紫蘇粕和豆粕共發(fā)酵生產(chǎn)紫蘇醬的發(fā)酵條件研究

張昕，王彩蓉，呂源嘉，管玲玲

(吉林工商學(xué)院糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室，長春 130507)

紫蘇(PerillafrutescensL.)在中國的栽培歷史悠久，分布廣泛，屬唇形科，古名荏，又名青蘇、野蘇、桂芢、皺葉蘇、蘇麻等[1]，是傳統(tǒng)的藥食同源植物[2]。紫蘇籽冷榨紫蘇油后剩余的紫蘇粕中[3]，含有高達40%左右的蛋白質(zhì)，紫蘇蛋白中含有18種氨基酸，包括人體所必需的全部8種氨基酸，是一種較優(yōu)良的植物蛋白資源[4]。紫蘇粕中還有剩余的紫蘇油脂、多糖、纖維素和抗氧化物質(zhì)等[5-7]。目前國內(nèi)外重點研究和開發(fā)紫蘇油產(chǎn)品[8-12]，剩余大量的紫蘇粕尚未有效利用，造成資源的巨大浪費[13]。本文研究以紫蘇粕和豆粕為原料共同發(fā)酵生產(chǎn)紫蘇醬的發(fā)酵條件，研究成曲添加量、鹽水濃度、納豆芽孢桿菌接菌量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、攪拌醬醅速度、攪拌醬醅時間對紫蘇醬品質(zhì)的影響[14]，確定最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件[15]，為紫蘇粕資源的利用和風(fēng)味紫蘇醬的生產(chǎn)提供了基本研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇粕、豆粕：吉林省洮南市；食鹽：吉林省長春鹽業(yè)有限公司；高大毛霉M5.17(Mucormucedo)：吉林工商學(xué)院微生物實驗室從自然發(fā)酵的紫蘇粕中分離；納豆芽孢桿菌AS 1.107(Bacillusnatto)：吉林工商學(xué)院微生物實驗室購買菌種；化學(xué)試劑：國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純；水：自制純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

SQW-60D三清超微粉碎機 山東三清不繡鋼設(shè)備有限公司；BS 11OS型電子天平 西安賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；GR80TR型ZEALWAY自動壓力蒸汽滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司；GXZ-300光照培養(yǎng)箱 寧波樂電儀器制造有限公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇大地自動化儀器廠；Toppette移液槍 大龍醫(yī)療設(shè)備(上海)有限公司；C-MAG HS10磁力加熱攪拌器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 紫蘇醬發(fā)酵工藝流程

1.3.2 操作要點

菌種馴化培養(yǎng)：取紫蘇粕40 g，大豆粕60 g，面粉20 g，添加紅棗粉1 g作為生長因子，按100 g干曲料加水量100 mL浸泡8 h，pH值自然，溫度121 ℃的條件下進行滅菌處理25 min；制成紫蘇粕制曲培養(yǎng)基三角瓶；將高大毛霉M5.17斜面菌種按紫蘇粕制曲培養(yǎng)基質(zhì)量的5%轉(zhuǎn)接到三角瓶中，在溫度(29±1) ℃條件下培養(yǎng)120 h，制成紫蘇粕制曲培養(yǎng)基的三角瓶菌種[16]。

原料處理：精選出紫蘇粕和豆粕，通過超微粉碎機將紫蘇粕粉碎成粒徑80 μm的顆粒。按紫蘇粕和豆粕質(zhì)量比為2∶3的比例，100 g干料加水100 mL混勻浸泡8 h[17]。

滅菌：在高壓滅菌鍋中于121 ℃條件下滅菌25 min。

面粉：在滅菌后的紫蘇粕和豆粕的表面鋪上面粉保溫，質(zhì)量比為紫蘇粕∶豆粕∶面粉為2∶3∶1[18]。

接菌：將滅菌后的原料混勻，溫度29 ℃時，按接種量0.35%接種高大毛霉M5.17三角瓶菌種[19]。

制曲：在(29±1) ℃培養(yǎng)48 h制曲。

成曲：當培養(yǎng)室中的曲料長出大量菌絲，曲料呈灰白色，即為成曲[20]。

粉碎：取出成曲，用粉碎機粉碎。

加成曲：將粉碎后的成曲放入陶罐。

加食鹽水：配制鹽水，將鹽水煮沸后再冷卻，按照醬曲與鹽水的比例添加鹽水[21]。

前發(fā)酵：醬醅保溫發(fā)酵溫度39～45 ℃[22]。

攪拌醬醅：在醬醅靜止發(fā)酵5天以后，每隔12 h攪拌醬醅1次[23]。

補水：在發(fā)酵過程中間隔5天，每1000 mL醬醅中補加純凈水10 mL。

接種納豆芽孢桿菌：取納豆芽孢桿菌純種干粉1 g加入無菌生理鹽水100 mL，于41 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)5 h，在醬醅保溫發(fā)酵結(jié)束前5天接入納豆芽孢桿菌液體菌種。

