，提示腦梗死模型大鼠的腦組織中線粒體凋亡明顯增強。進(jìn)一步分析1，25-（OH）2-D3干預(yù)對腦梗死大鼠腦組織中線粒體凋亡的影響可知：干預(yù)組大鼠腦組織中Bcl-2的表達(dá)量明顯高于腦梗死組，Bax、Caspase-3的表達(dá)量明顯低于腦梗死組，提示1,25-（OH）2-D3干預(yù)能夠抑制腦梗死大鼠腦組織中的細(xì)胞凋亡。

Wnt/β-catenin通路是細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡的重要信號通路[13]。Wnt是該通路的上游信號分子，發(fā)生活化后能夠使細(xì)胞內(nèi)β-catenin、GSK-3β、APC、Axin形成的復(fù)合體發(fā)生解離，GSK-3β對β-catenin的水解作用減弱，進(jìn)而造成β-catenin在細(xì)胞漿中不斷堆積并逐步向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移；進(jìn)入細(xì)胞核的β-catenin能夠通過Tcf/Lef來調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2等基因的表達(dá)。本研究對Wnt/β-catenin通路的分析顯示，腦梗死組大鼠腦組織中β-catenin的表達(dá)量均明顯降低、GSK-3β的表達(dá)量明顯升高，而在使用1,25-（OH）2-D3干預(yù)后的干預(yù)組大鼠腦組織中β-catenin的表達(dá)量均明顯升高、GSK-3β的表達(dá)量明顯降低，提示W(wǎng)nt/β-catenin通路在腦梗死過程中受到抑制，1，25-（OH）2-D3干預(yù)能夠激活腦梗死組織中的Wnt/β-catenin通路，進(jìn)而通過該通路介導(dǎo)的促增殖及抗凋亡效應(yīng)來實現(xiàn)保護腦梗死大鼠神經(jīng)功能的目的。

綜上所述，1，25-（OH）2-D3用于腦梗死大鼠能夠改善神經(jīng)功能、減輕腦組織內(nèi)細(xì)胞凋亡，激活Wnt/β-catenin通路是其可能分子機制，為臨床上探尋腦梗死新的治療藥物提供了依據(jù)。