后發(fā)酵：于41 ℃繼續(xù)保溫后酵5天即為成品。

1.3.3 氨基酸態(tài)氮的測定

檢測指標按GB 2718-2003《醬衛(wèi)生標準》的要求執(zhí)行。醬醅中氨基酸態(tài)氮的含量反映了紫蘇醬發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的水解程度，是發(fā)酵醬的一項主要指標，氨基酸態(tài)氮的測定采用GB/T 5009.39-2003規(guī)定的測定氨基酸態(tài)氮含量的甲醛值法。

2 結(jié)果與分析

2.1 成曲添加量對紫蘇醬醅中氨基酸態(tài)氮含量的影響實驗結(jié)果

準備陶罐，分別加入成曲200，220，240，260，280，300，320 g，每罐加入15 °Bé鹽水1000 mL，在納豆芽孢桿菌接菌量0.5%、攪拌醬醅速度60 r/min、攪拌醬醅時間25 min的條件下，在41 ℃的恒溫培養(yǎng)室中發(fā)酵紫蘇醬醅30天。測定醬醅氨基酸態(tài)氮的含量，結(jié)果見圖1。

圖1 成曲添加量對氨基酸態(tài)氮含量的影響實驗結(jié)果Fig.1 The experimental results of the effect of the additive amount of finished koji on amino acid nitrogen content

由圖1可知，每1000 mL鹽水中成曲添加量200～260 g，隨著成曲添加量的增加，氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加，在成曲添加量為260 g時，氨基酸態(tài)氮含量達到最高；在成曲添加量為260～300 g時，隨著成曲添加量的增加，氨基酸態(tài)氮含量逐漸下降。分析原因：成曲添加量少，醬醅中營養(yǎng)物質(zhì)含量較低，導(dǎo)致氨基酸含量較低；成曲添加量過高，紫蘇醬醅中營養(yǎng)物質(zhì)含量高，水分含量低，降低了分子的擴散性，蛋白質(zhì)水解不充分。通過優(yōu)化得到醬醅中氨基酸態(tài)氮含量較高的3個水平，即每1000 mL鹽水中成曲添加量分別為260，280，300 g。

2.2 鹽水濃度對紫蘇醬醅中氨基酸態(tài)氮含量的影響實驗結(jié)果

分別配制濃度為11，12，13，14，15，16，17 °Bé的鹽水，每罐中加入成曲質(zhì)量為260 g，分別添加不同濃度的鹽水1000 mL，其他同2.1。測定醬醅氨基酸態(tài)氮的含量，結(jié)果見圖2。

圖2 鹽水濃度對氨基酸態(tài)氮含量的影響實驗結(jié)果Fig.2 The experimental results of the effect of the brine concentration on amino acid nitrogen content

由圖2可知，在鹽水濃度為11～14 °Bé時，氨基酸態(tài)氮含量隨著鹽水濃度的增加而緩慢增加；在鹽水濃度為14 °Bé時，氨基酸態(tài)氮含量達到最高；在鹽水濃度為14～17 °Bé時，氨基酸態(tài)氮含量隨著鹽水濃度的增加而顯著減少。分析原因可能是鹽水濃度較低，不能充分抑制細菌、酵母菌等雜菌生長，導(dǎo)致醬醅中的氨基酸被雜菌利用或降解；但高濃度的鹽水又抑制了紫蘇醬醅中酶的活力。通過優(yōu)化得到醬醅中氨基酸態(tài)氮含量較高的3個水平，即鹽水濃度為13，14，15 °Bé。

2.3 納豆芽孢桿菌接菌量對紫蘇醬醅中氨基酸態(tài)氮含量的影響實驗結(jié)果

分別取14 °Bé鹽水1000 mL，納豆芽孢桿菌液體菌種接菌量與鹽水體積比為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%，其他同2.2。測定醬醅氨基酸態(tài)氮的含量，結(jié)果見圖3。

圖3 納豆芽孢桿菌接菌量對氨基酸態(tài)氮含量的影響實驗結(jié)果Fig.3 The experimental results of the effect of the inoculation amount of Bacillus natto on amino acid nitrogen content

由圖3可知，在納豆芽孢桿菌接菌量為0.1%～0.4%時，氨基酸態(tài)氮含量隨著納豆芽孢桿菌接菌量的增加而增加。當納豆芽孢桿菌接菌量為0.4%時，氨基酸態(tài)氮含量達到最高，之后隨著納豆芽孢桿菌接菌量的增加，氨基酸態(tài)氮的含量又逐漸減少。分析原因可能是納豆芽孢桿菌接菌量過高，納豆芽孢桿菌利用醬醅中氨基酸作為氮源物質(zhì)合成菌體蛋白。通過優(yōu)化得到醬醅中氨基酸態(tài)氮含量較高的3個水平，即納豆芽孢桿菌接菌量分別為0.3%、0.4%和0.5%。

2.4 發(fā)酵溫度對紫蘇醬醅中氨基酸態(tài)氮含量的影響實驗結(jié)果

分別取成曲質(zhì)量260 g，添加14 °Bé鹽水1000 mL，納豆芽孢桿菌接菌量與鹽水體積比為0.4%。在攪拌醬醅速度60 r/min、攪拌醬醅時間25 min的條件下，分別放到溫度為39，40，41，42，43，44，45 ℃的恒溫培養(yǎng)室中發(fā)酵紫蘇醬醅30天。測定醬醅氨基酸態(tài)氮的含量，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對氨基酸態(tài)氮含量的影響實驗結(jié)果Fig.4 The experimental results of the effect of the fermentation temperature on amino acid nitrogen content

由圖4可知，當發(fā)酵溫度為39～43 ℃時，氨基酸態(tài)氮含量隨著溫度的升高而升高；當發(fā)酵溫度為43 ℃時，氨基酸態(tài)氮含量達到最高；當發(fā)酵溫度為43～45 ℃時，氨基酸態(tài)氮含量隨著發(fā)酵溫度的升高而下降。分析原因：溫度是影響酶活力及酶促反應(yīng)速度的主要因素，發(fā)酵溫度43 ℃是毛霉蛋白酶催化蛋白質(zhì)水解為氨基酸的最適溫度，所產(chǎn)生的氨基酸態(tài)氮含量最高。通過優(yōu)化得到醬醅中氨基酸態(tài)氮含量較高的3個水平，即發(fā)酵溫度42，43，44 ℃。

2.5 發(fā)酵時間對紫蘇醬醅中氨基酸態(tài)氮含量的影響實驗結(jié)果

將恒溫培養(yǎng)室溫度設(shè)定為43 ℃，其他同2.4，分別培養(yǎng)5，10，15，20，25，30，35天。測定醬醅氨基酸態(tài)氮的含量，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，在發(fā)酵時間為5～25天時，氨基酸態(tài)氮含量隨著發(fā)酵時間的增加而增加。當發(fā)酵時間為25天時，氨基酸態(tài)氮含量達到最高。發(fā)酵時間為25～35天時，氨基酸態(tài)氮含量隨著發(fā)酵時間的增加而減少。分析原因：發(fā)酵時間短，紫蘇醬醅中的蛋白質(zhì)未完全水解成氨基酸；發(fā)酵時間過長，紫蘇醬醅中的各種酶催化氨基酸的降解以及與其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；當發(fā)酵時間為25天時，紫蘇醬發(fā)酵基本完成。通過優(yōu)化得到醬醅中氨基酸態(tài)氮含量較高的3個水平，即發(fā)酵時間為20，25，30天。

圖5 發(fā)酵時間對氨基酸態(tài)氮含量的影響實驗結(jié)果Fig.5 The experimental results of the effect of the fermentation time on amino acid nitrogen content

2.6 攪拌醬醅速度對紫蘇醬醅中氨基酸態(tài)氮含量的影響實驗結(jié)果

設(shè)定攪拌醬醅的速度分別為20，30，40，50，60，70，80 r/min，發(fā)酵時間25天，其他同2.5。測定醬醅氨基酸態(tài)氮的含量，結(jié)果見圖6。

圖6 攪拌醬醅速度對氨基酸態(tài)氮含量的影響實驗結(jié)果Fig.6 The experimental results of the effect of the stirring speed of bean sauce mash on amino acid nitrogen content

由圖6可知，在攪拌醬醅速度為20～50 r/min時，氨基酸態(tài)氮含量隨著攪拌醬醅速度的增加而增加。當攪拌醬醅速度為50 r/min時，氨基酸態(tài)氮含量達到最高。當攪拌醬醅速度為50～80 r/min時，氨基酸態(tài)氮含量隨著攪拌醬醅速度的增加而減少。分析原因可能是攪拌醬醅速度慢，醅料不能與酶充分混合和接觸，不能均勻發(fā)酵，醬醅中O2含量低影響了微生物的呼吸作用和氧化還原反應(yīng)，攪拌醬醅速度過快使醬醅中氣泡過多，影響醅料與酶充分混合和接觸。通過優(yōu)化得到醬醅中氨基酸態(tài)氮含量較高的3個水平，即攪拌醬醅速度為40，50，60 r/min。

2.7 攪拌醬醅時間對紫蘇醬醅中氨基酸態(tài)氮含量的影響實驗結(jié)果

設(shè)定攪拌醬醅速度為50 r/min，每12 h攪拌醬醅時間分別為5，10，15，20，25，30，35 min，其他同2.6。測定醬醅氨基酸態(tài)氮的含量，結(jié)果見圖7。

圖7 攪拌醬醅時間對氨基酸態(tài)氮含量的影響實驗結(jié)果Fig.7 The experimental results of the effect of the stirring time of bean sauce mash on amino acid nitrogen content

由圖7可知，在攪拌醬醅時間為5～30 min時，氨基酸態(tài)氮含量隨著攪拌醬醅時間的增加而增加。當攪拌醬醅時間為30 min時，氨基酸態(tài)氮含量達到最高。在攪拌醬醅時間為30～35 min時，氨基酸態(tài)氮含量隨著攪拌醬醅時間的增加而減少。分析原因可能是攪拌醬醅時間短，醅料不能與酶充分混合和接觸，不能均勻發(fā)酵，醬醅中O2含量低影響了微生物的呼吸作用和氧化還原反應(yīng)，攪拌醬醅時間過長使醬醅中氣泡過多，影響醅料與酶充分混合和接觸。通過優(yōu)化得到醬醅中氨基酸態(tài)氮含量較高的3個水平，即攪拌醬醅時間為25，30，35 min。

2.8 紫蘇醬發(fā)酵條件L18(37)正交試驗結(jié)果

以氨基酸態(tài)氮含量為評價指標，選擇成曲添加量、鹽水濃度、納豆芽孢桿菌接菌量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、攪拌醬醅速度、攪拌醬醅時間7個影響因素，從單因素試驗中選出氨基酸態(tài)氮含量較高的3個水平，采用L18(37)正交試驗設(shè)計，優(yōu)化紫蘇醬醅的發(fā)酵條件，結(jié)果見表1。

表1 紫蘇醬醅發(fā)酵條件正交試驗結(jié)果Table 1 The orthogonal test results of perilla sauce's fermentation conditions

續(xù) 表

由表1可知，各因素對發(fā)酵紫蘇醬醅中氨基酸態(tài)氮含量的影響大小為：A>D>E>F>C>G>B，即成曲添加量>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時間>攪拌醬醅速度>納豆芽孢桿菌接菌量>攪拌醬醅時間>鹽水濃度。最優(yōu)方案為A2B1C1D2E2F2G3，即紫蘇醬發(fā)酵的最優(yōu)方案為：1000 mL鹽水中成曲添加量280 g、鹽水濃度13 °Bé、納豆芽孢桿菌接菌量0.3%、發(fā)酵溫度43 ℃、發(fā)酵時間25天、攪拌醬醅速度50 r/min、攪拌醬醅時間35 min。在最優(yōu)條件下進行驗證試驗，發(fā)酵紫蘇醬醅中氨基酸態(tài)氮含量為0.69 g/dL。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗和L18(37)正交試驗對紫蘇醬發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到生產(chǎn)紫蘇醬的最優(yōu)發(fā)酵條件為：1000 mL鹽水中成曲添加量280 g、鹽水濃度13 °Bé、納豆芽孢桿菌接菌量0.3%、發(fā)酵溫度43 ℃、發(fā)酵時間25天、攪拌醬醅速度50 r/min、攪拌醬醅時間35 min。在最優(yōu)發(fā)酵條件下進行驗證試驗，發(fā)酵紫蘇醬醅中氨基酸態(tài)氮含量為0.69 g/dL，大于0.40 g/dL，符合國家標準。

紫蘇醬的感官指標與傳統(tǒng)醬相比，狀態(tài)微稠，顏色微深，具有紫蘇特有的香味和豆醬特有的鮮味，咸度適中，口感純正，符合國家標準。

以紫蘇粕為原料發(fā)酵生產(chǎn)紫蘇醬，既利用了紫蘇粕中的大量蛋白質(zhì)、多糖和剩余的紫蘇油脂，同時紫蘇粕特殊的營養(yǎng)成分、保健成分和風(fēng)味物質(zhì)也保留在醬中，實現(xiàn)了紫蘇粕的全營養(yǎng)利用，兼有傳統(tǒng)豆醬的營養(yǎng)成分與風(fēng)味，集調(diào)味、增香和保健為一體，本研究為利用紫蘇粕生產(chǎn)特殊風(fēng)味的紫蘇醬產(chǎn)品提供了基本研究數(shù)據(jù)。

本試驗運用正交試驗方法進行紫蘇粕和豆粕共發(fā)酵生產(chǎn)紫蘇醬的發(fā)酵條件優(yōu)化，和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法相比具有一定的局限性。下一步擬采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法進行優(yōu)化。